專利名稱：一種高效表達(dá)乳酸脫氫酶c4的工程菌及其表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組乳酸脫氫酶C4的工程菌及其表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
乳酸脫氫酶(LDH)，是糖酵解途徑中的一個(gè)酶，利用NADH為輔酶，催化丙酮酸和乳酸之間的轉(zhuǎn)化。在哺乳動(dòng)物中，LDH有3個(gè)編碼基因，分別為LDH-A、LDH-B, LDH-C,編碼 A、B、C 三個(gè)亞基(E. Goldberg, Reproductive implications of LDH_C4and othertestis-specific isozymes, Exp. Clin.1mmunogenet. 2 (1985) 120-124.)，對應(yīng)的四聚體純合酶為乳酸脫氫酶M4 (LDH-M4)、乳酸脫氫酶H4 (LDH-H4)和乳酸脫氫酶C4 (LDH-C4)，其中LDH-M4主要存在于骨骼肌中，LDH-H4主要存在于心肌，而LDH-C4只出現(xiàn)在成熟睪丸和精 子中，這三種四聚體純合酶在生化性質(zhì)上也有較大的區(qū)別(C. L. Markert, J. B. Shaklee, G.S. Whitt, Evolution of a gene. Multiple genes for LDH isozymes provide a model ofthe evolution of gene structure,function and regulation，Sciencel89(1975)102-114. )，LDH-C4相對于LDH-M4和LDH-H4在溶液中具有更好的熱穩(wěn)定性，其還能催化一些碳鏈較短的a-酮酸和a-羥酸之間的轉(zhuǎn)化，因而可以用于化工領(lǐng)域生產(chǎn)高純度L-乳酸和一些 a_ 輕酸(L. Schatz, H. L. Segal, Reduction of alpha-ketoglutarate by homogeneouslactic dehydrogenase X of testicular tissue. J Biol Chem. 1969,244:4393-7·)。LDHC4廣泛應(yīng)用于臨床診斷(用于檢測轉(zhuǎn)氨酶的活性)和化工生產(chǎn)，如果從天然動(dòng)物組織中分離純化LDHC4，會受到來源的限制，分離純化的成本也較高，用基因工程的方法制備是一種很好的解決辦法。國內(nèi)有通過基因工程的方法來表達(dá)LDH-C基因的文獻(xiàn)，但表達(dá)出的C亞基不能形成四聚體，不能得到LDH-C4，故沒有活性或者活性不高。國外也有通過大腸桿菌表達(dá)人LDH-C基因來獲得LDH-C4的報(bào)道，但是表達(dá)活性較低，粗酶的酶活最高僅為0. 5U/mg,純化后酶的酶活最高僅為 106U/mg (K. M. LeVan, E. Goldberg, Properties of humantestis-specific lactate dehydrogenase expressed from Escherichia col1.BiochemJ. 1991，273:587-92.)。

發(fā)明內(nèi)容
為了給臨床診斷、化工生產(chǎn)提供酶活高的LDH-C4，本發(fā)明提供了一種通過基因工程的手段重組表達(dá)LDH-C4的方法，為了實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)，提供了一種新的核苷酸序列，以及含有該序列的重組載體和重組菌。本發(fā)明提供的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明重組載體包括SEQ ID NO.1或所示的核苷酸序列。優(yōu)選地,所述重組載體是pET32a重組載體。本發(fā)明重組菌，它包括前述的重組載體。優(yōu)選地，所述重組菌為重組大腸桿菌。
本發(fā)明制備重組蛋白的方法，它包括如下步驟(I)取前述的重組菌,在大腸桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng),誘導(dǎo)表達(dá),得菌液,離心,得菌體；(2)取步驟(I)所得菌體，裂解，離心，取上清，分離純化，即得。步驟(I)所述培養(yǎng)基為含有氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，誘導(dǎo)表達(dá)使用的誘導(dǎo)劑為IPTG，誘導(dǎo)溫度為25°C，誘導(dǎo)時(shí)間為10h。其中，步驟(2)所述分離純化采用藍(lán)膠親和柱層析與離子交換層析。