專利名稱：穩(wěn)定的多肽組合物的制作方法
穩(wěn)定的多肽組合物本申請是申請日為2007年03月19日、中國申請?zhí)枮?00780017774.3、發(fā)明名稱為“穩(wěn)定的多肽組合物”的發(fā)明申請的分案申請。相關(guān)申請本申請要求享有以下美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，其每一篇為所有目的而全文納入本文參考:I)美國臨時專利申請60/783，622號，其提交于2006年3月17日，其名稱為“穩(wěn)定化的多肽和用于評估和增加其穩(wěn)定性的方法”；2)美國臨時專利申請60/812,688號，其提交于2006年6月9日，其名稱為“穩(wěn)定化的多肽和用于評估和增加其穩(wěn)定性的方法”；3)美國臨時專利申請60/873，502號，其提交于2006年12月8日，其名稱為“用于評估和增強(qiáng)多肽生物物理性質(zhì)的方法”;和4)美國臨時專利申請60/873，996號，其提交于2006年12月8日，其名稱為“穩(wěn)定化的多肽組合物”。本說明書中引用的任何專利、專利申請、和參考文獻(xiàn)的內(nèi)容都全文納入本文參考。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性被認(rèn)為是蛋白質(zhì)(如，抗體分子)開發(fā)和升級的中心議題?？贵w的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列處在選擇壓力之下，其序列可在不同抗體之間有顯著差別(Wu和Kabat，1970)。在人基因 組內(nèi)嵌有大量功能性胚系可變重鏈Γ40 ；Tomlinson等，1992 ；Tomlinson 等，1994 ；Matsuda 和 Honjo, 1996)、可變 κ 鏈( 40 ；Meindl 等，1989 ；Cox 等，1994 ;Barbie 和 Lefranc, 1998)和可變 λ 鏈( 30 ;Williams 等，1996 ;Kawasaki,等，1997)基因。免疫系統(tǒng)產(chǎn)生許多重鏈和輕鏈可變區(qū)胚系組合的能力是產(chǎn)生抗體多樣性的一種機(jī)制(Edelman, 1959 ;Fraftek, 1961)。其它多樣性源自在可變區(qū)和恒定結(jié)構(gòu)域之間插入可變連接肽區(qū)域——J-連接肽(加上重鏈的D-連接肽)(Leder，1982)。選擇抗特定抗原的胚系抗體，接著，表達(dá)單一抗體(所述抗體帶有所選擇的可變區(qū)胚系和(D-)J-連接肽)的B細(xì)胞在可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域內(nèi)進(jìn)行超體細(xì)胞突變(hypersomatic)過程,從而增加針對抗原的抗體親和性(Leder, 1982 ;Tomlinson等，1996)。在可變區(qū)內(nèi)也經(jīng)?？捎^察到超體細(xì)胞插入或缺失，然而其比超體細(xì)胞突變頻率低得多(de Wildt等，1999)。因而，抗特定抗原而加以選擇的成熟的抗體將具有高度獨特的可變區(qū)序列，不必對其穩(wěn)定性進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)在多種細(xì)胞系統(tǒng)中(如在細(xì)菌或哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中)表達(dá)時,穩(wěn)定性差可影響抗體或抗體結(jié)構(gòu)域適當(dāng)折疊的能力。錯誤折疊或穩(wěn)定性不良也可導(dǎo)致部分非功能性材料群體(Martsev等，1998)和/或有形成大的可溶聚集體傾向的抗體,所述聚集體在用于治療時有潛在危險或有免疫原性。其他穩(wěn)定性問題包括重折疊受阻、降解、親合性削弱、聚集，或儲存后喪失活性。穩(wěn)定性問題不限于天然產(chǎn)生的抗體，也可發(fā)生在基因工程化的抗原結(jié)合分子中，例如用于生產(chǎn)和臨床目的的重組抗體文庫(Hoogenboom，2005)、抗體片段(Holt等，2003 ；Todorovska 等，2001 ;Worn 和 Pliickthun, 2001 ;Reiter 和 Pastan, 1996)和基因工程化的或人源化的治療性抗體(Ewert等,2004 ；Carter和Merchant, 1997)。另外，多價形式的抗體(如雙特異性分子)可有穩(wěn)定性的問題。盡管雙特異性抗體因其能用于人的治療所以是所希望的，但是其生產(chǎn)是不可預(yù)測的。例如，雙特異性抗體可導(dǎo)致熱穩(wěn)定性、產(chǎn)品產(chǎn)量的實質(zhì)性減少，或?qū)е滦纬傻头肿恿烤奂w。在人源化嚙齒動物抗體時，也可出現(xiàn)Vh和'結(jié)構(gòu)域的非天然改變。通常將嚙齒動物互補決定區(qū)(CDR)移植到最相似的人胚系可變區(qū)上來進(jìn)行人源化(Hurle和Gross，1994)。