Kras突變和腫瘤生物學(xué)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了識別有發(fā)展癌癥風險的患者的方法，預(yù)測癌癥發(fā)病的方法，以及通過確定KRAS致癌基因內(nèi)存在或不存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其被稱為KRAS突變，來預(yù)測患者對化療／治療應(yīng)答的方法。
【專利說明】KRAS突變和腫瘤生物學(xué)
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請要求2011年3月21日提出的臨時申請USSN61 / 454，765 ;2011年3月21日提出的USSN61 / 454,767 ;和2011年3月21日提出的USSN61 / 454，769的優(yōu)先權(quán)，上述文獻中的全部內(nèi)容均作為一個整體在本發(fā)明中被引入作為參考。
[0003]以提述方式納入
[0004]以“34592-515001W0ST25.txt”為命名提交的文本文件的內(nèi)容，該文本文件于2012年3月16日創(chuàng)建，文件大小32.2KB，參考文獻均全文引入本文以供參考。
[0005]政府支持
[0006]本 發(fā)明中部分的實施，具有美國政府根據(jù)臨床與轉(zhuǎn)化科學(xué)獎(CTSA)，授權(quán)號為UL1RR024139的支持，其中CTSA由美國國立衛(wèi)生研究院分支國家研究資源中心所提供。
[0007]本發(fā)明是在美國政府支持下完成，部分支持下完成，得到美國國家癌癥研究所提供的授權(quán)號R01CA131301-01A1，美國國立衛(wèi)生研究院提供的授權(quán)號CA124484(K08)，美國國立衛(wèi)生研究院提供的授權(quán)號R01CA122728，美國國立衛(wèi)生研究院提供的授權(quán)號R01CA74415，美國國家癌癥研究所和美國國立衛(wèi)生研究院主任辦公室提供的授權(quán)號RC4CA153828 的支持。
[0008]政府在本發(fā)明中享有一定的權(quán)利。
發(fā)明領(lǐng)域
[0009]本發(fā)明通常涉及癌癥、生殖健康和分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了通過確定遺傳標記的存在或不存在，診斷和預(yù)測主體患有癌癥的方法。此外，本發(fā)明提供了通過確定遺傳標記的存在或不存在，確定患者對治療的反映的方法。
【背景技術(shù)】
[0010]變動風險因子、患者治療的反應(yīng)和結(jié)果反映癌癥的異質(zhì)性。雖然預(yù)測基因表達標志物是高度非同源，幾個模塊如DNA修復(fù)缺陷，免疫應(yīng)答標記或者上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變通常與許多腫瘤相關(guān)。因此，在本領(lǐng)域中，有必要識別這些轉(zhuǎn)錄模塊的啟動子，成為發(fā)現(xiàn)特異性個性化治療的一種有前途的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]在本發(fā)明中提出的研究，涉及到核心的問題是miRNAs在癌癥中的作用:干擾miRNAs調(diào)控致致癌基因或腫瘤抑制基因影響患癌癥的風險、腫瘤的發(fā)展，以及治療響應(yīng)。MiRNAs可能直接或間接調(diào)控致致癌基因或腫瘤抑制基因。舉例來說，KRAS基因突變，單核苷酸多態(tài)性(SNP)位于KRAS基因3' UTR的let_7互補位6 (LCS6)，通過miRNA let-7家族的調(diào)控干擾KRAS。在這種情況下，KRAS基因let-7介導(dǎo)調(diào)節(jié)被阻斷；然而，也有KRAS基因突變的次級效應(yīng)。let-7 / KRAS互動上游的阻斷持續(xù)向下游因子發(fā)送異常信號。此外，信號途徑而非經(jīng)典RAS途徑的組成受到影響。KRAS變體的存在，增加了血管生成、存活(甚至在缺氧條件下)、轉(zhuǎn)移，以及對常用化療藥物的抗藥性。此外，癌癥細胞的表觀遺傳改變，如腫瘤抑制基因啟動子甲基化和細胞周期基因的改變，影響了 KRAS突變陽性的癌細胞的發(fā)展、存活和治療應(yīng)答。最后，KRAS基因突變的細胞后果是與KRAS其他突變無關(guān)，包括，舉例來說，KRAS基因編碼區(qū)的突變。對于許多癌細胞，KRAS基因突變的發(fā)生與其它KRAS基因突變的發(fā)生是相互排斥的。不像KRAS突變，KRAS基因突變是一種種系突變。因此，KRAS基因變體是一種腫瘤細胞生物學(xué)的遺傳性生物標志物。
[0012]KRAS基因突變突變的發(fā)生導(dǎo)致KRAS基因表達增加和/或高豐度KRAS，導(dǎo)致miRNAs let-7家族表達降低。KRAS突變也影響轉(zhuǎn)錄因子，以及miRNAs而非let_7家族miRNAs的表達水平。舉例來說，KRAS突變與miR-23和miR-27表達水平增加統(tǒng)計學(xué)上顯著性相關(guān)聯(lián)，miR-23和miR-27靶向抗血管生成基因如Sprouty2和Sema6A。因此，傳統(tǒng)的化療藥物的效果差和耐藥性可能源自KRAS基因突變通過RAS通路驅(qū)動激活細胞增殖的能力，通過血管生成通路，血液和養(yǎng)分補給腫瘤，促進腫瘤內(nèi)癌細胞的生存。面對具有一種共同激活因子的兩個異常通路，某些化療藥物活性可能不足以對抗癌癥的發(fā)展。攜帶KRAS突變的腫瘤內(nèi)RAS和其它通路腫瘤的擾動在癌細胞和腫瘤類型間有高度同源性(如乳腺癌和卵巢癌)。[0013]KRAS基因突變與各種癌癥臨床治療效果不佳有關(guān)，這些癌癥包括，但不限于，結(jié)腸癌、卵巢癌、頭頸部癌、肺癌。有證據(jù)表明，KRAS基因突變決定一名患者對治療的響應(yīng)。如果KRAS基因突變攜帶者對標準化療藥劑耐藥，那么患者的結(jié)果較差。本文提出的數(shù)據(jù)證實，KRAS基因突變對傳統(tǒng)化療藥物耐藥，而有時對單克隆抗體療法的敏感性增加。舉例來說，當西妥昔單抗作為唯一的治療方法給藥時，KRAS突變增加了患者對西妥昔單抗的敏感性，靶向KRAS通路(EGFR)上游調(diào)控因子。因此，KRAS基因突變的發(fā)生可能表明，特異性靶向KRAS基因上游的藥物將會成功，然而，靶向細胞周期檢查點的傳統(tǒng)化療藥物可能是無效的，細胞周期檢查點是KRAS基因的下游。同樣，KRAS基因突變對鉬類化療具有耐藥性。鉬類藥劑交聯(lián)DNA分子，以防止DNA復(fù)制，最終導(dǎo)致細胞凋亡。然而，DNA復(fù)制發(fā)生在KRAS活化下游，并且因此，可能是無效的，尤其根據(jù)數(shù)據(jù)顯示信號通路募集而非RAS基因。
[0014]本文提供的這些KRAS腫瘤生物學(xué)的新發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床價值，因為化療作為一種治療方法對患者是很辛苦的?；熕幬锏母弊饔?，不僅增加了患者的不適，而且?guī)砹松眢w機能系統(tǒng)并發(fā)癥。例如，殺死癌細胞的化療藥物也可能損害或削弱患者的心臟。因此，KRAS基因突變是確定對已知化療藥物的耐藥性或者敏感性的一種生物標志物。如果患者呈KRAS突變陽性，那么醫(yī)生可能會選擇一個最佳的治療方案，或者至少避免無效治療。
[0015]在本發(fā)明中，術(shù)語主體和患者可以互換使用。
[0016]本發(fā)明提供了一種預(yù)測腫瘤的血管生成風險增加的方法，包括(a)檢測第一位患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，包括LCS6位點4處尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)向鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)變，及(b)確定miRNA表達水平，miRNA選自由第二位患者樣本中miR-23和miR-27組成的組，其中與對照組對t匕，所述的(a)中突變的存在和(b)中miRNA表達水平的增加表明抗血管生成基因轉(zhuǎn)錄基因靜默增加，從而預(yù)測腫瘤血管形成風險增加。第一位和第二位患者樣本中提取自同一患者。此外，第一位和第二位患者樣本可能包括相同的流體、組織或活檢。優(yōu)選地，第二位患者樣本提取自或源自腫瘤或與腫瘤物理接觸的非腫瘤組織中的區(qū)域(例如，腫瘤周圍)。舉例來說，抗血管生成基因可以是Spix)Uty2或Sema6A。腫瘤可能包括一種癌細胞，癌細胞源自艾滋病相關(guān)的癌癥、乳癌、消化/胃腸道的癌癥、肛門癌、闌尾癌、膽管細胞癌、結(jié)腸癌、大腸癌、食道癌、膽囊癌、胰島細胞瘤、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、肝癌、胰臟癌、直腸癌、小腸癌、胃癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、腎上腺皮質(zhì)癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、甲狀腺癌、眼癌、眼內(nèi)黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、膀胱癌、腎(腎細胞)癌、陰莖癌、前列腺癌、移行細胞腎盂和輸尿管癌、睪丸癌、尿道癌、腎母細胞瘤、其他兒童腎臟腫瘤、生殖細胞癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、卵巢生殖細胞腫瘤、婦科腫瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、卵巢癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、頭部和頸部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隱匿性原發(fā)性轉(zhuǎn)移性鱗狀頸部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻竇和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤、胃腸道間質(zhì)腫瘤(GIST)、骨肉瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤、橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腦腫瘤、星形細胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、中央神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣/橫紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎性腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)生殖細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、脊髓腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和松果體母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、呼吸系統(tǒng)癌、胸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、惡性間皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮膚癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、Merkel細胞癌?？蛇x地，或另外地，腫瘤或癌癥是轉(zhuǎn)移性的。
[0017]本發(fā)明提供了一種預(yù)測缺氧條件下癌癥細胞增加的存活或增殖的方法，包括(a)檢測第一位患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，及(b)確定第二位患者樣本中miR-210miRNA的表達水平，其中與對照組對比，所述的(a)中突變的存在和(b)中miRNA表達水平的增加預(yù)測缺氧條件下癌癥細胞存活或增殖的增加。第一位和第二位患者樣本中提取自同一位患者。此外，第一位和第二位患者樣本可能包括相同的流體、組織或活檢。癌細胞可能源自于艾滋病相關(guān)的癌癥、乳癌、消化/胃腸道的癌癥、肛門癌、闌尾癌、膽管細胞癌、結(jié)腸癌、大腸癌、食道癌、膽囊癌、胰島細胞瘤、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、肝癌、胰臟癌、直腸癌、小腸癌、胃癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、腎上腺皮質(zhì)癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、甲狀腺癌、眼癌、眼內(nèi)黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、膀胱癌、腎癌腎細胞癌、陰莖癌、前列腺癌、過渡細胞腎盂和輸尿管癌、睪丸癌、尿道癌、腎母細胞瘤、其他兒童腎臟腫瘤、生殖 細胞癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、卵巢生殖細胞腫瘤、婦科腫瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、卵巢癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、頭頸部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隱匿性原發(fā)性轉(zhuǎn)移性鱗狀頸部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻竇和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、骨肉瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤、橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、神經(jīng)癌、腦腫瘤、星形細胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣/橫紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)生殖細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、脊髓腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和松果體母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、呼吸系統(tǒng)癌、胸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、惡性間皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮膚癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、Merkel細胞癌。
[0018]本發(fā)明提供了一種預(yù)測癌癥細胞存活或增殖增加的方法，包括(a)檢測第一位患者樣本中人KRAS基因的let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，及