本發(fā)明從鼠兔睪丸中LDH-C編碼基因出發(fā)，用基因工程的方法制備得到了重組乳酸脫氫酶C4(LDH-C4)，其粗酶酶活高達(dá)35U/mg，純化后的酶活高達(dá)478U/mg，是現(xiàn)有重組乳酸脫氫酶C4純品酶活的4. 5倍，熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性強(qiáng)，應(yīng)用前景良好。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1重組載體測序圖譜。圖2重組菌的PCR檢測結(jié)果，其中，M泳道為marker DL2000泳道I和2為PCR產(chǎn)物。圖3重組菌的酶切結(jié)果，其中，Ml為marker DL2000,M2為marker Λ Hind III片段，I和2泳道為重組子的酶切驗(yàn)證。圖4聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，其中，A為非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后(native PAGE)，進(jìn)行乳酸脫氫酶活性染色，從圖中可以看出重組菌表達(dá)出了大量的可溶的有活性的LDH，泳道1，轉(zhuǎn)化了空載pET32a的大腸桿菌的粗提液；泳道2，轉(zhuǎn)化了pET32a-pika-LDH-C的大腸桿菌的粗提液。B, SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，泳道1，轉(zhuǎn)化了 pET32a-pika-LDH-C的大腸桿菌的粗提液，泳道2，熱處理后的上清，泳道3，親和層析的洗脫液，泳道4，離子交換后的穿透液，泳道M，蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖5本發(fā)明重組LDH-C4的熱激活結(jié)果，插入的小圖為阿利紐斯圖(Arrheniusplot)，測定緩沖液為IOOmM磷酸鈉，pH7. 4，蛋白濃度為10. 2ug/mL。圖6本發(fā)明重組LDH-C4的熱穩(wěn)定性檢測，先將酶溶液在不同溫度下溫浴，在不同時(shí)間點(diǎn)取出，離心后在25° C測定殘余活性，測定緩沖液為IOOmM磷酸鈉，pH7. 4，蛋白濃度為10.2邶/1^，圖中的符號0，贏，父，令，+，-，八，依次表示39.9° C，51.1。C，60.1。C，61.1。C，63. 7。C，65.1。C，70。C。圖7最適pH檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料保存液購自濟(jì)南泰天和生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TA克隆試劑盒、3’RACE試劑盒，測序引物 BcaBESTYM Sequencing Primer RV-M 和 BcaBESrITIlM SequencingPrimer M13-47購自寶生物工程(大連)有限公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司?？寺∷拗骶鸀镋. coli BL21，蛋白表達(dá)宿主菌為E. coli BL21 (DE3)，表達(dá)載體pET32a購自Novagen, Merck,藍(lán)膠(Blue sepharose)購自 GE healthcare (Shanghai, China).離子交換柱填料(DEAE sepharose)購自 SIGMA U. S. A. 4%-15% 梯度預(yù)制膠購自 Bio-radU. S. A.實(shí)施例1本發(fā)明重組LDH的制備一、重組基因工程菌的構(gòu)建1、目標(biāo)基因片段的制備(I)樣品采集在四川省阿壩縣與青海省交界處的高寒草原地區(qū)(位于青海省久治縣境內(nèi)，海拔 4015m)捕捉黑唇鼠兔，立即進(jìn)行解剖，取其睪丸組織放置于樣品保存液里，帶回成都進(jìn)行RNA提??；(2)鼠兔LDH-C基因ORF的克隆取鼠兔睪丸組織O. 5g,按照Trizol試劑說明書提取總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成。黑唇鼠兔屬于兔形目，鼠兔屬，在GenBank數(shù)據(jù)庫里沒有兔形目物種LDH-C基因的相關(guān)序列，故采用設(shè)計(jì)簡并引物的方法進(jìn)行克隆，正向引物剛好包含起始密碼子，這樣方便我們克隆全長0RF,設(shè)計(jì)的三條簡并引物序列如下D-Ps:5-atgtcmacygtcaaggagcagct—3;D-Pal:5_gcagayacabtgtaatcttttcc_3;D_Pa2:5—ttacarccacttccratyac-3用反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA作為模板，采用槽式PCR法克隆LDH-C基因的EST，第一輪PCR采用D-Ps和D-Pa2擴(kuò)增，第一輪PCR的產(chǎn)物取O. 5ul作為第二輪PCR的模板，所用引物為D-Ps和D-Pal。