被選擇來進(jìn)行人源化的胚系不可能以高頻率地被免疫系統(tǒng)所使用，而且為獲得足夠的抗原結(jié)合性經(jīng)常需要改變?nèi)丝蚣?。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定會產(chǎn)生許多問題，包括以下的一個或多個:不適合在生物反應(yīng)器中規(guī)模化生產(chǎn)(例如因為產(chǎn)量低，不需要的副產(chǎn)品(如未組裝的產(chǎn)物和/或聚集材料)的水平顯著高)，蛋白質(zhì)難以純化，和不適于藥物制備和使用(如，由于分解產(chǎn)物的水平顯著高、產(chǎn)品質(zhì)量差、和/或藥物動力學(xué)性質(zhì)不良)?？贵w、Fab、Fv、或單鏈Fv(ScFv)的可變區(qū)內(nèi)的不穩(wěn)定性可導(dǎo)致這些問題中的許多問題。scFv構(gòu)建體尤其已顯示出穩(wěn)定性、溶解性、表達(dá)、聚集、分解產(chǎn)物、和在細(xì)菌和哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中整體可制造性的問題(參見Worn和Pluckthun, 2001)。另外，將scFv分子整合入原本穩(wěn)定的重組抗體產(chǎn)物中，經(jīng)常給新的重組設(shè)計帶來這些通常不需要的特性。因此，需要預(yù)測蛋白質(zhì)(如抗體)穩(wěn)定性的改進(jìn)方法和對于適于規(guī)?；a(chǎn)的改進(jìn)的穩(wěn)定化抗原結(jié)合分子。也需要一些改進(jìn)的方法，以規(guī)模化生產(chǎn)適于藥物應(yīng)用的穩(wěn)定化的抗原結(jié)合分子群。發(fā)明簡述本發(fā)明至少部分基于開發(fā)改進(jìn)的多肽組合物(如改進(jìn)的結(jié)合分子)和制備它們的方法，所述多肽組合物包括穩(wěn)定性改善的scFv分子,或由穩(wěn)定性改善的scFv分子組成。

在一個方面，本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的scFv分子群，其中穩(wěn)定化的scFv分子包含:i)插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭，其中Vh和\結(jié)構(gòu)域由Vh結(jié)構(gòu)域中的氨基酸和\結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中scFv分子的Vh和\結(jié)構(gòu)域具有大于55° C的Tm值；或ii)插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭，其中乂11和\結(jié)構(gòu)域由Vh中的氨基酸和\結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中scFv分子具有大于49° C的
丁50°在另一個方面，本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的scFv分子，其中穩(wěn)定化的scFv分子包含:i) scFv接頭，其具有插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中Vh和\結(jié)構(gòu)域由Vh氨基酸44位和\氨基酸100位之間的二硫鍵連接；ii) Vh結(jié)構(gòu)域和'結(jié)構(gòu)域，其中該分子具有至少一個替換，所述替換選自由如下組成的組:a)在VH的Kabat 13位上進(jìn)行氨基酸替換；b)在VH的Kabat 16位上進(jìn)行氨基酸替換；c)在VL的Kabat 46位上進(jìn)行氨基酸替換；d)在VL的Kabat 49位上進(jìn)行氨基酸替換；e)在VL的Kabat 50位上進(jìn)行氨基酸替換；
f)在VL的Kabat 49和50位上進(jìn)行氨基酸替換；g)在VH的Kabat 101位上進(jìn)行氨基酸替換；h)在VH的Kabat 20位上進(jìn)行氨基酸替換；i)在VH的Kabat 48位上進(jìn)行氨基酸替換；j)在VL的Kabat 3位上進(jìn)行氨基酸替換；k)在VH的Kabat 55位上進(jìn)行氨基酸替換；I)在VH的Kabat 67位上進(jìn)行氨基酸替換；m)在VH的Kabat 6位上進(jìn)行氨基酸替換；η)在VH的Kabat 32位上進(jìn)行氨基酸替換；ο)在VH的Kabat 49位上進(jìn)行氨基酸替換；P)在VH的Kabat 43位上進(jìn)行氨基酸替換；q)在VH的Kabat 72位上進(jìn)行氨基酸替換；r)在VH的Kabat 79位上進(jìn)行氨基酸替換；s)在VL的Kabat 50位上進(jìn)行氨基酸替換；t)在VL的Kabat 75位上進(jìn)行氨基酸替換；
`