(b)確定第二位患者樣本中腫瘤抑制基因啟動子的甲基化狀態(tài)，其中與對照組對比，所述的(a)中突變的存在和啟動子(b)甲基化增加預(yù)測腫瘤細胞的存活或增殖。第一位和第二位患者樣本中提取自同一位患者。此外,第一位和第二位患者樣本可包括相同的流體、組織或活檢。任選地，腫瘤抑制基因是Notchl。存活可能包括保持致瘤潛能。癌細胞可能源自于艾滋病相關(guān)的癌癥、乳癌、消化系統(tǒng)癌/胃腸道、肛門癌、闌尾癌、膽管細胞癌、結(jié)腸癌、大腸癌、食道癌、膽囊癌、胰島細胞瘤、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、肝癌、胰臟癌、直腸癌、小腸癌、胃癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、腎上腺皮質(zhì)癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、甲狀腺癌、眼癌、眼內(nèi)黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、膀胱癌、腎癌腎細胞癌、陰莖癌、前列腺癌、過渡細胞腎盂和輸尿管癌、睪丸癌、尿道癌、腎母細胞瘤、其他兒童腎臟腫瘤、生殖細胞癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、卵巢生殖細胞腫瘤、婦科腫瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、卵巢癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、頭頸部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隱匿性原發(fā)性轉(zhuǎn)移性鱗狀頸部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻竇和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、骨肉瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤、橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、神經(jīng)癌、腦腫瘤、星形細胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣/橫 紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)生殖細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、脊髓腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和松果體母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、呼吸系統(tǒng)癌、胸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、惡性間皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮膚癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、Merkel細胞癌。任選地，所述癌細胞是癌干細胞。
[0019]乳腺癌
[0020]本發(fā)明提供了用于識別可能發(fā)展侵略性和高風險乳腺癌風險的患者的方法，以及預(yù)測這些形式乳腺癌發(fā)病的方法。本文提供的數(shù)據(jù)構(gòu)成了第一個公開內(nèi)容驅(qū)動乳腺癌腫瘤發(fā)展的基因組突變機制，其特征在于缺乏雌激素受體或孕激素受體表達。在優(yōu)選的實施方案中，侵略性和高風險形式的乳腺癌是三陰性乳腺癌，其進一步特征在于缺乏人表皮生長因子受體2(HER2)基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)的表達。
[0021]本發(fā)明提供了一種識別可能發(fā)展雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)陰性(ER /PR陰性)乳腺癌風險的患者的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述突變的存在，表明有發(fā)展ER / PR陰性乳腺癌的更大風險。
[0022]本發(fā)明提供一種對有發(fā)展乳腺癌風險的患者預(yù)測其雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)陰性(ER / PR陰性)乳腺癌發(fā)病的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因的let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，包括LCS6位點4處尿嘧啶⑶或胸腺嘧啶⑴向鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)變，其中所述突變的存在，表明ER / PR陰性乳腺癌的更早發(fā)病。
[0023]本文所描述的方法的一個優(yōu)選的實施方案中，ER / PR陰性乳腺癌也是HER2陰性，因此，是一種三陰性乳腺癌(TNBC)。三陰性乳腺癌(TNBC)可能是基底或luminal型或腫瘤。這些方法的某些方面，三陰性乳腺癌(TNBC)是一種基底腫瘤，表達一種轉(zhuǎn)錄子或者表皮生長因子受體(EGFR)或細胞角蛋白5 / 6(CK5 / 6)基因編碼的蛋白質(zhì)。在其它方面，ER / PR陰性乳腺癌或ER / PR / HER2陰性乳腺癌進一步特征在于低表達或陰性表達的乳腺癌I (BRCAl)基因。
[0024]主體(患者)優(yōu)選絕經(jīng)前女性；然而，主體可以是任何年齡?；蛘?，另外，主體小于51歲，然而，主體可任選地，小于100歲、90歲、80歲、70歲、60歲、50歲、40歲、30歲、20歲，或者位于其間的任何年齡。
[0025]大腸癌
[0026]本發(fā)明提供一種預(yù)測患有大腸癌(CRC)主體的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中，與對照組對比，所述的KRAS基因突變的存在表明存活率增加。本方法的一個方面中，所述檢測步驟進一步包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)分析。KRAS基因突變是大腸癌細胞和患者存活的獨立標志物；然而，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)分析可以用作二次分析。雖然MSI是在CRC患者預(yù)測良好的分子標志物(例如，患有MSI腫瘤的患者被認為有一個良好的預(yù)測)，確定KRAS基因突變狀態(tài)，表明患有MSI腫瘤，但KRAS基因突變陰性(或者，換句話說，野生型)的個體大腸癌的預(yù)測較差。因此，本發(fā)明提供一種預(yù)測臨床結(jié)果，或大腸癌預(yù)測的優(yōu)越方法，尤其大腸癌患者癌癥階段分層時。
[0027]尤其在在該方法的實施方案中，大腸癌(CRC)是早期階段大腸癌。優(yōu)選的，大腸癌(CRC)是I期或2期。
[0028]測驗主體可以具有KRAS基因二次突變，KRAS基因突變?yōu)橐淮瓮蛔儭?br> [0029]測試主體或?qū)φ战M主體BRAF基因攜帶一個或多個突變?？蛇x地，或另外地，測試主體或?qū)φ战M主體可能具有高甲基化RASSF1A啟動子。
[0030]對照組主體不攜帶KRAS基因突變(例如，對照組主體是野生型KRAS基因突變突變)。然而，對照組主體可能患有大腸癌，或可能是無癌癥個體。此外，對照組主體KRAS基因可能具有二次突變，不是KRAS基因突變。
[0031]在該方法的某些方面中，患者的生存率是一個總生存率(例如，一些實施例，包括，但不限于，從癌癥發(fā)展，或診斷直至主體死于癌癥(死亡)，進入緩解期，或醫(yī)生宣布主體被治愈或所有腫瘤細胞清除掉，計算出存活率)，5年生存率或一年生存率。計算出更短的生存期，例如，從癌癥發(fā)展或者癌癥診斷計算，直到一個確定性時間，如I年或5年。
[0032]卵巢癌治療應(yīng)答
[0033]本發(fā)明提供了患有上皮性卵巢癌(EOC)患者的預(yù)測方法，此外，提供了通過預(yù)測患者對鉬類化療應(yīng)答優(yōu)化治療的方法。本文所描述的方法和數(shù)據(jù)識別KRAS基因3'非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)let-7miRNA結(jié)合位特異性基因組突變(稱作為KRAS變體)。
[0034]本發(fā)明提供一種患有卵巢上皮癌(EOC)患者預(yù)測的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，包括LCS6位點4尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)向鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)變，其中，與對照組對比時，所述的KRAS基因突變的存在表明存活率降低。
[0035]雖然該方法可以應(yīng)用于患者和所有年齡的婦女，在此方法的某些實施方案中，測試主體是絕經(jīng)后或52歲或52歲以上的老年人。對照組主體包括健康個體和那些患有卵巢上皮癌(EOC)，但不攜帶KRAS基因突變的婦女。此外，根據(jù)作為測試主體同一年出生女性，或者作為測試患者的同一代的女性的預(yù)期生存，對照組主體是全國平均水平。在一個優(yōu)選的實施方案中，對照值不包括那些攜帶KRAS基因突變的個體。在該方法的某些方面中，患者生存率是總生存率(例如，一些實施例，包括，但不限于，從癌癥發(fā)展，或診斷直至主體死于癌癥(死亡)，進入緩解期，或醫(yī)生宣布主體被治愈或所有腫瘤細胞清除掉，計算出存活率)，5年生存率或一年生存率。計算出更短的生存期，例如，從癌癥發(fā)展或者癌癥診斷計算，直到確定性時間，如I年或5年。
[0036]本發(fā)明還提供了一種預(yù)測卵巢上皮性癌(EOC)細胞鉬類化療響應(yīng)的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述突變的存在表明鉬類化療耐藥性。卵巢上皮性癌細胞可以在體外或離體評價。當卵巢上皮性癌細胞體外評估時，該細胞取自主體。主體可以是任何年齡的，然而，在一個優(yōu)選實施方案中，患者可以是絕經(jīng)后的，或至少52歲?；蛘撸谕粋€實施方案中，患者至少30歲、35歲、40歲、45歲、50歲、55歲、60歲、65歲、70歲、75歲，或在兩者之間的任何年齡。在這種方法的其他方面，由于二次醫(yī)療條件或醫(yī)療，患者不是絕經(jīng)后，提出了一個類似的激素水平。示范性，但非限制性更年期荷爾蒙水平包括下降水平的雌激素和孕激素，例如，主體血液或尿液樣本評估所確定。誘發(fā)絕經(jīng)期激素水平的示范性、但非限制性的二次醫(yī)療條件是至少一次卵巢外科切除手術(shù)(卵巢切除術(shù)，也被稱為手術(shù)絕經(jīng))，子宮頸癌、子宮癌或卵巢癌必須進行子宮切除術(shù)(尤其是，如果切除子宮結(jié)合輸卵管和一側(cè)或兩側(cè)卵巢切除)。誘發(fā)絕經(jīng)期激素水平的示范性、但非限制性的、二次醫(yī)療條件是化療和抗雌激素治療。
[0037]當卵巢上皮性癌細胞在體外進行評估時，細胞分離、復(fù)制，或來自BG1、CA0V3、或IGR-OVl細胞株。這些細胞株是卵巢癌細胞株的非限制性實施例。卵巢上皮性癌細胞進行分離，復(fù)制，或來自任何卵巢癌的細胞株，包括，但不限于，這些攜帶KRAS基因突變、有害BRCAl基因突變，有害BRCA2基因突變，或其任意組合的細胞株。有害BRCAl或BRCA2基因突變是增加其攜帶者將發(fā)展成癌癥的風險或可能性的突變，在優(yōu)選的實施方案中，發(fā)展成乳腺癌或卵巢癌。有害BRCA l或BRCA2基因突變也是增加其年齡小攜帶者發(fā)展成癌癥的風險或可能性的突變(例如，經(jīng)歷癌癥早期發(fā)病)，在優(yōu)選的實施方案中，癌癥是乳腺癌或卵巢癌。
[0038]本文所描述的方法，優(yōu)選的鉬類化療是卡鉬或紫杉醇，然而，鉬類化療包括所有化療藥物，鉬或鉬鹽用于治療或預(yù)防癌癥。這些方法某些方面中，鉬類化療是輔助治療。因此，本文所述的方法預(yù)測患者采用作為單一療法或者與其它已知抗癌藥劑或技術(shù)(例如，舉例來說，放療和外科手術(shù))聯(lián)合治療的鉬類化療的響應(yīng)。
[0039]大腸癌的治療響應(yīng)
[0040]本發(fā)明提供了患有大腸癌(CRC)或轉(zhuǎn)移性大腸癌(mCRC)的預(yù)測方法，此外，提供了通過預(yù)測患者進行單獨單克隆抗體治療，或者單獨單克隆抗體治療聯(lián)合細胞毒性化療的響應(yīng)而優(yōu)化治療的方法。本文所描述的方法和數(shù)據(jù)識別了 KRAS基因3,非翻譯區(qū)(UTR)let-7miRNA結(jié)合位點特異性基因組突變，稱作為KRAS突變。
[0041]本發(fā)明提供一種患有早期大腸癌(CRC)的測試主體預(yù)測的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6突變，其中所述突變是一種一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中與對照組主體或者患有晚期大腸癌(包括，舉例來說，III期、IV期，和轉(zhuǎn)移性大腸癌)的主體對比，所述突變的存在顯示存活率增加。 [0042]本發(fā)明提供一種患有晚期大腸癌(CRC)患者預(yù)測的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6突變，其中所述突變是一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，包括LCS6位點4尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)向鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)變，其中與對照組主體或者患有早期大腸癌的主體對比，所述KRAS-突變的存在顯示存活率降低。晚期大腸癌包括，舉例來說，III期、IV期,和轉(zhuǎn)移性大腸癌。
[0043]本發(fā)明提供一種預(yù)測癌細胞進行單克隆抗體單藥治療的響應(yīng)的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6突變，其中所述突變是一種一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述突變的存在，表明對單克隆抗體單藥治療的敏感性。在本方法的某些實施方案中，癌細胞是大腸癌(CRC)細胞。癌細胞可以在體外或離體進行評價。單克隆抗體單藥治療的一個非限制性的實施例是西妥昔單抗。
[0044]本發(fā)明提供一種預(yù)測腫瘤細胞對化療聯(lián)合單克隆抗體治療的響應(yīng)的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6突變，其中所述突變是一種一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述突變的存在，表明對聯(lián)合治療的耐藥性。在本方法的某些實施方案中，癌細胞是大腸癌(CRC)細胞。癌細胞可以在體外或離體進行評價。單克隆抗體單藥治療的一個非限制性實施例是西妥昔單抗?；熆赡苁羌毎拘詣?。細胞毒性劑的一個非限制性實施例是伊立替康。在某些實施例中，使用化學(xué)治療劑(例如，伊立替康)治療攜帶KRAS基因突變的主體導(dǎo)致KRAS基因突變表達增加。KRAS基因突變和非突變癌細胞接觸伊立替康后，對比報告基因表達時，發(fā)現(xiàn)野生型3' UTR報告基因沒有變化。然而，發(fā)現(xiàn)野生型3' UTR報告基因表達有統(tǒng)計學(xué)顯著性增加(圖24A和圖24B)。該數(shù)據(jù)表明，伊立替康接觸以激活KRAS基因突變等位基因的方式改變細胞背景。