PCR產(chǎn)物電泳顯示一條260bp的條帶，克隆后送出測序，經(jīng)BLASTX分析，顯示我們得到了鼠兔LDH-C基因的EST。克隆得到LDH-C的EST后，我們根據(jù)EST序列設(shè)計(jì)了2條基因特異引物，然后采用3’ RACE技術(shù)克隆LDH-C基因的3’端，兩條基因特異引物為Pika-Psl:5_cttgcccttgttgatgttgcaga_3;Pika_Ps2:5-ggatcttcaacatggcagtct_30 第一輪PCR采用Pika-Psl和3’RACE Outer Primer，第一輪PCR的產(chǎn)物取出O. 5ul作為第二輪PCR的模板，所用引物為Pika-Ps2和3’RACE Inner Primer。第二輪PCR的產(chǎn)物經(jīng)電泳，膠回收，克隆至PMD18-T,送出測序,測序在上海Invitrogen公司完成。EST序列和RACE序列通過VectorNTI軟件進(jìn)行拼接,全長ORF通過引物ORF-Ps (5-ATGTCCACTGTCAAGGAGCAG-3)和ORF-Pa (5-TTAAAACACCAGGTCCTTCT-3)擴(kuò)增得到，該基因的核酸序列已錄入Genbank數(shù)據(jù)庫(登錄號⑶076486)。(3 )鼠兔LDH-C基因序列的優(yōu)化為了在E. coli中表達(dá)天然有活性的LDH-C4蛋白，鼠兔LDH-C基因ORF根據(jù)E. coli的密碼使用偏好性進(jìn)行了全面優(yōu)化，優(yōu)化后得ORF基因片段，序列如SEQ ID NO.1所示CATATGTCTACTGTGAAAGAACAGCTGATTGAAAACCTGATCGCGGAAGACAAAGCGTCTCAGTGCAAAATCACTATCGTTGGTACCGGTTCTGTTGGTATGGCGTGCGCGATCTGCATTCTGCTGAAAGATCTGGCGGATGAACTGGCGCTGGTGGACGTGGCAGAAGATAAGCTGAAAGGTGAAACCATGGACCTGCAGCACGGTAGCCTGTTTTTCTCTACCTCTAAGATCACTAGCGGCAAAGATTACACTGTGTCTGCAAACAGCAAACTGGTTATTGTGACCGCGGGTGCGCGTCAGCAGGAAGGTGAGGGTCGTCTGGCACTGGTGCAGCGTAACGTGACCATTATGAAAAGCATCATCCCGACCATTGTGCGTCATAGCCCGGATTGCAAGATGCTGATCGTGAGCAACCCGGTTGATATCCTGACCTATGTTGTGTGGAAAATTTCTGGTCTGCCGGCGTCTCGTGTTATCGGTTCAGGCTGCAACCTGGATTCTGCGCGTTTCCGCTACCTGATTGGTGAA
AAACTGGGCGTTCACCCGACTTCTTGCCATGGTTGGATCATCGGTGAACACGGTGACAGCTCTGTTCCGCTGTGGTC
TGGTGTGAACGTTGCAGGCGTGGCCCTGAAATCACTGCATCCGAAACTGGGTACCGATAGCGATAAAGAACAGTGGA
AGGTGATCCACAAACAGGTTGTTGAAAGCGCGTATGAAATTATCAAACTGAAAGGTTACACCTCTTGGGCGATTGGT
CTGTCTGTTACTGATCTGGCAGGCTCAATCCTGAAGAACCTGCGTCGTGTGCATCCGGTTAGCACTATGGTTAAAGG
CCTGTATGGCATCAAAGAAGAGATCTTCCTGTCTATCCCGTGTATCCTGGGTCGTAACGGTGTTAGCGACATCGTGA
AAGTTGCTCTGTCTCCGGAAGAGGAAGAACTGTTCAAAAAGTCTGCGAGCACTCTGTGGAACATCCAGAAAGATCTG
GTTTTCTAACTCGAG合成得到上述序列。