u)在VH的Kabat 80位上進(jìn)行氨基酸替換；V)在VH的Kabat 83位上進(jìn)行氨基酸替換；或iii)在scFv的VH和VL之間帶有穩(wěn)定界面的Vh結(jié)構(gòu)域和Vlj結(jié)構(gòu)域,其中所述分子在直接位于界面內(nèi)的氨基酸位置上和/或在支撐VH和VL間相互作用的氨基酸位置上具有至少一個替換，其中所述至少一個氨基酸位置選自由如下所組成的組:按照Kabat編號的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L,79L,85L,98L, 58L, 74L, 77L,83L，89L，和104L，而且其中該穩(wěn)定化的scFv分子的T5tl大于沒有經(jīng)過替換的scFv分子的
丁50°在另一個方面，本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的scFv分子，其包含插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的(Gly4Ser)4ScFv接頭，其中V1^P \結(jié)構(gòu)域由Vh中的氨基酸和\中的氨基酸間的二硫鍵連接。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及包含￥11結(jié)構(gòu)域和'結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定化的scFv分子，其中該分子具有至少一組選自由如下所組成的組的替換:a)在VH的Kabat 16位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；和在VL的Kabat 46位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用賴氨酸；b)在VH的Kabat 16位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用賴氨酸；和在VH的Kabat 55位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用甘氨酸；和c)在VH的Kabat 16位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用賴氨酸；在VH的Kabat 55位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用甘氨酸；和在VH的Kabat 101位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用天冬氨酸。在另一個具體實施方式
中，穩(wěn)定化的scFv分子具有在熱攻擊條件下與常規(guī)Fab片段相等的穩(wěn)定性。在一個具體實施方式
中，穩(wěn)定性通過測量結(jié)合靶分子的能力而測量。在一個具體實施方式
中，scFv分子包含氨基酸序列，其由選自由SEQ IDNO:9、14、16、和18組成的組的核苷酸序列編碼。在一個具體實施方式
中，scFv分子包含選自由SEQ ID NO: 10、15、17、和19組成的
組的氨基酸序列。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及包含穩(wěn)定化的scFv分子的融合蛋白。在一個具體實施方式
中，融合蛋白包含至少2個抗原結(jié)合位點。在另一個方面，本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的多價抗原結(jié)合分子群，其中穩(wěn)定化的結(jié)合分子包含至少一個穩(wěn)定化的scFv分子,所述穩(wěn)定化的scFv分子包含插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭，其中Vh和\結(jié)構(gòu)域由二硫鍵連接，所述二硫鍵位于Vh中的氨基酸和'結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間，而且其中穩(wěn)定化的結(jié)合分子群包含單體形式的可溶蛋白，其中不超過10%以聚集形式呈現(xiàn)。在一個具體實施方式
中，穩(wěn)定化的多價抗原結(jié)合分子在CHO或NSO細(xì)胞中表達(dá)。在另一個方面，本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的多價抗原結(jié)合分子群，其中每個多價抗原結(jié)合分子包含:i)至少一個scFv分子,其包含插入Vh結(jié)構(gòu)域和Vlj結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭,其中Vh和\結(jié)構(gòu)域由Vh中的氨基酸和\結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中至少一個scFv分子的Vh和\結(jié)構(gòu)域 具有大于55° C的Tm值；或ii)至少一個scFv分子,其包含插入Vh結(jié)構(gòu)域和Vlj結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭,其中V1^P \結(jié)構(gòu)域由Vh中的氨基酸和\結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中多價抗原結(jié)合分子的至少一個scFv分子具有大于49° C的T5(l。