[0045]盡管該方法可以適用于所有年齡段的患者，在這種方法某些實施方案中，測試主體新生兒、兒童、成人，或年長者(65歲或以上)。主體可能為絕經(jīng)前的或絕經(jīng)后的(年齡在52歲或以上)。
[0046]對照組或?qū)φ罩黧w包括健康人和那些患有大腸癌，但不攜帶KRAS基因突變的個體。此外，根據(jù)作為測試主體同一年出生女性，或者作為測試主體的同一代的女性的期望生存率，對照組主體是全國平均水平。在一個優(yōu)選的實施方案中，對照值不包括那些攜帶KRAS基因突變的個體。在該方法的某些方面中，患者生存率是總生存率(例如，一些實施例，包括，但不限于，從癌癥發(fā)展，或診斷直至主體死于癌癥(死亡)，進入緩解期，或醫(yī)生宣布主體被治愈或所有腫瘤細胞清除掉，計算出存活率)，5年生存率或一年生存期。計算出更短的生存期，例如，從癌癥發(fā)展或者癌癥診斷計算，直到一個確定性時間，如I年或5年。
[0047]本發(fā)明還提供了一種預(yù)測大腸癌(CRC)細胞對單克隆抗體治療響應(yīng)的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6突變，其中所述突變是一種一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述突變的存在，表明對單克隆抗體治療的敏感性增加。大腸癌細胞可以在體外或離體進行評價。單克隆抗體治療可以是西妥昔單抗。[0048]本發(fā)明還提供了一種預(yù)測大腸癌(CRC)細胞對細胞毒性化療的響應(yīng)的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6突變，其中所述突變是一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)，包括LCS6位點4尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)向鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)變，其中所述突變的存在，表示對細胞毒性化療耐藥。在此方法的某些實施方案中，大腸癌在體外或離體進行評價。細胞毒性化療可能是伊立替康化療。在此方法的一個實施方案中，細胞毒性化療是一種聯(lián)合治療，包括單克隆抗體治療。單克隆抗體治療可能是西妥昔單抗。
[0049]當大腸癌細胞體外評估時，該細胞取自患者?；颊呖梢允侨魏文挲g段的。在這種方法的某些實施方案中，患者至少30歲、35歲、40歲、45歲、50歲、55歲、60歲、65歲、70歲、75歲，或兩者之間的任何年齡。
[0050]當大腸癌細胞體外評估時，細胞可能被分離、復(fù)制，或者取自已建立的細胞株，包括NC1-60培養(yǎng)板內(nèi)的結(jié)腸或大腸癌細胞株。大腸癌細胞可以分離、復(fù)制，或取自任何結(jié)腸或大腸癌細胞株，包括，但并不限于，攜帶KRAS基因突變，單獨或與KRAS基因或其他基因內(nèi)二次突變或者另外突變聯(lián)合的細胞株。
[0051]對于該方法，優(yōu)選的單克隆抗體單藥治療是西妥昔單抗，然而，單克隆抗體單藥治療包括任何用于治療或預(yù)防癌癥的單克隆抗體。優(yōu)選地，所述單克隆抗體是部分或完全人的或人源化的。對于此方法，優(yōu)選的化療是細胞毒性化療，如伊立替康，然而，化療包括任何用于治療或預(yù)防癌癥的化療劑。在此方法的某些方面中，化療或細胞毒性化療是一種輔助治療。因此，該方法預(yù)測患者采用作為單一療法或與化療劑或用于治療或預(yù)防癌癥的其它已知技術(shù)聯(lián)合治療的單克隆抗體(例如，放療和外科手術(shù))的響應(yīng)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1A-B是一對圖表，描繪KRAS突變在研究組2的所有婦女㈧和絕經(jīng)前(≤51歲)婦女(B)乳腺癌亞型中的分布。數(shù)據(jù)為確診為乳腺癌亞型病例數(shù)/測試KRAS突變的患者數(shù)。*P=0.044vs所有其他亞型。P=0.033vs所有其他亞型。
[0053]圖2A-B是一對箱線圖，描繪三陰性乳腺癌KRAS基因突變陽性和KRAS基因突變陰性中BRCAl基因表達。Y軸是任意單位。(A)BRCAl基因探針I(yè)，p=0.06。(B)BRCAl基因探針 2，p=0.01。
[0054]圖3是一系列的箱線圖，描繪三陰性乳腺癌KRAS基因突變陽性與KRAS基因突變陰性病例中microRNA let_7家族表達。Y軸是任意單位。
[0055]圖4是熱點圖，顯示UMMA模型分析得到的三陰性乳腺癌患者KRAS基因突變差異表達基因。50個最顯著性基因被用于進行聚類；聚類P〈0.0001。KRAS基因突變樣本是深灰色；野生型樣品為淺灰色。白色有未知KRAS突變狀態(tài)。
[0056]圖5是描繪ER / PR+與ER / PR-絕經(jīng)前乳腺癌患者KRAS基因突變的圖表。
[0057]圖6是描繪三陰性乳腺癌患者腫瘤KRAS基因突變相關(guān)的基因表達譜的一系列箱線圖。
[0058]圖7是一個曲線圖，顯示KRAS突變預(yù)測52歲以上絕經(jīng)后卵巢癌患者顯著性總存活率較差。采用Kaplan-Meier分析，對比具有KRAS基因突變的卵巢癌患者(n=59)與無KRAS基因突變的卵巢癌患者(n=220)的總生存率。log-rank檢驗結(jié)果是52歲以上KRAS基因突變陽性上皮性卵巢癌患者顯著性較差(P=0.0399)。[0059]圖8是顯示KRAS基因突變與新輔助化療后不理想腫瘤細胞減滅術(shù)相關(guān)的圖表。攜帶KRAS基因突變(n=26)或無KRAS基因突變(n=90)的卵巢癌患者(n=116)中對比新輔助化療后的腫瘤細胞減滅術(shù)。經(jīng)X 2分析，KRAS基因突變患者比非突變患者顯著性更可能使不理想腫瘤細胞減滅術(shù)具有更大的殘留病變(RD) (P=0.044)。
[0060]圖9A是KRAS基因突變(KV)三陰性乳腺癌腫瘤(TNBC KRAS簽名)中50個差異表達候選基因簽名，KRAS基因突變上皮性卵巢癌樣本比非突變樣本表現(xiàn)出更高分數(shù)。
[0061]圖9B是對KRAS基因上癮的腫瘤(KRAS成癮標簽)相關(guān)的基因標簽，在KRAS基因突變上皮性卵巢癌腫瘤上調(diào)。
[0062]圖9C是KRAS基因突變上皮性卵巢癌腫瘤前20個基因差異表達標簽，反映卡鉬敏感和卡鉬耐藥上皮性卵巢癌細胞基因差異表達的重新分析。
[0063]圖9D是KRAS基因突變(深灰色)和非突變(淺灰色)腫瘤樣本之間前部差異表達基因的熱點圖。顏色鍵描繪出藍色(O到5)到白色(約5)，由白色轉(zhuǎn)為紅色(5至10)的差異表達基因譜。此熱點圖彩色版本，參見Ratner ES, et al.0ncogene, (5December2011),1-8 ;其內(nèi)容通過引述合并入本文中)。[0064]圖10是顯示KRAS基因突變與細胞株卡鉬和卡鉬/紫杉醇化療耐藥性有關(guān)的圖表。攜帶KRAS基因突變(BGl)細胞株和無KRAS基因突變(CA0V3)細胞株經(jīng)化療治療，半數(shù)抑制濃度(IC50)為Y軸，X軸為化療藥劑。更高的IC50表示對化療藥劑耐藥性。BGl=KRAS基因突變/ BRCA基因野生型細胞株；CA0V3=非突變/ BRCA野生型細胞株；IGR-OVI =KRAS-突變/ BRCAl突變細胞株。誤差線是預(yù)測相對誤差。
[0065]圖1lA是顯示KRAS基因突變細胞株細胞存活率降低的圖表，BGl (*p〈0.001)，對非突變細胞株，CA0V3，無影響。攜帶KRAS突變(BGl)和無KRAS突變(CA0V3)的細胞株，進行siRNA / miRNA聯(lián)合治療，選擇性結(jié)合變體等位基因。
[0066]圖1lB是顯示BGl (右)KRAS蛋白表達減少與細胞存活率減少一致的圖表，對CA0V3(左)沒有影響。攜帶(BGl)KRAS突變和無(CA0V3)KRAS突變的細胞株，進行siRNA /miRNA聯(lián)合治療，選擇性結(jié)合突變等位基因。不同的siRNA用數(shù)字標出。
[0067]圖12是一個圖表，與非突變細胞株(CA0V3)對比，描繪攜帶KRAS基因突變(BG_1和IGR0V1)的細胞株具有顯著性較低水平let_7b。單因素Anovea和Tukey’s多重比較檢驗進行統(tǒng)計分析。
[0068]圖13A-B示意性描繪KRAS-突變序列與非突變序列比對。Panel A描繪KRAS基因非突變序列。Panel B描繪靶向KRAS基因突變序列的示范性突變siRNA寡核苷酸。在兩個Panel中，帶下劃線序列描述了 let_7結(jié)合位點。在兩個Panel中,框起來的核苷酸是指野生型(非突變)核苷酸(A)或KRAS基因突變單核苷酸多態(tài)性(SNP) (B)0 siRNA顯示起始于其31末端。
[0069]圖14是所有癌癥階段中KRAS基因突變和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲線。
[0070]圖15A是早期(I期和II期)大腸癌KRAS基因突變和特定病因生存期的Kaplan-Meier 曲線。
[0071]圖15B是III期大腸癌KRAS基因突變和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲線。
[0072]圖15C是IV期大腸癌KRAS基因突變和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲線。
[0073]圖16A是早期(I期和II期)大腸癌KRAS基因突變、KRAS突變和特定病因生存期的 Kaplan-Meier 曲線，P=0.875。
[0074]圖16B是III期大腸癌KRAS基因突變、KRAS突變和特定病因生存期的Kaplan-Meier 曲線。
[0075]圖16C是IV期大腸癌KRAS基因突變、KRAS突變和特定病因生存期的Kaplan-Meier 曲線。
[0076]圖17是早期(I期和II期)大腸癌KRAS基因突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)和特定病因生存期的Kaplan-Meier曲線。
[0077]圖18A是一個曲線圖，描繪抗表皮生長因子受體單克隆抗體單藥治療或與聯(lián)合化療作為搶救治療的患者KRAS LCS6基因型狀態(tài)的中位無進展生存期。
[0078]圖18B是一個曲線圖，描繪抗表皮生長因子受體單克隆抗體單藥治療或與聯(lián)合化療作為搶救治療的患者KRAS LCS6基因型狀態(tài)中位總生存期。
[0079]圖19A是一個曲線圖，描繪抗表皮生長因子受體單克隆抗體單藥治療的所有患者KRAS LCS6基因型狀態(tài)的中位無進展生存期。
[0080]圖19B是一個曲線圖，描繪抗表皮生長因子受體單克隆抗體基聯(lián)合化療作為搶救治療的所有患者KRAS LCS6基因型狀態(tài)的中位無進展生存期。
[0081]圖19C是描繪根據(jù)所有KRAS突變攜帶者治療類型的中位無進展生存期的曲線圖。
[0082]圖19D是描繪根據(jù)所有無KRAS基因突變攜帶者治療類型的中位無進展生存期的曲線圖。
[0083]圖20A是一個曲線圖，描繪根據(jù)抗表皮生長因子受體單克隆抗體單藥治療作為搶救治療的雙(KRAS和BRAF)野生型患者群KRAS LCS6基因型狀態(tài)的中位無進展生存期。
[0084]圖20B是一個曲線圖，描繪根據(jù)抗表皮生長因子受體單克隆抗體基聯(lián)合化療作為搶救治療的雙(KRAS和BRAF)野生型患者群KRAS LCS6基因型狀態(tài)的中位無進展生存期。
[0085]圖20C是一個曲線圖，描繪根據(jù)雙(KRAS和BRAF)野生型KRAS基因突變攜帶者治療類型的中位無進展存活率。
[0086]圖20D是一個曲線圖，描繪根據(jù)雙(KRAS和BRAF)野生型非KRAS突變攜帶者治療類型的中位無進展存活率。
[0087]圖21A是一個曲線圖，根據(jù)抗表皮生長因子受體單克隆抗體單藥治療搶救治療的所有患者中KRAS LCS6的基因型狀態(tài)的中位總存活率。
[0088]圖21B是一個曲線圖，描繪根據(jù)基于抗表皮生長因子受體單克隆抗體的聯(lián)合化療搶救治療的所有患者中KRAS LCS6的基因型狀態(tài)的中位總存活率。
[0089]圖21C是描繪根據(jù)所有KRAS突變攜帶者治療類型的中位總存活率的曲線圖。
[0090]圖21D是描繪根據(jù)所有無KRAS基因突變攜帶者的治療類型的中位總存活率的曲線圖。
[0091]圖22A是一個曲線圖，描繪根據(jù)抗表皮生長因子受體單克隆抗體單藥治療作為搶救治療的雙(KRAS和BRAF)野生型患者群KRAS LCS6基因型狀態(tài)的中位總存活率。
[0092]圖22B是一個曲線圖，描繪根據(jù)抗表皮生長因子受體單克隆抗體單藥治療作為搶救治療的雙(KRAS和BRAF)野生型患者群中KRAS LCS6基因型狀態(tài)的中位總存活率。
[0093]圖22C是一個曲線圖，描繪根據(jù)雙(KRAS和BRAF)野生型KRAS基因突變攜帶者治療類型的中位總存活率。[0094]圖22D是一個曲線圖，描繪根據(jù)雙(KRAS和BRAF)野生型非KRAS基因突變攜帶者治療類型的中位總存活率。
[0095]圖23A是一個曲線圖，描繪根據(jù)KRAS和BRAF突變KRAS基因突變攜帶者治療類型的中位無進展生存期。
[0096]圖23B是一個曲線圖，描繪根據(jù)KRAS和BRAF突變非KRAS基因突變攜帶者治療類型的中位無進展生存期。
[0097]圖23C是一個曲線圖，描繪根據(jù)KRAS和BRAF突變非KRAS基因突變攜帶者治療類型的中位總存活率。
[0098]圖23D是一個曲線圖，描繪根據(jù)KRAS和BRAF突變非KRAS突變攜帶者治療類型的中位總存活率。
[0099]圖24A是一個曲線圖，描繪經(jīng)過化療藥物伊立替康治療后，野生型KRAS和KRAS突變癌細胞內(nèi)歸一化熒光素酶表達。
[0100]圖24A是一個曲線圖，描繪了當癌癥細胞采用伊立替康治療時，倍數(shù)回歸與(表示為KRAS基因突變型/ KRAS野生型)伊立替康濃度的關(guān)系函數(shù)。
【具體實施方式】
[0101]與癌癥相關(guān)的KRAS原 致癌基因(rs61764370W UTR內(nèi)let_7microRNA互補位功能性變體先前被確定(國際專利申請?zhí)朠CT / US2008 / 065302，其全部內(nèi)容通過引述合并入本文中)。本文描述了突變與腫瘤生物學(xué)相關(guān)性的研究。
[0102]乳腺癌
[0103]乳腺腫瘤分為ER(雌激素)和/或PR(孕激素)受體陽性，HER2(Her2 / neu /ERBB2)擴增，三陰性腫瘤(例如，ER / PR陰性和HER2陰性)(Serlie T，et al.Proc NatlAcad Sci USA2001 ;98:10869-74)?；虮磉_和受體分析，進一步將乳腺癌分為四個生物亞群:luminal A腫瘤(ER-和/或PR-受體陽性，HER-2陰性)，luminal B (ER-和/或PR-受體陽性，HER2陽性)，HER-2陽性(HER2-陽性，ER / PR陰性)和基底樣腫瘤(ER /PR / HER2-陰性，也被稱為三陰性乳腺癌(TNBC)) ( Serlie T，et al.Proc Natl Acad SciUSA2001 ；98:10869-74)。