2、構(gòu)建重組表達(dá)載體用Nde I和Xhol分別將ORF基因片段和表達(dá)載體pET32a酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。將回收的ORF基因片段 和酶切后的載體片段進(jìn)行連接并克隆，通過PCR和酶切對重組表達(dá)載體進(jìn)行篩選，對陽性表達(dá)載體進(jìn)行測序以驗(yàn)證ORF的正確性。測序結(jié)果如圖1所示，說明構(gòu)建的重組pET32a載體含有SEQ ID NO.1所示目標(biāo)基因片段。3、工程菌的制備制備大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將重組pET32a-pika-LDH_C載體通過CaCl2法轉(zhuǎn)入細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)40min，然后將菌液涂布已倒好的LB選擇培養(yǎng)基平板(即加了 100ug/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基)，37°C過夜培養(yǎng)。挑取單菌落，進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 3所示，挑取的單菌落中含有IOOSbp的基因片段，說明本發(fā)明得到了含有目標(biāo)片段的工程菌。二、本發(fā)明重組LDH-C4的制備(—)制備方法1、大腸桿菌陽性轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)培養(yǎng)將陽性表達(dá)載體克隆接種到2mL含100ug/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，于37 °C培養(yǎng)，待吸光值A(chǔ)_為1. O時(shí)，離心去掉培養(yǎng)基，將細(xì)菌沉淀重懸到50mL LB培養(yǎng)基里(含100ug/ml的氨芐青霉素)，待吸光值4_為1.0時(shí)，離心去掉培養(yǎng)基，將細(xì)菌沉淀重懸到300mL LB培養(yǎng)基里(含100ug/ml的氨芐青霉素)，繼續(xù)培養(yǎng)到A600為O. 6，加入IPTG至終濃度為lmmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，于25°C振蕩培養(yǎng)IOh后，離心收集菌體，將細(xì)菌重懸于20mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7. O)，使用超聲波破碎后，于14000g離心，得上清。2、重組 LDH-C4 純化粗酶誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌離心收集菌體，重懸于20mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH7. O),超聲破碎(36x5s pulses with5s interval),超聲裂解液 14000g 離心 IOmin,上清為粗酶進(jìn)行native-PAGE和SDS-PAGE檢測(乳酸脫氫酶活性染色方法染液組分為乳酸鈉，NAD+,吩嗪N-甲硫酸鹽和硝基藍(lán)四氮唑，只有乳酸脫氫酶才能利用底物乳酸鈉和NAD，從而顯色)。藍(lán)膠親和柱層析粗酶50° C加熱IOmin, 14000g離心IOmin,上清用O. 45 μ m尼龍膜過濾，藍(lán)膠層析柱(IOXLOcm)先用binding buffer (20mmol/L磷酸鈉緩沖液ρΗ7· O)進(jìn)行平衡.將尼龍膜的過濾液全部上柱，柱子用3倍體積的binding buffer進(jìn)行洗滌后，再用IOOmL洗脫緩沖液(50mgNAD+，77mg丙酮酸鈉，20mM磷酸鈉緩沖液，pH7. O)。洗脫峰IOml每管進(jìn)行收集，通過native page (乳酸脫氫酶活性染色方法)進(jìn)行酶活性鑒定。DEAE離子交換柱層析DEAE離子交換柱(10 X1. Ocm)先用上述binding buffer進(jìn)行平衡，親和層析后有活性的部分混合后全部上柱，用binding buffer進(jìn)行洗滌，直接收集穿透峰，通過native PAGE (乳酸脫氫酶活性染色方法)進(jìn)行酶活性鑒定。 (二)檢測方法1、本發(fā)明重組LDH-C4分子量測定取步驟(一)制備得到的重組LDH-C4純品，通過SDS-PAGE電泳檢測亞基的分子量，通過毛細(xì)管電泳準(zhǔn)確檢測其亞基的分子量，通過質(zhì)譜分析，測定非變性條件下的分子量。2、酶活力的分析酶活性單位定義25° C條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化Iymol NAD+所需的酶量定義為I個(gè)酶活單位。正向酶活性測定體系包括100mM磷酸鈉緩沖液(pH7. 4),0. 15mMNADH,1. OmM丙酮酸鈉和一定量酶液(酶的用量為每分鐘AE34tl在O. 060-0. 070之間)，測定時(shí)間為3min。反向酶活性測定體系包括IOOmM glycine-NaOH緩沖液(ρΗΙΟ. 28)，1. OmMNAD+, IOOmM乳酸鈉和一定量酶液(酶的用量為每分鐘AE34tl為O. 040-0. 