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的多價抗原結(jié)合分子，其包含:i)至少一個穩(wěn)定化的scFv分子,其中穩(wěn)定化的scFv分子包含插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的(Gly4Ser)n scFv接頭,而且其中Vh和Vlj結(jié)構(gòu)域由二硫鍵連接；ii)至少一個穩(wěn)定化的scFv分子,其包含具有插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列(Gly4Ser)n的scFv接頭，其中Vh和\結(jié)構(gòu)域由Vh第44位氨基酸和\第100位氨基酸之間的二硫鍵連接；iii)至少一個穩(wěn)定化的scFv分子,其中該穩(wěn)定化的scFv分子包含至少一個選自由如下所組成的組的替換:a)在VH的Kabat 13位上進(jìn)行氨基酸替換；b)在VH的Kabat 16位上進(jìn)行氨基酸替換；c)在VL的Kabat 46位上進(jìn)行氨基酸替換；d)在VL的Kabat 49位上進(jìn)行氨基酸替換；e)在VL的Kabat 50位上進(jìn)行氨基酸替換；f)在VL的Kabat 49和50位上進(jìn)行氨基酸替換；g)在VH的Kabat 101位上進(jìn)行氨基酸替換；h)在VH的Kabat 20位上進(jìn)行氨基酸替換；i)在VH的Kabat 48位上進(jìn)行氨基酸替換；
j)在VL的Kabat 3位上進(jìn)行氨基酸替換；k)在VH的Kabat 55位上進(jìn)行氨基酸替換；I)在VH的Kabat 67位上進(jìn)行氨基酸替換；m)在VH的Kabat 6位上進(jìn)行氨基酸替換；η)在VH的Kabat 32位上進(jìn)行氨基酸替換；ο)在VH的Kabat 49位上進(jìn)行氨基酸替換；P)在VH的Kabat 43位上進(jìn)行氨基酸替換；q)在VH的Kabat 72位上進(jìn)行氨基酸替換；r)在VH的Kabat 79位上進(jìn)行氨基酸替換；s)在VL的Kabat 50位上進(jìn)行氨基酸替換；t)在VL的Kabat 75位上進(jìn)行氨基酸替換；u)在VH的Kabat 80位上進(jìn)行氨基酸替換；V)在VH的Kabat 83位上進(jìn)行氨基酸替換；或iv) Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域，其帶有位于scFv的VH和VL之間的穩(wěn)定界面,其中該分子在直接位于界面內(nèi)的氨基酸位置上和/或在支撐VH和VL間相互作用的氨基酸位置上具有至少一個替換，其中該 至少一個氨基酸位置選自由如下所組成的組:按照Kabat編號的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L,79L,85L,98L,58L,74L,77L,83L，89L，和 104L。在另一個方面，本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的多價抗原結(jié)合分子，其包含至少一個穩(wěn)定化的scFv分子，所述穩(wěn)定化的scFv分子包含插入Vh結(jié)構(gòu)域和Vlj結(jié)構(gòu)域之間的(Gly4Ser)4ScFv接頭,其中Vh和\結(jié)構(gòu)域由二硫鍵連接,所述二硫鍵位于Vh中的氨基酸和'結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間。ii)至少一個穩(wěn)定化的scFv分子,其包含scFv接頭,所述接頭具有插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中V1^P \結(jié)構(gòu)域由二硫鍵連接，所述二硫鍵位于Vh44位氨基酸和'100位氨基酸之間；或iii)至少一個穩(wěn)定化的scFv分子,其中該穩(wěn)定化的scFv分子包含至少一個選自由如下所組成的組的替換:a)替換在VL的Kabat 3位上的氨基酸(如，谷氨酰胺)，例如用丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、或甘氨酸；b)替換在VL的Kabat 46位上的氨基酸(如，絲氨酸)，例如用亮氨酸；c)替換在VL的Kabat 49位上的氨基酸(如，絲氨酸)，例如用酪氨酸或絲氨酸；d)替換在VL的Kabat 50位上的氨基酸(如，絲氨酸或纈氨酸)，例如用絲氨酸、蘇氨酸、和精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、或賴氨酸；e)分別用酪氨酸和絲氨酸；酪氨酸和蘇氨酸；酪氨酸和精氨酸；酪氨酸和甘氨酸；絲氨酸和精氨酸；或絲氨酸和賴氨酸替換在VL的Kabat 49位上的氨基酸(如，絲氨酸)和Kabat 50位上的氨基酸(如，絲氨酸)；f)替換在VL的Kabat 75位上的氨基酸(如，纈氨酸)，例如用異亮氨酸；g)替換在VL的Kabat 80位上的氨基酸(如，脯氨酸)，例如用絲氨酸或甘氨酸；