[0104]對比其他亞型，三陰性乳腺癌(TNBC)是最具攻擊性子類，具有5年特定病因生存期(HaOty BG et al.J Clin 0ncol2006 ;24:5652-57)。近期轉(zhuǎn)錄表達譜研究表明三陰乳腺癌腫瘤異質(zhì)性，這些腫瘤可分為兩大亞群；表達EGFR或角蛋白(CK)5 / 6的ER / PR /HER2(三)陰性腫瘤，因此，被稱為‘基底樣’，不表達EGFR或CK5 / 6的ER / PR / HER2(三)陰性腫瘤?；讟尤幮?TN)腫瘤特征在于，比非基底樣形式和低表達BRCAl (乳腺癌)發(fā)病年齡早(低齡)；基底樣細胞表型是BRCAl基因突變攜帶者中常見的(Rakha EA andEllis 10.Pathology2009 ;41:40-47)。異常 luminal 型前體細胞群(其可能是 ER 陽性)是BRCA-1相關(guān)的基底樣腫瘤轉(zhuǎn)化的靶標(Lim E，et al.Nat Med2009 ；15:907-13)。雖然預(yù)測基因表達標志物是高度同源的，幾個模塊，如DNA修復(fù)缺陷，免疫應(yīng)答標記，或者上皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變通常在這些腫瘤子集(Bild AH, et al.Breast Cancer Res2009 ；11:R55)。識別這些轉(zhuǎn)錄模塊的啟動子是發(fā)現(xiàn)特異性、個性化治療的一種方法。
[0105]三陰性乳腺癌表型與年輕發(fā)病的相關(guān)性，和已知風險或生殖因素缺乏相關(guān)性(Yang XR, et al.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev2007 ； 16:439-43),表明這種癌癥發(fā)展有遺傳風險(Bauer KR et al.Cancer2007 ; 109:1721-28)。本發(fā)明之前，不存在這種風險增加的遺傳標志物。盡管BRCAl基因突變往往與三陰性腫瘤相關(guān)，這些突變是罕見的，占患有三陰性乳腺癌患者僅10%至15%，取決于種族背景和家族病史(Young SR,et al.BMCCancer2009 ；9:86 ；Nanda R, et al.JAMA2005 ；294: 1925-33)。
[0106]本文提供的研究在來自美國康涅狄格州415例病理證實乳腺癌患者和457位對照組(研究組I)中確定KRAS基因突變的頻率分布，以及在攜帶已知雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、HER2狀態(tài)的690名愛爾蘭婦女和和360名對照者(研究組2)中確定這種突變與乳腺癌亞型的相關(guān)性。研究組I和2的數(shù)據(jù)匯集140名三陰性乳腺癌婦女患者和113名對照者，評估KRAS基因突變與三陰性乳腺癌風險，以及三陰性乳腺癌患者全基因組mRNA和特異性miRNA表達的相關(guān)性。
[0107]雖然研究組IKRAS基因突變的頻率分布在所有基因型個體中無差異，對比201名絕經(jīng)前對照者中27例(13% ) (P=0.015)，患有ER / PR-陰性癌癥的24名絕經(jīng)前婦女中8例(33% )具有KRAS突變。研究組2中，對比478例luminal A乳腺癌中占64例(13% )，87例luminal B乳腺癌中占13例(15% ), 35例HER2陽性亞群中占2例(6% ), KRAS突變在三陰性乳腺癌婦女中顯著性富集(90例中占19例[21% ]) (P值=0.044)。合并研究組的多因素分析顯示，KRAS基因突變與絕經(jīng)前婦女三陰性乳腺癌相關(guān)(比值比2.307,95%CIl.261-4.219，P=0.0067)。三陰性乳腺癌腫瘤基因表達分析表明，KRAS基因突變陽性腫瘤顯著性改變基因表達，富集luminal型前體和BRCAl缺乏標簽。MiRNA分析暗示KRAS基因突變腫瘤中l(wèi)et-7miRNA種類的水平降低。
[0108]KRAS基因突變是絕經(jīng)前婦女發(fā)生三陰性乳腺癌的一種遺傳標志物。細胞基因和miRNA表達標簽啟動三陰性 乳腺癌患者的分子和生物分層。
[0109]大腸癌
[0110]KRAS基因突變是一種早期大腸癌(CRC)預(yù)測標志物。此外，KRAS基因突變誘導(dǎo)更高水平的KRAS基因致癌蛋白和較低水平的腫瘤抑制劑lethal-7 (let-7)miRNA。大型、前瞻性荷蘭隊列研究(NLCS)的409例早期(I期和II期)、182例III期和69例IV期病例中對KRAS基因突變的影響進行了研究。攜帶KRAS突變的早期患者有一個更好的預(yù)測，尤其是那些還攜帶其它KRAS突變。這一發(fā)現(xiàn)與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性或其他預(yù)測因素無關(guān)。此外，通過荷蘭隊列研究(NLCS)的1，886例亞隊列成員的數(shù)據(jù)，KRAS基因突變對直腸癌風險的影響也進行了研究。G等位基因(例如，KRAS突變等位基因)與發(fā)展直腸癌的可能性不相關(guān)，但G等位基因富集在晚期直腸癌中，這表明它可能預(yù)測更晚期的疾病。由于本研究人群僅是未經(jīng)治療人群的分析，這些結(jié)果提供了一個關(guān)于攜帶KRAS基因突變大腸癌的自然生物學(xué)的新見解。
[0111]由于本文所給出的數(shù)據(jù)證明，KRAS基因突變是指導(dǎo)早期階段患者治療決策的一種新的大腸癌(CRC)生物標志物。攜帶KRAS突變早期大腸癌病例有更好的結(jié)果，然而，在疾病晚期，不再有更好的結(jié)果。對于早期患者，KRAS基因突變基因型聯(lián)合至少一個KRAS突變的也是治療決策要考慮的更好治療結(jié)果的預(yù)測標志物。
[0112]盡管診斷和治療的創(chuàng)新，大腸癌(CRC)仍然是西方世界癌癥死亡的第二大原因。腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(TNM)是目前提供預(yù)測信息的標準工具。腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是對兩極(早期和晚期大腸癌)預(yù)測具有高度預(yù)測性，但對于中間階段具有低的預(yù)測性。根據(jù)目前指導(dǎo)方針，沒有給予早期患者輔助化療(例如，T1-3-N0-M0，按國際抗癌聯(lián)盟TNM)。在早期患者組中(例如，T1-3-N0-M0)的五年生存率大于70%。盡管如此，20%-30%的早期患者(I期和II期)將在5年內(nèi)死于大腸癌，如果這些患者提前確診，進行相應(yīng)治療，引發(fā)這些死亡能否被避免的問題。此前，眾多研究已經(jīng)發(fā)表，聲稱分子標志物的預(yù)測影響。與這些先前報告的斷言相反，這些研究結(jié)果是不一致的。因此，在本文所述方法形成之前，分子改變影響預(yù)測的問題仍然沒有得到解決(Smits KM, et al.Pharmacogenomics.2008 ；9(12):1903-16)。
[0113]MicroRNAs (miRNA),已被確定為癌癥發(fā)生和發(fā)展的重要因素。有證據(jù)表明，單個miRNA 可以同時調(diào)節(jié)很多 mRNAs (Paranjape T, et al.Gut.2009 ;58 (11):1546-54)。此外，miRNA可以起到腫瘤抑制基因和致致癌基因的作用(Johnson SM，et al.Cell.2005 ；120(5):635-47)。miRNAs lethal-7 家族(let-7)是第一個被發(fā)現(xiàn)的 miRNA 家族中的一個。在許多癌癥中，let-7家族miRNA的表達被改變。舉例來說，在肺癌中，let_7低表達(Calin GA, et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2004 ； 101 (9):2999-3004 ;Takamizawa J,et al.Cancer Res.2004 ；64 (11):3753-6), let_7 過度表達抑制細胞體外生長(TakamizawaJ, et al.Cancer Res.2004 ；64(11):3753-6)并且抑制細胞體內(nèi)生長(Kumar MS, etal.Proc Natl Acad Sci U S A.2008 ； 105 (10):3903-8 ；EsqueIa-Kerscher A, et al.CellCycle.2008 ;7 (6):759-64)，這提示let_7miRNA可能起到腫瘤抑制劑的作用(Johnson SM，et al.Cell.2005 ；120(5):635-47)。
[0114]在結(jié)腸癌細胞中，與非癌旁組織對比，腫瘤組織中l(wèi)et-7的表達顯著性降低(AkaoY, et al.Biol Pharm Bull.2006 ；29(5):903-6)。此外，let-7 表達增加，let-7a-lmiRNA前體細胞轉(zhuǎn)染后RAS表達下降,這提示let_7參與調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞的生長(AkaoY, et al.Biol Pharm Bull.2006 ；29 (5):903-6)。
[0115]結(jié)合靶mRNA3'非翻譯區(qū)(UTR)互補元素，MiRNA可以控制基因表達。結(jié)合KRAS基因mRNA3’ -UTR特異性位點后，let_7誘導(dǎo)RAS下調(diào)。KRAS基因突變影響let_7介導(dǎo)調(diào)控KRAS基因表達。與野生型對比，突變G等位基因(例如，KRAS突變)的發(fā)生導(dǎo)致更高的KRAS基因水平和較低的let-7的水平。中度吸煙者中，G-等位基因攜帶者具有增加肺癌的風險，增加卵巢癌的風險(特別是絕經(jīng)后的婦女)，患乳腺癌的危險性增加(尤其是，三陰性乳腺癌亞型)，降低口腔癌的存活，但不降低肺癌生存。KRAS / BRAF突變的大腸癌，G等位基因攜帶者(KRAS基因突變攜帶者)顯示后期大腸癌存活減少，以及對西妥昔單抗的不同應(yīng)答，證實KRAS基因突變在結(jié)腸癌中的作用。因為KRAS突變基因型在早期大腸癌中的作用未解決，這里給出的實驗和數(shù)據(jù)，評估了荷蘭隊列研究(NLCS) 409例早期(I期和II期腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；Τ1-4, NO, MO)，182 例 III 期(Τ1-4，NI, MO)和 69 例 IV 期(Τ1-4，Ν0-1，Ml)大腸癌病例預(yù)測的影響。利用荷蘭隊列研究(NLCS)的1，886例亞隊列成員的數(shù)據(jù)，KRAS突變基因型對大腸癌風險的影響也進行了評估。
[0116]這項研究結(jié)果表明，KRAS基因3’UTR LCS6T>G突變影響早期(I期和II期)大腸癌的預(yù)測。KRAS基因突變存在于16.4%的病例中，而僅在世界人口中的6%被發(fā)現(xiàn)(ChinLJ, et al.Cancer Res2008 ;68:8535-40)，而 12%至 15% 的歐洲人中被發(fā)現(xiàn)(Ratner E，etal.Cancer Res2010 ；70:6509-15)。在晚期病例中發(fā)現(xiàn)KRAS突變(G-等位基因)頻率增加(分別為患者早期14%，III期19.2%，和IV期21.4% )，與先前報道的III期頻率具有可比性(Graziano F, et al.Pharmacogenomics J2010 ;10:458_64)。在 18%的亞隊列成員中發(fā)現(xiàn)G等位基因(KRAS突變)。發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變和晚期結(jié)腸癌增加之間具有統(tǒng)計學(xué)顯著性相關(guān)性，提供了關(guān)于KRAS基因突變攜帶者結(jié)腸癌自然生物學(xué)的有價值見解。此外，發(fā)現(xiàn)攜帶KRAS突變的早期大腸癌病例存活統(tǒng)計學(xué)顯著性增加，KRAS基因突變的患者中，攜帶G等位基因(KRAS突變)的早期階段患者沒有死于大腸癌。攜帶KRAS突變的早期大腸癌病例存活的統(tǒng)計學(xué)顯著性增加與其它預(yù)測因素無關(guān)，如腫瘤分化或錯位。由于T4腫瘤在早期病例中是罕見的，因為觀察到更壞結(jié)果的原因，KRAS野生型中的更高頻率的IIb期病例被排除。雖然結(jié)果表明，KRAS基因突變(G等位基因)和KRAS突變的三期病例預(yù)測較差，在III期或IV期未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)顯著性影響。此外，KRAS基因突變(G等位基因)對大腸癌風險的影響進行了研究。發(fā)現(xiàn)早期大腸癌風險降低，但對晚期大腸癌的風險沒有影響，這表明G等位基因(KRAS突變)與發(fā)展大腸癌的更高可能性無關(guān)。[0117]在以前的研究中，KRAS突變與預(yù)測較差有相關(guān)性。然而，關(guān)于這一主題的結(jié)果不一致，而且，與這些結(jié)果的臨床意義尚不清楚(Smits KM, et al.Pharmacogenomics2008 ；9:1903-16)。KRAS突變與KRAS基因突變不同，這是先天性的突變，因此，對腫瘤的發(fā)展、生物學(xué)、和預(yù)測有不同的影響。
[0118]KRAS突變與早期大腸癌生存率提高有關(guān)聯(lián)的發(fā)現(xiàn)是引起人們的興趣。此前研究表明，細胞衰老可以由致癌Ras的過度表達引發(fā)，可能有助于癌前病變或良性腫瘤生長停止(Mooi WJ and Peeper DS.N Engl J Med2006 ;355:1037-46)。人類癌癥中腫瘤細胞衰老已被報道。癌前結(jié)腸腺瘤也顯示衰老的特征(Collado M and Serrano M.Nat RevCancer2010 ;10:51-7)。致癌基因誘導(dǎo)的衰老可能僅在癌前病變發(fā)揮作用。然而，KRAS基因的生理水平可在沒有轉(zhuǎn)錄因子腎母細胞瘤I (WTl)的情況下誘導(dǎo)衰老(Vicent S,et al.JClin Invest2010 ；120:3940-52)。如果KRAS基因高表達的肺癌患者WTl相關(guān)基因的表達減少，他們有一個良好的預(yù)測(Vicent S，et al.J Clin Invest2010 ;120:3940-52)?？傊?，這些結(jié)果意味著其他分子因素可參與細胞命運的決定中，致致癌基因誘導(dǎo)的衰老可以發(fā)生在其他遺傳或表觀遺傳目標異常表達之后。致致癌基因誘導(dǎo)的衰老也可以在大腸癌發(fā)揮作用:在KRAS基因-LCS6基因型可能導(dǎo)致晚期腫瘤，或早期腫瘤，早期腫瘤具有基于被影響的另一遺傳(表觀遺傳)標志物的較好預(yù)測。
[0119]這兩者都參與了 Ras信號通路，攜帶KRAS突變和BRAF突變或RASSF1A甲基化的早期(I期和II期)病例發(fā)現(xiàn)更好的結(jié)果。BRAF相關(guān)的衰老以前報道發(fā)生在黑色素瘤中(Michaloglou C，et al.Nature2005 ；436:720-4)，但還沒有被證實 RASSF1A 在致致癌基因誘導(dǎo)的衰老中可能發(fā)揮的作用。如文中描述的研究人群中，KRAS基因突變與BRAF突變和/或RASSF1A高甲基化同時存在是不常見的，因此，沒有達到統(tǒng)計學(xué)意義。將這些遺傳(表觀遺傳)事件結(jié)合時，KRAS基因突變(G-等位基因)和KRAS、BRAF、或RASSFIA交替組合更加增強患者更好的結(jié)果。因此，由于KRAS突變(G等位基因)Ras過度表達，結(jié)合Ras通路基因(表觀遺傳)遺傳突變，可誘導(dǎo)早期大腸癌的衰老，從而影響存活。對于晚期病例，越來越多的分子通路受到影響，影響預(yù)測。