050)，測定時(shí)間為3min。取步驟(一)制備得到的粗品、熱處理后樣品、親和層析的洗脫液以及離子交換層 析后的流穿液按照該方法進(jìn)行酶活測定。3、酶的熱激活分析取步驟(一)制備得到的重組LDH-C4純品，在10°C _70°C溫度條件下，每隔5° C設(shè)一個(gè)測定點(diǎn)，按照上述的正向酶活性測定方法進(jìn)行活力測定。4、酶的熱穩(wěn)定性分析取步驟(一)制備得到的重組LDH-C4純品，分別在39. 9°C,51. 1°C,60. rc,61. 1°C,63. 7°C,65. 1°C，70°C溫度下進(jìn)行(T50min不同時(shí)間的熱處理，再14000g離心lOmin，然后按照上述的正向酶活性測定方法對熱處理后酶的殘留活力進(jìn)行測定。5、最適pH檢測取步驟(一)制備得到的重組LDH-C4純品，甘氨酸-鹽酸(Glycine-HCl)或甘氨酸-氫氧化鈉(glycine-NaOH)分別是正向反應(yīng)和反向反應(yīng)的測定緩沖液,對正向反應(yīng),所用緩沖液的 pH 為 4. 21, 5. 35, 6. 22, 7. O, 7. 48, 8. 48, 9. 45, 10. 13, andll. 24,酶濃度為10. 2ug/mL;對反向反應(yīng)，所用緩沖液的 pH 為 6. 63，7. 5,8. 06,8. 67,9. 17,9. 76，10. 11，10. 28，11. 2，andl2. 46，酶濃度為51ug/mL，進(jìn)行酶活測定。(三)檢測結(jié)果(I)乳酸脫氫酶活性染色結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)化了空載pET32a質(zhì)粒的大腸桿菌的粗提液中無乳酸脫氫酶，本發(fā)明粗提液、熱處理后的上清、親和層析的洗脫液、離子交換后的穿透液中均含有乳酸脫氫酶，其中，離子交換后的穿透液為乳酸脫氫酶純品。(2)分子量SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示其亞基的分子約35KD，毛細(xì)管電泳顯示其亞基的分子量為36kD，經(jīng)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)非變性條件下重組蛋白的相對分子量為144kD，說明重組蛋白為四聚體，即LDH-C4。(3)酶活如表I所示，本發(fā)明重組LDH-C4的酶活如表I所示表I鼠兔LDH-C4的純化表
權(quán)利要求
1.SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一種重組載體，其特征在于它包括SEQ ID NO.1或所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于它是pET32a重組載體。
4.一種重組菌，其特征在于它包括權(quán)利要求2或者3所述的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于它為重組大腸桿菌。
6.一種制備重組蛋白的方法，其特征在于它包括如下步驟(1)取權(quán)利要求4或者5所述的重組菌，在大腸桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)，得菌液， 離心，得菌體；(2)取步驟(I)所得菌體，超聲裂解，離心，得上清，上清分離純化，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(I)所述重組菌是在含有氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，誘導(dǎo)表達(dá)使用的誘導(dǎo)劑為IPTG，誘導(dǎo)溫度為25°C，誘導(dǎo)時(shí)間為IOh0
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(2)所述分離純化采用藍(lán)膠親和柱層析與離子交換層析。
9.權(quán)利要求61任意一項(xiàng)所述方法制備的重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，以及包含該核苷酸序列的重組載體和重組菌；本發(fā)明還公開了用該重組菌表達(dá)乳酸脫氫酶C4的方法，以及該方法制得的乳酸脫氫酶C4。本發(fā)明重組乳酸脫氫酶C4活性高，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/21GK102994525SQ20121057905
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者張慶蓮, 賀慶華 申請人:成都醫(yī)學(xué)院