[0120]miRNA let_7家族證實，對比野生型(13)，KRAS基因突變存在的情況下，腫瘤生長抑制，let-7表達降低，KRAS水平增加。因此，預(yù)期攜帶KRAS基因突變的患者有較差的預(yù)測，如所示，例如，口腔癌(Christensen BC, et al.Carcinogenesis2009 ；30:1003-7)。對于大腸癌，有兩個報告研究KRAS基因型對患者治療效果的影響(GrazianoF, et al.Pharmacogenomics J2010 ; 10:458-64 ;Zhang w et al.Ann 0ncol2011 ；22:104-9)。第一個報道，攜帶KRAS基因突變的一小群伊立替康耐藥患者采用伊立替康和西妥昔單抗治療，存活率差，以及存在KRAS突變和沒有BRAF突變的相關(guān)性(Graziano F，etal.Pharmacogenomics J2010 ；10:458-64),然而，由于患者未經(jīng)治療,這些研究發(fā)現(xiàn)在這項研究中可能不會被重復(fù)。第二個報道，轉(zhuǎn)移性大腸癌單獨采用西妥昔單抗治療有更好的響應(yīng)，攜帶KRAS基因突變沒有KRAS突變的患者生存期長，但響應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義(Zhang w etal.Ann 0ncol2011 ;22:104-9)。本文提出的數(shù)據(jù)證實IV期KRAS基因突變攜帶者預(yù)測較好，雖然對比無統(tǒng)計學(xué)顯著性，這可能解釋為IV期患者組規(guī)模小。其他研究使用生殖細胞組織評估KRAS基因型，然而，本文描述的研究使用腫瘤DNA評估KRAS基因型。正常組織和腫瘤組織的基因型與KRAS基因突變是相同的得到證實。
[0121]對比晚期大腸癌，早期和晚期大腸癌看似不和諧的結(jié)果提出了一些關(guān)于不同癌癥階段腫瘤起源和進展的問題，是否早期大腸癌能夠通過分子不同通路發(fā)展。KRAS基因突變是晚期疾病中比較常見的，然而，早期診斷攜帶KRAS突變的患者似乎有一個更有利的結(jié)果。因此，這些數(shù)據(jù)提示，與晚期病例對比，早期階段的不同生物學(xué)。即使早期KRAS野生型患者有一個微衛(wèi)星不穩(wěn)定性腫瘤，他們預(yù)測較差的發(fā)現(xiàn)，可能表明，這些患者將受益于另外的輔助治療。需要進一步研究，包括隨機臨床試驗，以評估是否這些預(yù)測較差的早期患者將受益于另外的輔助治療。在發(fā)現(xiàn)生物標志物與本文所述的方法之前，微衛(wèi)星不穩(wěn)定性已經(jīng)被認為是預(yù)測良好的標志物(Boland CR and Goel A.Gastroenterology2010 ；138:2073-87.e3)然而，這項研究的數(shù)據(jù)證實KRAS突變等位基因攜帶者更好的結(jié)果與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)無關(guān)。
[0122]文中提到的早期大腸癌病例KRAS突變的影響分析，證實攜帶KRAS突變的早期G等位基因(KRAS突變)攜帶者有一個更好的結(jié)果。本研究中人群僅是通常未經(jīng)治療的人群，第一次，這項研究中所收集的數(shù)據(jù)提供了對攜帶KRAS基因突變的早期大腸癌的自然生物學(xué)的有價值見解。因此，本文所提出的證據(jù)是第一個指出KRAS突變基因型是早期大腸癌可能的預(yù)測標志物，可以用來識別預(yù)測良好的大腸癌患者。
[0123]治療應(yīng)答
[0124]卵巢癌
[0125]上皮性卵巢癌(EOC)是美國第二個最常見的女性盆腔生殖器官癌癥，在西方世界此類死亡率最高。這是美國女性癌癥死亡的第五位主要原因，每年有13，850名婦女死于這種疾病。盡管有多種新的治療方法，上皮性卵巢癌的高死亡率多年維持不變，5年生存期只有 30-39% (Parmar MK, et al.(2003).Lancet361:2099-2106)。
[0126]目前采用的治療 上皮性卵巢癌的標準化療方案是卡鉬和紫杉醇(PfistererJ，etal.(2006).J Clin 0ncol24:4699-4707),基于前瞻性隨機試驗(Herzog T and PothuriB.(2006).Nat Clin Pract Onco13:604-611 ；EsqueIa-Kerscher A and Slack F.(2006).Nat Rev Cancer6:259-269 ；1rio M, et al.(2007).Cancer Res67:8699-8707)。有些患者雖然最初對鉬類化療有耐藥性(統(tǒng)稱為“鉬類耐藥^ )，治療6個月內(nèi)復(fù)發(fā)，這是給所有上皮性卵巢癌患者的一線治療。更好地理解上皮性卵巢癌腫瘤基本生物學(xué)差異，可以解釋上皮性卵巢癌患者中鉬耐藥將會選擇一個更合理的治療方法(Parmar MK, et al.(2003).Lancet361:2099-2106 ；Pf isterer J, et al.(2006).J Clin Oncol24:4699-4707 ；HerzogT and Pothuri B.(2006).Nat Clin Pract Onco13:604-611)。 [0127]MicroRNAs (miRNA)是一類22個核苷酸非編碼RNA，在幾乎所有類型的癌癥中異常表達，它們可以作為一類新的致癌基因或腫瘤抑制基因。上皮性卵巢癌，除了從惡性卵巢組織中區(qū)分正常卵巢組織之外(1rio M, et al.(2007).Cancer Res67:8699-8707 ；Zhang L, et al.(2008).Proc Natl Acad Sci USA105:7004-7009)，miRNA 表達模式顯示對上皮性卵巢癌發(fā)病是重要的(.Int J Biochem Cell Biol42:1262-1272 ；van JaarsveldM, et al.(2010).1nt J Biochem Cell Biol42:1282-1290)，與上皮性卵巢癌患者結(jié)果改變(Eitan R, et al.(2009).Gynecol 0ncolll4:253-259)和治療應(yīng)答有關(guān)聯(lián)(Lu L, etal.(2011).Gynecol 0ncoll22:366-371)。miRNA表達差異也與上皮性卵巢癌化療和鉬耐藥有關(guān)聯(lián)(Eitan R, et al.(2009).Gynecol 0ncolll4:253-259 ；Lu L, et al.(2011).Gynecol 0ncoll22:366-371 ；Chen K, et al.(2008).Carcinogenesis29:1306-1311)。
[0128]miRNAs在癌癥中的重要性的其它見解來自于遺傳性的單核苷酸多態(tài)性(SNP)的發(fā)現(xiàn)，干擾 miRNA 的編碼序列(Chin LJ, et al.(2008).Cancer Res68:8535-8540)和miRNA原致癌基因3 '非翻譯區(qū)(3 iUTRs)的結(jié)合位點(Chen K，et al.(2008).Carcinogenesis29:1306-1311 ；Chin LJ, et al.(2008)。這種功能性突變的實施例是rs61764370，統(tǒng)稱為KRAS基因突變，位于在中的let_7miRNA互補位KRAS基因3’ UTR0曾報道rs61764370和上皮卵巢癌(EOC)的風險之間的關(guān)聯(lián)(參見，國際專利申請?zhí)朠CT /US2008 / 065302和國際專利申請?zhí)朠CT / US2010 / 023412，其全部內(nèi)容通過引述各自合并于本文中)。此外，提供的方法和實施例證明，這種突變是上皮性卵巢癌(EOC)臨床結(jié)果和化療耐藥的一種生物標志物。證據(jù)支持腫瘤KRAS突變連續(xù)功能作用，與惡性腫瘤生物學(xué)和癌癥較差結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)性。
[0129]本文所評估了有害BRCA突變存在和不存在的情況下，KRAS基因突變作為大腸癌結(jié)果生物標志物的潛力。而且，研究鉬類新輔助化療的響應(yīng)證實KRAS基因突變大腸癌患者結(jié)果改變的潛在原因，評估了鉬類耐藥并且評估了大腸癌腫瘤基因表達。這些數(shù)據(jù)表明，直接靶向功能獲得性KRAS基因突變可能減少具有這種病變的上皮性卵巢癌細胞株中細胞生長和存活。
[0130]KRAS基因突變是患有上皮性卵巢癌的絕經(jīng)后婦女(52歲以上)預(yù)測較差的生物標志物。KRAS突變相關(guān)的卵巢癌的預(yù)測不良是由于，至少部分由于KRAS基因突變與鉬類化療耐藥的關(guān)聯(lián)性，基于鉬類新輔助化療的更糟糕的響應(yīng)，輔助治療的攜帶KRAS基因突變的上皮性卵巢癌患者具有統(tǒng)計學(xué)顯著性增加的鉬類耐藥性。
[0131]KRAS基因突變上皮性卵巢癌和非突變上皮性卵巢癌腫瘤之間的生物學(xué)差異得到基因表達數(shù)據(jù)支持，表明，KRAS基因突變-相關(guān)聯(lián)的上皮性卵巢癌中KRAS成癮和AKT-介導(dǎo)鉬類耐藥。與非突變細胞株對比，進一步證實攜帶KRAS基因突變的卵巢癌細胞株體外鉬類耐藥性。通過直接靶向這種突變，KRAS突變相關(guān)上皮性卵巢癌對KRAS突變生殖病變連續(xù)依賴性的證據(jù)表明，導(dǎo)致顯著抑制KRAS基因突變上皮性卵巢癌細胞株與非突變上皮性卵巢癌細胞株內(nèi)腫瘤生長和細胞存活。
[0132]KRAS突變與絕經(jīng)后婦女生存率不佳的關(guān)聯(lián)性可能是由于與這種突變相關(guān)的基礎(chǔ)生物學(xué)。支持關(guān)聯(lián)性反映基礎(chǔ)生物學(xué)的假說，KRAS突變與絕經(jīng)后卵巢癌相關(guān)聯(lián)(Ratner
E,et al.(2010).Cancer Resl5:6509-6515)，平均診斷年齡近59歲。相對生存率隨年齡變化，診斷為上皮性卵巢癌的老年婦女5年之內(nèi)死亡率可能為年輕婦女的兩倍，進一步支持這一假設(shè)的是絕經(jīng)后的婦女可能具有生物學(xué)不同的腫瘤(ACS(2010).Cancerfacts&figures2010.Cancer Facts&Figures.ACS:Atlanta, GA, PP1-56)。此外，KRAS 基因突變已被證明是絕經(jīng)前婦女(年齡〈52歲)患三陰乳腺癌風險的一種生物標志物。因此，KRAS基因突變在患癌風險中的作用與不同組織中生物學(xué)可能依賴于響應(yīng)于生理條件的miRNA表達改變，如絕經(jīng)。KRAS基因突變婦女患乳腺癌的風險可能是第一位，然后，可能有發(fā)展成絕經(jīng)后卵巢癌的風險。
[0133]KRAS突變并不能預(yù)測一組攜帶已知有害BRCA基因突變的上皮性卵巢癌患者預(yù)測較差的發(fā)現(xiàn)，可能解釋為因為BRCA基因突變與鉬類敏感性相關(guān)聯(lián)。BRCA基因突變與鉬類敏感性相關(guān)的后果可能發(fā)生KRAS基因突變導(dǎo)致或加劇鉬類藥物耐藥。這可能是本文研究的年輕患者，可能有未見文檔的有害BRCA基因突變。或者，此外，研究中提供的年輕患者，也可能患有其他亞型的更常見于年輕婦女的卵巢癌，如交界性腫瘤，導(dǎo)致這些患者誤診。雖然本文提供的數(shù)據(jù)進行了廣泛的臨床注解，沒有得到我們所有的上皮性卵巢癌患者BRCA狀態(tài)，雖然病理報告可用，腫瘤組織無法獲得重新審查。最近的一項研究未能找到KRAS突變與預(yù)測不良的關(guān)聯(lián)性和用于全基因組關(guān)聯(lián)研究的卵巢上皮性卵巢癌治療的耐藥，該研究具有非常有限的臨床信息，例如，如BRCA狀態(tài)和卵巢癌特異性存活的因素無法獲得,也不包括在其分析中(Pharoah P, et al.(2011).Clin Cancer Resl7:3742-3750)。
[0134]兩種不同類型的KRAS基因突變相關(guān)腫瘤中發(fā)現(xiàn)類似的基因錯誤表達，表明這些腫瘤，無論組織來源，在腫瘤發(fā)生時使用類似的通路。直接靶向KRAS基因突變相關(guān)的上皮性卵巢癌細胞株中KRAS基因突變病變導(dǎo)致顯著性增強的細胞死亡，并減少KRAS水平。這些發(fā)現(xiàn)表明，KRAS基因突變腫瘤對單一、非編碼生殖病變的連續(xù)重度依賴。雖然通過測量腫瘤基因表達，并確定腫瘤突變 ，一直顯著性努力定制癌癥治療，即便有，很少有生殖細胞突變，先前已被證明是癌癥治療的重要靶標。
[0135]根據(jù)本文所提供的數(shù)據(jù)，確定卵巢癌中重要的KRAS基因突變是一種功能性致癌基因突變，KRAS突變促使與它相關(guān)聯(lián)的卵巢腫瘤亞型。這些發(fā)現(xiàn)有助于提高卵巢癌患者的預(yù)測。
[0136]大腸癌
[0137]祀向表皮生長因子受體(ant1-EGFR moAbs)的兩種單克隆抗體摻入到轉(zhuǎn)移性大腸癌(mCRC)臨床實踐中，西妥昔單抗和帕尼單抗，作為單藥治療或與化療相結(jié)合，提供給治療前患者一個溫和的臨床受益(Cunningham D, et al.N Engl J Med2004 ；351 (4):337-345 ；Saltz LB，et al.J Clin 0ncol2004 ；22(7):1201-1208 ;Saltz LB，et al.N EnglJ Med2000 ；343(13):905-914 ；Van CE, et al.J Clin 0ncol2007;25(13):1658-1664)。不過，它很快變得明顯，其功效僅限于一個群患者。非隨機的回顧性研究(Amado RG etal.J Clin 0ncol2008 ；26(10):1626-1634 ；De Rff, et al.Ann 0ncol2008 ；19(3):508-515 ；Lievre A, et al.Cancer Res2006 ；66 (8):3992-3995 ；Lievre A,et al.JClin 0ncol2008 ；26(3):374-379 ；Moroni M, et al.Lancet 0ncol2005 ；6 (5):279-286 ；Sartore-BianchiA, al.J Clin 0ncol2007 ;25 (22):3238-3245)，前瞻性隨機試驗回顧性分析(BokemeYerC，et al.J Clin 0ncol2009 ；27(5):663-671 ；Douillard J et al.AnnOncol supp.2009 ；Karapetis CS, et al.N Engl J Med2008 ;359 (17):1757-1765 ;Tol J, et al.N EnglJ Med2009 ；360(6):563-572 ；Van Cutsem E, et al.N Engl J Med2009 ;360 (14):1408-1417)，大歐洲聯(lián)盟研究表明(De Rff, et al.Lancet 0ncol2010 ；11 (8):753-762),腫瘤KRAS突變的存在預(yù)測了抗EGFR單克隆抗體治療耐藥性，并且與預(yù)測差、生存期短相關(guān)。強制性啟動抗EGFR單抗治療KRAS突變狀態(tài)有很多年了，問題沒有得到解決，因為，約50-65%的患有KRAS野生腫瘤的轉(zhuǎn)移性大腸癌患者沒有受益于這些治療，這意味著，耐藥的另外的遺傳決定因素或者靈敏度存在(De Rff, et al.Ann 0ncol2008 ；19(3):508-515 ；Allegra CJ, et al.J Clin 0ncol2009 ；27 (12):2091-2096 ;De Rff, al.Lancet0ncol2010 ；11 (8):753-762 ;RooCk WD, et al.Lancet 0ncol2010)。越來越多的證據(jù)表明，BRAF V600E突變賦予抗EGFR單克隆抗體耐藥性(De Rff, et al.Lancet 0ncol2010 ；11 (8):753-762 ；Di NF, et al.J Clin 0ncol2008 ;26(35):5705-5712 ；Laurent-PuigP, et al.J Clin 0ncol2009 ；27(35):5924-5930 ；Saridaki Z, et al.1PLoS 0ne2011 ；6(1):el5980 ；Souglakos J, et al.Br J Cancer2009 ；101(3):465-472)，然而，盡管并不完全清楚，PIK3CA突變腫瘤似乎沒有或很少受益于這樣的治；療(De Rff, et al.Lancet0ncol2010 ；11 (8):753-762 ；Prenen H, et al.Clin Cancer Res2009 ; 15 (9):3184-3188;Sartore-Bianchi A, et al.Cancer Res2009 ；69 (5):1851-1857 ； Jhawer M, et al.CancerRes2008 ；68(6):1953-1961 ；0gino S，et al.J Clin 0ncol2009 ；27(9):1477-1484)。
[0138]除了腫瘤遺傳特征，有越來越多的證據(jù)表明，患者的生殖細胞基因組也可能在給予ant1-EGFR單克隆抗體治療耐藥性或者敏感性發(fā)揮作用。支持這個概念，F(xiàn)e Y RIIa和Fe Y Rllla、表皮生長因子受體、表皮生長因子、細胞周期蛋白Dl和C0X-2基因編碼多態(tài)性，與單一療法和與聯(lián)合化療給藥的西妥昔單抗治療轉(zhuǎn)移性大腸癌患者的結(jié)果有關(guān)聯(lián)。
[0139]MicroRNAs (miRNAs)是一類高度同源、內(nèi)源性的、非編碼的小RNA分子，長度為18-25個核苷酸，結(jié)合靶標mRNA3'-非翻譯區(qū)(UTR)部分互補位負調(diào)控基因表達。經(jīng)Dicer和Drosha酶RNase III核酸內(nèi)切酶處理后，成熟的miRNA可以通過引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體向靶mRNA抑制mRNA翻譯。miRNA調(diào)節(jié)一些參與了基礎(chǔ)生物過程，如細胞增殖、細胞分化和凋亡的基因，無論是作為致癌基因或腫瘤抑制基因在癌癥發(fā)生和發(fā)展中起到重要角色。雖然，迄今已確認人類基因組中700多個miRNA序列，這一數(shù)字預(yù)計將增加一倍。此外，每個miRNA可以同時通過調(diào)節(jié)許多miRNA來控制數(shù)百個基因。
[0140]MiRNA結(jié)合mRNA基因?qū)RNA水平的調(diào)控過程和隨后的蛋白表達是至關(guān)重要的，并且這種調(diào)節(jié)可以受到miRNA靶標位點單核苷酸多態(tài)性(SNP) (SNPs)的影響。這些單核苷酸多態(tài)性(SNP)可以創(chuàng)建錯誤的結(jié)合位點或者取消(消除)正確的結(jié)合位點，導(dǎo)致miRNA調(diào)節(jié)抗性，反映能夠在人類的疾病，如癌癥中發(fā)揮作用的另一種遺傳突變(或給某些疾病，如癌癥增加風險)。新興的研究主要集中在這些結(jié)合位點的系統(tǒng)基因組評價和檢測單核苷酸多態(tài)性(SNP)的功能和生物相關(guān)性，這是個性化醫(yī)療快速增長領(lǐng)域的重要分子標志物。出現(xiàn)這樣的單核苷酸多態(tài)性(SNP)不僅影響基因表達，而且還影響腫瘤生物學(xué)和藥物反應(yīng)及耐藥性。
[0141]miRNA Lethal-7家族(let_7)在許多癌癥中首次被發(fā)現(xiàn)，并且已檢測到其差異表達。KRAS原致癌基因是let-7miRNA家族的直接作用靶點，更確切地說，一經(jīng)結(jié)合KRAS基因mRNA3/非翻譯區(qū)(3' -UTR)某些位點，let_7誘導(dǎo)KRAS基因下調(diào)。
[0142]KRAS基因突變是一種功能性的單核苷酸多態(tài)性(SNP) (SNP)，發(fā)生在KRAS基因3' -UTR mRNA let_7互補位點(LCS)。所述單核苷酸多態(tài)性(SNP) (rs61764370)將T置換為G堿基，被發(fā)現(xiàn)改變成熟let-7結(jié)合KRAS基因mRNA的能力，并導(dǎo)致KRAS基因癌蛋白體外表達增加，并導(dǎo)致體內(nèi)let-7miRNA水平更低，這可能是由于負反饋回路。與KRAS基因的致癌性質(zhì)一致，KRAS基因突變(也稱為G等位基因)顯示增加了中度吸煙者患非小細胞肺癌(NSCLC)的風險，增加了發(fā)展三陰性乳腺癌的風險，增加了一群婦女中患卵巢癌的風險。此外，在小隊列BRCAl攜帶者中檢測KRAS突變等位基因的頻率增加。而且，KRAS基因突變攜帶者(等位基因G-)，患有頭部和頸部癌癥，但不是患有非小細胞肺癌，顯示出總生存率降低。統(tǒng)計學(xué)顯著性較差的生存率和鉬耐藥被發(fā)現(xiàn)在攜帶KRAS基因突變(G等位基因)的卵巢癌患者中。證據(jù)也一起證明了 KRAS基因突變(也被稱為KRAS基因3' -UTR LCS6SNP)的功能及臨床顯著性。
[0143]轉(zhuǎn)移性大腸癌靶向抗EGFR單抗治療設(shè)置日期，KRAS基因突變已在小部分人群并具有矛盾和沖突的結(jié)果的兩項研究中進行評估(Graziano F, et al.PharmacogenomicsJ2010 ；10(5):458-464 ；Zhang ff, et al.Ann 0ncol2011 ;22 (I):104-109)。攜帶 KRAS 和BRAF野生型等位基因患者人群的第一項研究中(Graziano F, et al.PharmacogenomicsJ2010 ；10(5):458-464)，伊立替康-西妥昔單抗聯(lián)合治療進行救助治療，KRAS基因突變(G-等位基因)攜帶者均表現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)顯著性更糟的無進展生存期(PFS)和總生存期
(OS) 相反，在第二項研究中(Zhang w, et al.Ann 0ncol2011 ；22 (I):104-109),其中患者接受西妥昔單抗單藥救助治療，KRAS基因突變(G-等位基因)攜帶者顯示出較長的無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)，有一個更好的客觀有效率(ORR)。雖然這些研究似乎有相反的結(jié)果，這些患者治療不相同，而事實上，伊立替康化療加西妥昔單抗還被發(fā)現(xiàn)預(yù)測了 KRAS基因突變(G-等位基因)攜帶者的不佳反應(yīng)(Winder T，et al.J.Clin.0ncol.[27(15S Suppl)].2009.Abstract) o有證據(jù)表明，不像腫瘤并發(fā)KRAS蛋白突變，對KRAS基因突變(G-等位基因)攜帶者進行聯(lián)合治療差異性影響對西妥昔單抗的響應(yīng)(Winder T，et al.J.Clin.0ncol.[27 (15SSuppl) ].2009.Abstract)。這與疾病中動態(tài)調(diào)節(jié) miRNA 結(jié)合位變體的數(shù)據(jù)一致。
[0144]在這項研究中，KRAS基因突變，以及其他分子標志物，如KRAS和BRAF突變狀態(tài)，在接受ant1-EGFR單克隆抗體單藥治療或者單克隆抗體與化療聯(lián)合治療的一系列559名轉(zhuǎn)移性大腸癌患者中進行了評價。本文中所給出的數(shù)據(jù)明確了預(yù)測單克隆抗體治療應(yīng)答中KRAS基因突變的作用。在此患者隊列中，以及細胞株中，KRAS基因突變(G等位基因)預(yù)測了單克隆抗體單藥治療的陽性響應(yīng)，細胞毒性化療沒有任何額外的益處。
[0145]本文提出的研究證實，患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的所有KRAS突變攜帶者的中位無進展生存期統(tǒng)計學(xué)顯著性改善(一對野生型患者改善總生存期的趨勢)，KRAS突變攜帶者接受ant1-EGFR單克隆抗體單藥治療。此外，相對于抗表皮生長因子受體單克隆抗體響應(yīng)研究的所有隊列中的非KRAS突變攜帶者，包括KRAS或RAF突變患者，發(fā)現(xiàn)這些患者統(tǒng)計學(xué)顯著性預(yù)測良好。這種預(yù)測改善是不取決于化療的加入，而事實上，除了 ant1-EGFR單克隆抗體治療之外，KRAS基因突變(G等位基因)攜帶者顯示出化療沒有效果。這與非KRAS突變患者相反，其得出所有隊列中顯著性受益于化療加ant1-EGFR單克隆抗體，化療的加入給接受ant1-EGFR單克隆抗體單藥治療的同一水平KRAS突變等位基因攜帶者帶來了預(yù)測。細胞株研究表明，對比非突變細胞株，KRAS基因突變細胞株缺乏聯(lián)合治療中獲益的同樣效果。這些研究結(jié)果表明，第一時間，患有轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的KRAS基因突變等位基因患者，可以，也許應(yīng)該避免化療的毒性，有時甚至是致命的影響，并且可以單獨進行有意義的ant1-EGFR單克隆抗體單藥治療。
[0146]對比報告的基線患病率，主要起源于歐洲的一群患者表現(xiàn)出KRAS基因突變頻率升高19.5%。在6%的世界人口中發(fā)現(xiàn)KRAS突變，在健康白種人中其頻率已估計將上升10%以上。此外，患有非小細胞肺癌患者中，KRAS基因突變的患病率大幅增加近20%，突出了風險增加的關(guān)聯(lián)性。Graziano 等人(Pharmacogenomics J2010 ； 10 (5):458-464)研究的具有歐洲血統(tǒng)的白人轉(zhuǎn)移性大腸癌患者群中，KRAS基因突變(G等位基因)(摻入TG和GG基因型)被發(fā)現(xiàn)在25%的患者中，然而Zhang等人研究的更異質(zhì)人群中(Ann 0ncol2011 ；22(1):104-109), KRAS突變的頻率為15.3%。本文提供的數(shù)據(jù)沒有發(fā)現(xiàn)KRAS突變等位基因是患結(jié)腸癌的風險，雖然IV期患者富集KRAS突變?？傊?，證據(jù)表明，雖然KRAS突變(G等位基因)不是所有類型的結(jié)腸癌的風險，它與發(fā)展晚期和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的可能性有關(guān)聯(lián)。KRAS突變預(yù)測了采用西妥昔單抗單藥治療時，早期結(jié)腸癌以及轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者預(yù)測良好。然而，KRAS基因突變(G等位基因)可能與結(jié)腸癌中轉(zhuǎn)移性疾病的發(fā)展有關(guān)聯(lián)，這是普遍致命的。[0147]對比以前的報告，在關(guān)于轉(zhuǎn)移性大腸癌患者人群這項研究中觀察到根據(jù)KRAS和BRAF突變狀態(tài)的KRAS突變基因型的不同分布。在這項研究中，KRAS基因型在KRAS野生型和突變組之間平均分配，但是，在BRAF突變組中，KRAS突變的頻率是統(tǒng)計學(xué)顯著性增加，例如，與野生型相比高兩倍。在大腸癌癌變的后期階段，KRAS基因突變等位基因可能介導(dǎo)低分化且更具攻擊性的克隆的選擇，這種克隆攜帶BRAF突變。此外，KRAS基因突變的存在下，選擇性壓力可能有利于KRAS或BRAF突變發(fā)展，這取決于接受特異性療法。當進行西妥昔單抗治療時，不管患者已經(jīng)有KRAS或BRAF基因突變，KRAS突變(G等位基因)患者有不同的預(yù)測，提示這些組需要重新評估西妥昔單抗治療的潛力。
[0148]當依據(jù)治療分析生存結(jié)果時，采用ant1-EGFR單克隆抗體單藥治療整個和一對野生型患者群中，KRAS突變基因型攜帶者有統(tǒng)計學(xué)顯著性更長的無進展生存期(分別，P=0.019和P=0.039)。雖然，在整個單藥治療的患者群中，對比野生型攜帶者28.85周，KRAS突變基因型攜帶者有45周更長的總生存期(OS)，然而這種差異并未達到統(tǒng)計學(xué)顯著性。在KRAS基因突變攜帶者雙(KRAS和BRAF)野生型患者群中，觀察到統(tǒng)計學(xué)顯著性(P=0.087)更長總生存期(OS)的趨勢(55.43與35.71周)。[0149]對比具有LCS6野生型基因型(P=0.037，log-rank檢驗)患者12周無進展生存期，具有KRAS基因突變(G-等位基因)基因型的西妥昔單抗/伊立替康治療的KRAS突變患者，表現(xiàn)出顯著性更差的無進展生存期(PFS)6.4周。在我們的分析中，ant1-EGFR單克隆抗體為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療組中，人們分別使用多種藥劑治療，KRAS突變和野生型基因型攜帶者之間任一人群中發(fā)現(xiàn)無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。具有KRAS或RAF突變的KRAS突變攜帶者，當他們分別接受化療與單藥治療時，存在更差生存期(23周與28周)的趨勢。這些結(jié)果共同表明，KRAS突變攜帶者采用化療聯(lián)合基于ant1-EGFR單克隆抗體的治療是不利的。[0150]在其他癌癥中，大腸癌發(fā)展的一個重要步驟，是miRNA失調(diào)。在過去幾年中，miRNA已被帶到分子腫瘤學(xué)的中心舞臺，并大大改變了我們看待和理解基因調(diào)控的方式。KRAS基因突變是與癌癥風險相關(guān)的miRNA結(jié)合位內(nèi)第一個單核苷酸多態(tài)性(SNP)。本文提出的數(shù)據(jù)表明，攜帶KRAS突變等位基因的患者比非突變、或LCS6野生型患者更具有生物學(xué)差異性。加用化療無收益的情況下，攜帶KRAS基因突變等位基因基因型的患者有較高概率收益于ant1-EGFR單克隆抗體單藥治療以及更好的總體預(yù)測。由于KRAS突變腫瘤誘導(dǎo)KRAS通路的過度表達，上游抑制這一通路可能使這些腫瘤特別敏感。這種機制顯示出否認KRAS基因突變腫瘤單克隆抗體治療缺乏療效，然而，有可能KRAS基因突變不會誘發(fā)像KRAS基因突變腫瘤一樣高水平的獨立KRAS通路信號。
[0151]KRAS突變腫瘤不能從細胞毒藥物治療加單克隆抗體單藥治療中得到好處。因為miRNA let-7家族調(diào)節(jié)KRAS突變，因為化療降低let-7水平，允許更高的KRAS基因表達(尤其在KRAS基因突變存在下)，使用化療的治療方案可能會增加該等位基因的激活，從而去除上游單克隆抗體療法克服KRAS通路激活的能力。3’UTR功能性突變(包括KRAS基因突變)的潛在可能性，預(yù)測腫瘤生物學(xué)改變和對治療的響應(yīng)，得到患者更好的危險評分。
[0152]MicroRNA
[0153]MicroRNAs (miRNAs)是一類新的小非編碼RNA，具有靶mRNA3 ^非翻譯區(qū)(UTR)，以及5'非翻譯區(qū)(UTR)和編碼序列區(qū)內(nèi)序列的堿基配對調(diào)控基因表達，導(dǎo)致mRNA的裂解和 / 或翻譯抑制(He L, et al.Nature2005 ；435:828-33 ；EsqueIa-Kerscher A.and SlackFJ.Nat Rev Cancer2006 ；6:259-69)。迄今研究的每一例癌癥中MiRNAs被錯誤調(diào)控，包括，但不限于，乳腺癌和大腸癌，在腫瘤起始細胞中發(fā)現(xiàn)某些miRNA改變(尤其減少let-7)，這表明低let-7使這些細胞自更新和增殖(Yu F，et al.Cell2007 ；131:1109-23)，并增加患癌癥的風險。
[0154]因為miRNA起到全局基因調(diào)控的作用，miRNA遺傳突變與癌癥風險增加相關(guān)。證據(jù)快速增長，干擾 miRNA 編 碼序列(Ho □ man A, et al.Cancer Res2009 ；69:5970-77)或3' UTR miRNA結(jié)合位點的多態(tài)性是癌癥風險強有力的預(yù)測因子，包括，但不限于，乳腺癌和大腸癌(Pongsavee M, et al.Genet Test Mol Biomarkers2009 ； 13:307-17 ；Tchatchou S,et al.Carcinogenesis2009 ；30:59-64)。然而，沒有先前發(fā)現(xiàn)的miRNA-改變多態(tài)性與三陰性乳腺癌(TNBC)或與腫瘤中改變的基因和/或miRNA表達相關(guān)。
[0155]最近確定了 KRAS原致癌基因3’UTR let_7miRNA互補位點內(nèi)的一種新的種系多態(tài)性(rs61764370)(國際專利申請?zhí)朠CT / US2008 / 065302，其全部內(nèi)容通過引用合并于本文中)，統(tǒng)稱為“LCS6-SNP'或‘KRAS基因突變，。
[0156]KRAS突變與腫瘤內(nèi)低濃度let-7和肺癌改變的KRAS基因調(diào)控相關(guān)(Chin L，etal.Cancer Res2008 ；68:8535-40)。此外，KRAS基因突變預(yù)測了頭部和頸部癌癥中較差的癌癥特異性結(jié)果(Christensen BC, et al.Carcinogenesis2009 ；30: 1003-07)，也預(yù)測了結(jié)腸癌中改變的藥物應(yīng)答(Graziano F, et al.Pharmacogenomics J2010 ; 10:458-64 ;Zhangff, et al.Ann 0ncol2011 ;22:104-09)。KRAS基因突變也富集在卵巢癌中，是最常見與遺傳性乳腺癌和卵巢癌(HBOC)家族的患者相關(guān)聯(lián)(Ratner E, et al.Cancer Res2010 ；70:6509-15)。本文提供的研究進一步評估了癌癥風險和腫瘤生物學(xué)中KRAS基因突變的作用。
[0157]本文提供的數(shù)據(jù)顯示，舉例來說，KRAS基因3' UTR種系多態(tài)性，被稱為“KRAS基因突變”，是絕經(jīng)前婦女發(fā)展三陰性乳腺癌風險增加的一種遺傳標志物。因為研究組I規(guī)模小，只能在具有已知的ER和PR狀態(tài)患者中評估，相關(guān)性在全受體狀態(tài)的更大規(guī)模的病例對照組中得到驗證。最重要的是，數(shù)據(jù)證實與沒有KRAS基因突變的患者對比，具有KRAS基因突變的三陰性乳腺癌(TNBC)患者的腫瘤有不同的基因表達模式，證實KRAS基因突變驅(qū)動特異性通路，該特異性通路眾所周知影響腫瘤生物學(xué)并修改腫瘤發(fā)展。因此，KRAS基因突變可以將腫瘤分類為有意義的生物亞組，在未來預(yù)測預(yù)測以及指導(dǎo)治療決策。
[0158]三陰乳腺癌腫瘤內(nèi)let-7表達減少與KRAS基因突變相關(guān)的發(fā)現(xiàn)在臨床上是重要的。通過NFKB，KRAS基因過度表達可誘導(dǎo)lin-28、let_7負調(diào)控，因此，降低let_7表達(Iliopoulos D, et al.Cell2009 ； 139: 1-14 ；Meylan E, et al.Nature2009 ；462: 104-08 ；Barbie D，et al.Nature2009 ;462:108-12)。這提示了，預(yù)惡性組織，最終，KRAS 基因突變相關(guān)的腫瘤中l(wèi)et-7降低的潛在機制。此外，let-7調(diào)控乳腺樣干細胞增殖(Yu F，YaoH,Zhu P，et al.Cell2007 ；131:1109-23)，并調(diào)控let_7低表達或低濃度使這組細胞擴張，從而增加了攜帶KRAS基因突變的婦女患乳腺癌的風險。KRAS基因突變只與絕經(jīng)前婦女三陰性乳腺癌風險的相關(guān)性指出了 KRAS基因突變和激素暴露之間的意義交互。
[0159]盡管半數(shù)以上攜帶BRCAl基因突變的乳腺癌腫瘤(TNBC)發(fā)展成三陰性亞型(Atchlev DP, et al.J Clin oncol2008 ;26:4282-88)，BRCAl 基因突變是罕見的，因此，大約占所有三陰乳腺癌病例的 10-15% (Young SR，et al.BMC Cancer2009 ；9:86 ；Nanda R，etal.JAMA2005 ；294:1925-33)。在23%以上的絕經(jīng)前三陰乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變，這些隊列的BRCA突變基因攜帶者或者年輕的ER / PR陰性BRCAl基因突變攜帶者中沒有明顯的顯著性富集(miRNA表達圖譜,公眾可登錄WWW.appliedbiosystems.com / absite /us / en / home / applications-technol ogies / real-time-pcr / mirna-profiIing.html (accessed Janl，2008))。KRAS基因突變與BRCAl基因突變類基因表達標簽相關(guān)聯(lián)，表明無論是通過突變或其他機制，有可能增加KRAS基因突變、KRAS基因高表達和BRCAl低表達存在下的致癌風險。
[0160]KRAS基因突變影響體外調(diào)控KRAS基因表達，并引發(fā)更高的KRAS濃度(Chin L，etal.Cancer Res2008 ；68:8535-40)。KRAS致致癌基因是MAPK通路重要的上游調(diào)節(jié)，其過度表達可以導(dǎo)致Raf/MEK / MAPK通路活化增加，從而促使腫瘤的發(fā)生。本文提供的研究證實，具有KRAS基因突變和三陰性乳腺癌的患者顯示出MAPK通路活化(表X)。乳腺癌細胞中MAPK超活化降低ER表達，導(dǎo)致ER-陰性表型(Atchley D P，et al.J Clin 0ncol2008 ；26:4282-88)，與我們的發(fā)現(xiàn)一致，KRAS基因突變與這些組織學(xué)ER陰性腫瘤內(nèi)更低雌激素信號相關(guān)。MAPK活化與非雌激素依賴型腫瘤的生長和抗雌激素治療不敏感性有關(guān)(Oh AS，et al.Mol Endocrinol2001 ；15:1344-59)，可能是KRAS基因突變驅(qū)動乳腺癌腫瘤不只是其它乳腺癌亞型發(fā)展的機制。
[0161]KRAS基因突變是一些癌癥預(yù)測較差的生物標志物，包括頭部和頸部癌癥(Christensen BC, et al.Carcinogenesis2009 ;30:1003-07)。KRAS 基因突變也是結(jié)腸癌革巴向治療聯(lián)合化療反應(yīng)不佳的生物標志物(Graziano F, et al.Pharmacogenomics J2010 ；10:458-64)。KRAS基因突變陽性三陰性乳腺癌患者具有l(wèi)uminal型前體血管標簽，標簽內(nèi)血管生成和轉(zhuǎn)移性標志物的差異表達證實，KRAS突變腫瘤是侵略性亞組三陰性乳腺癌。
[0162]本文提供的研究證實，KRAS基因突變與腫瘤相關(guān)，腫瘤保持獨特的基因表達模式。雖然工作正在進行，這些研究數(shù)據(jù)提供了針對轉(zhuǎn)化關(guān)鍵步驟和通路以及婦女腫瘤發(fā)展的有價值見解。這些都是了解功能miRNA破壞多態(tài)性的癌癥生物學(xué)機制非常有意義的步驟，功能miRNA破壞多態(tài)性功能上不同于先前發(fā)現(xiàn)的癌癥風險遺傳標志物。
[0163]KRAS 突變
[0164]本發(fā)明是基于，部分基于意外發(fā)現(xiàn)，存在KRAS基因3'非翻譯區(qū)(UTR)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，本文統(tǒng)稱為“LCS6SNP”’或“KRAS基因突變”，預(yù)測個體患癌癥風險和個體治療癌癥的響應(yīng)。KRAS基因突變位于LCS6，在下面提供了野生型和突變序列。
[0165]KRAS突變可以由一個或多個下列序列表示。舉例來說，KRAS基因突變可以由GenBank 登錄號 rs61764370 和序列 GTCTCGAACTCCTGACCTCAAGTGATGCACCCACCTTGGCCTCATAAACCTG(SEQ ID NO:22，其中單核苷酸多態(tài)性(SNP)用粗體下劃線標出)定義。
[0166]由HRAS、KRAS和NRAS組成的三種人RAS基因。每個基因包括多個其mRNA轉(zhuǎn)錄物3' UTR內(nèi)miRNA互補位點。具體來說，每種人RAS基因包括多個let_7互補位點(LCSs)。microRNAs let-7家族(miRNAs)包括結(jié)合其靶標信使RNAs (mRNAs) 3' UTRs (非編碼區(qū))控制肺癌致癌基因表達的重要的全局遺傳調(diào)控因子。
[0167]具體而言，術(shù)語“l(fā)et-7互補位”是為了描述結(jié)合miRNAs let_7家族成員的基因或基因轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域。此外，這個術(shù)語包括與let-7家族miRNA序列互補的基因或基因轉(zhuǎn)錄物內(nèi)這些序列。術(shù)語“互補”描述兩個序列間結(jié)合的閾值，其中每個序列中的大部分核苷酸能反式結(jié)合另一序列內(nèi)大多數(shù)核苷酸。
[0168]人KRAS3' UTR包括8個LCS1，分別命名為LCS1-LCS8。下列序列，胸腺嘧啶(T)可取代為尿嘧啶(U)。LCSl 包括序列 GACAGUGGAAGUUUUUUUUUCCUCG (SEQID NO:1) ο LCS2 包括 序列 AUUAGUGUCAUCUUGCCUC(SEQ ID NO:2)。LC S3包括序列 AAUGCCCUACAUCUUAUUUUCCUCA (SEQ ID NO:3)。LCS4 包括序列GGUUCAAGCGAUUCUCGUGCCUCG (SEQ ID NO:4)。LCS5 包括序列
[0169]GGCUGGUCCGAACUCCUGACCUCA (SEQ ID NO:5) ? LCS6 包括序列GAUUCACCCACCUUGGCCUCA (SEQ ID NO:6)。LCS7 包括序列 GGGUGUUAAGACUUGACACAGUACCUCG(SEQ ID NO:7) ο LCS8 包括序列
[0170]AGUGCUUAUGAGGGGAUAUUUAGGCCUC(SEQ ID NO:8)。
[0171]人KRAS基因有兩個野生型形式，由轉(zhuǎn)錄物a和b編碼，分別為下文中所提供的序列號:9和10。每個人KRAS轉(zhuǎn)錄物的序列，含有LCS6SNP，如下文中所提供的序列號:11和12。
[0172]人KRAS基因，轉(zhuǎn)錄剪接體a，由下列mRNA序列編碼(NCBI登錄號:NM_033360和SEQ ID NO:9)(非編碼區(qū)以粗體顯示，LCS6以下劃線標出):
[0173]
【權(quán)利要求】
1.一種用于識別具有使雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)陰性(ER / PR陰性)發(fā)展為乳腺癌風險的主體或患者的方法，包括檢測在患者樣本中人KRAS的let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種包括在LCS6位點4處的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述突變的存在表明具有將ER / PR陰性發(fā)展為乳腺癌的增加風險。
2.一種用于在有發(fā)展為乳腺癌風險的主體或患者中預(yù)測雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)陰性(ER / PR陰性)發(fā)展為乳腺癌的發(fā)病的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS的let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種包括LCS6位點4處的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述突變的存在表明具有將ER / PR陰性發(fā)展為乳腺癌的更早發(fā)病。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中ER/ PR陰性乳腺癌也是HER2陰性，從而其是一種三陰性乳腺癌(TNBC)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中三陰性乳腺癌(TNBC)是一種基底腫瘤或luminal型腫瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中三陰性乳腺癌(TNBC)是一種基底腫瘤，其表達一種轉(zhuǎn)錄子或者表皮生長因子受體(EGFR)或細胞角蛋白5 / 6(CK5 / 6)基因編碼的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、或3所述的方法，其中乳腺癌的進一步特征在于低表達或陰性表達的乳腺癌I (BRCAl)基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、或3所述的方法，其中主體或患者是絕經(jīng)前女性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、 或3所述的方法，其中主體或患者的年齡是51歲或更年輕。
9.一種對患有卵巢上皮癌(EOC)的主體或患者進行預(yù)測的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS的let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中，當與對照組對比時，突變的存在表明存活率降低。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中主體或患者為絕經(jīng)后、52歲或至少52歲。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中對照組不攜帶突變。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中生存率是總的生存率、五年的生存率或一年的生存率。
13.—種對卵巢上皮性癌(EOC)細胞鉬類化療響應(yīng)進行預(yù)測的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS的let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述突變的存在表明鉬類化療耐藥性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中卵巢上皮性癌細胞在體外或離體評價。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中主體是絕經(jīng)后、52歲或至少52歲，主體卵巢上皮性癌細胞離體評價。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中卵巢上皮性癌細胞在體外進行評估，其中卵巢上皮性癌細胞被分離、復(fù)制，或來自BG1、CA0V3、或IGR-OVl細胞株。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中鉬類化療是卡鉬或紫杉醇。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中鉬類化療是輔助治療。
19.一種患有大腸癌(CRC)的測試主體預(yù)測的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6突變，其中所述突變是一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述突變的存在顯示存活率增加。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中檢測步驟進一步包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)分析
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中大腸癌(CRC)是早期階段大腸癌。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中大腸癌(CRC)是I期或2期大腸癌。
23.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中對照組主體不攜帶KRAS基因突變。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中對照組主體KRAS基因具有二次突變。
25.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中主體或患者KRAS基因具有二次突變。
26.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中主體或?qū)φ战M主體BRAF基因攜帶一個或多個突變。
27.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中主體或?qū)φ战M主體具有高甲基化RASSF1A啟動子。
28.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中生存率是總生存率率，五年生存率或一年生存·率。
29.一種預(yù)測癌細胞進行單克隆抗體單藥治療的響應(yīng)的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6突變，其中所述突變是一種一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述突變的存在，表明對單克隆抗體單藥治療的敏感性。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中癌細胞是大腸癌(CRC)細胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中癌細胞在體外或離體進行評價。
32.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中單克隆抗體單藥治療是西妥昔單抗。
33.一種預(yù)測腫瘤細胞對化療聯(lián)合單克隆抗體治療的響應(yīng)的方法，包括檢測患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6突變，其中所述突變是一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其中所述突變的存在表明對聯(lián)合治療的耐藥性。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中癌細胞是大腸癌(CRC)細胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中癌細胞在體外或離體進行評價。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中單克隆抗體單藥治療是西妥昔單抗。
37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中化療是一種細胞毒性劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中細胞毒性劑是伊立替康。
39.一種預(yù)測腫瘤的血管生成風險增加的方法，包括 (a)檢測第一位患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)； (b)確定miRNA表達水平，miRNA選自由第二位患者樣本中miR-23和miR-27組成的組； 其中與對照組對比，所述的(a)中突變的存在和(b)中miRNA表達水平的增加表明抗血管生成基因轉(zhuǎn)錄基因靜默增加，從而預(yù)測腫瘤血管形成風險增加。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中抗血管生成基因是Sprouty2或Sema6A。
41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的方法，其中腫瘤包括一種癌細胞，該癌細胞源自艾滋病相關(guān)的癌癥、乳癌、消化/胃腸道的癌癥、肛門癌、闌尾癌、膽管細胞癌、結(jié)腸癌、大腸癌、食道癌、膽囊癌、胰島細胞瘤、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、肝癌、胰臟癌、直腸癌、小腸癌、胃癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、腎上腺皮質(zhì)癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、甲狀腺癌、眼癌、眼內(nèi)黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、膀胱癌、腎(腎細胞)癌、陰莖癌、前列腺癌、移行細胞腎盂和輸尿管癌、睪丸癌、尿道癌、腎母細胞瘤、其他兒童腎臟腫瘤、生殖細胞癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、卵巢生殖細胞腫瘤、婦科腫瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、卵巢癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、頭部和頸部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隱匿性原發(fā)性轉(zhuǎn)移性鱗狀頸部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻竇和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤、胃腸道間質(zhì)腫瘤(GIST)、骨肉瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤、橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、神經(jīng)系統(tǒng)癌、腦腫瘤、星形細胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、中央神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣/橫紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎性腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)生殖細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、脊髓腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和松果體母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、呼吸系統(tǒng)癌、胸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、惡性間皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮膚癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、MerkeI細胞癌。
42.根據(jù)權(quán)利要求39或41所述的方法，其中腫瘤是轉(zhuǎn)移性的。
43.一種預(yù)測缺氧條件下癌癥細胞存活或增殖增加的方法，包括 (a)檢測第一位患者樣本中人KRAS基因let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，及 (b)確定第二位患者樣本中miR-210miRNA的表達水平， 其中與對照組對比，所述的(a)中突變的存在和(b)中miRNA表達水平的增加預(yù)測缺氧條件下癌癥細胞存活或增殖的增加。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中癌細胞源自于艾滋病相關(guān)的癌癥、乳癌、消化/胃腸道的癌癥、肛門癌、闌尾癌、膽管細胞癌、結(jié)腸癌、大腸癌、食道癌、膽囊癌、胰島細胞瘤、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、肝癌、胰臟癌、直腸癌、小腸癌、胃癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、腎上腺皮質(zhì)癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、甲狀腺癌、眼癌、眼內(nèi)黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、膀胱癌、腎癌腎細胞癌、陰莖癌、前列腺癌、過渡細胞腎盂和輸尿管癌、睪丸癌、尿道癌、腎母細胞瘤、其他兒童腎臟腫瘤、生殖細胞癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、卵巢生殖細胞腫瘤、婦科腫瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、卵巢癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、頭頸部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隱匿性原發(fā)性轉(zhuǎn)移性鱗狀頸部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻竇和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、骨肉瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤、橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、神經(jīng)癌、腦腫瘤、星形細胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣/橫紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)生殖細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、脊髓腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和松果體母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、呼吸系統(tǒng)癌、胸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、惡性間皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮膚癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、Merkel細胞癌。
45.一種預(yù)測癌細胞存活或增殖增加的方法，包括 (a)檢測第一位患者樣本中人KRAS基因的let-7互補位LCS6中的突變，其中所述突變是一種包括在LCS6位點4的尿嘧啶(U)或胸腺嘧啶(T)轉(zhuǎn)變?yōu)轼B嘌呤(G)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，及 (b)確定第二位患者樣本中腫瘤抑制基因啟動子的甲基化狀態(tài)， 其中與對照組對比，所述的(a)中突變的存在和啟動子(b)甲基化增加預(yù)測腫瘤細胞的存活或增殖。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中腫瘤抑制基因是Notchl。
47.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中癌細胞源自于艾滋病相關(guān)的癌癥、乳癌、消化系統(tǒng)癌/胃腸道、肛門癌、闌尾癌、膽管細胞癌、結(jié)腸癌、大腸癌、食道癌、膽囊癌、胰島細胞瘤、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、肝癌、胰臟癌、直腸癌、小腸癌、胃癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、腎上腺皮質(zhì)癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、甲狀腺癌、眼癌、眼內(nèi)黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、膀胱癌、腎癌腎細胞癌、陰莖癌、前列腺癌、過渡細胞腎盂和輸尿管癌、睪丸癌、尿道癌、腎母細胞瘤、其他兒童腎臟腫瘤、生殖細胞癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、卵巢生殖細胞腫瘤、婦科腫瘤、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、卵巢癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、頭頸部癌、下咽癌、喉癌、唇及口腔癌、隱匿性原發(fā)性轉(zhuǎn)移性鱗狀頸部癌、口腔癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻竇和鼻腔癌、咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、骨骼肌肉癌、骨癌、尤因氏肉瘤胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、骨肉瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤、橫紋肌肉瘤、軟組織肉瘤、子宮肉瘤、神經(jīng)癌、腦腫瘤、星形細胞瘤、腦干膠質(zhì)瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎樣/橫紋肌樣瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎腫瘤、 中樞神經(jīng)系統(tǒng)生殖細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、脊髓腫瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤和松果體母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、呼吸系統(tǒng)癌、胸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、惡性間皮瘤、胸腺瘤、胸腺癌、皮膚癌、卡波氏肉瘤、黑素瘤、Merkel細胞癌。
48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中存活包括保持致瘤潛能。
49.根據(jù)權(quán)利要求45或48所述的方法，其中癌細胞是癌干細胞。
【文檔編號】C12Q1/68GK103547683SQ201280024407
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月22日
【發(fā)明者】J·B·溫迪哈斯 申請人:耶魯大學(xué)