h)替換在VL的Kabat 83位上的氨基酸(如，苯丙氨酸)，例如用絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、或蘇氨酸；i)替換在VH的Kabat 6位上的氨基酸(如，谷氨酸)，例如用谷氨酰胺；j)替換在VH的Kabat 13位上的氨基酸(如，賴氨酸)，例如用谷氨酸；k)替換在VH的Kabat 16位上的氨基酸(如，絲氨酸)，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；I)替換在VH的Kabat 20位上的氨基酸(如，纈氨酸)，例如用異亮氨酸；m)替換在VH的Kabat 32位上的氨基酸(如，天冬酰胺)，例如用絲氨酸；η)替換在VH的Kabat 43位上的氨基酸(如，谷氨酰胺)，例如用賴氨酸或精氨酸；ο)替換在VH的Kabat 48位上的氨基酸(如，甲硫氨酸)，例如用異亮氨酸或甘氨酸；P)替換在VH的Kabat 49位上的氨基酸(如，絲氨酸)。例如用甘氨酸或丙氨酸；q)替換在VH的Kabat 55位上的氨基酸(如，纈氨酸)，例如用甘氨酸；r)替換在VH的Kabat 67位上的氨基酸(如，纈氨酸)，例如用異亮氨酸或亮氨酸；S)替換在VH的Kabat 72位上的氨基酸(如，谷氨酸)，例如用天冬氨酸或天冬酰胺；t)替換在VH的Kabat 79`位上的氨基酸(如，苯丙氨酸)，例如用絲氨酸、纈氨酸、或酪氨酸；和u)替換在VH的Kabat 101位上的氨基酸(如，脯氨酸)，例如用天冬氨酸。在另一個方面，本發(fā)明涉及多價抗原結(jié)合分子，其包含至少一個穩(wěn)定化的scFv分子，其中該穩(wěn)定化的scFv分子包含至少一組選自由如下所組成的組的替換:a)在VH的Kabat 16位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；和在VL的Kabat 46位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用賴氨酸；b)在VH的Kabat 16位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用賴氨酸；和在VH的Kabat 55位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用甘氨酸；和c)在VH的Kabat 16位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用賴氨酸；在VH的Kabat 55位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用甘氨酸；和在VH的Kabat 101位上進(jìn)行氨基酸替換，例如用天冬氨酸。在一個具體實施方式
中，至少一個穩(wěn)定化的scFv分子是通過基因工程與抗體融合的。在另一個具體實施方式
中，兩個穩(wěn)定化的scFv分子是通過基因工程與抗體融合的。在一個具體實施方式
中，至少一個穩(wěn)定化的scFv分子是通過基因工程與抗體輕鏈或重鏈的羧基末端融合。在一個具體實施方式
中，至少一個穩(wěn)定化的scFv分子通過基因工程與抗體輕鏈或重鏈的氨基末端融合。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明結(jié)合分子包含至少一個結(jié)合位點，該位點結(jié)合優(yōu)先在癌細(xì)胞上表達(dá)的分子。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的scFv分子Vh結(jié)構(gòu)域源自BHAlO抗體。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的scFv分子'結(jié)構(gòu)域源自BHAlO抗體。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少一個結(jié)合位點，該位點特異于選自由下列所組成的組的分子:HER1，HER3，CD80，CD86，PD_1，CTLA4，B7-H4, RON, CD200，CD4, BAF R, EGFR, IGFR, VEGFR，受體 TNF 家族的成員，Tie 受體，MET, IGFl, IGF2, TNF，TNF配體，IL-6, TWEAK, Fnl4, CD20, CD23, CRIPTO, HGF，α 4β I 整聯(lián)蛋白，α 5β I 整聯(lián)蛋白，α6β4整聯(lián)蛋白，和ανβ6整聯(lián)蛋白。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少一個結(jié)合位點，該位點結(jié)合參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的分子。在一個具體實施方式
中，所述分子是Fe受體。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少一個結(jié)合位點，該位點結(jié)合參與調(diào)節(jié)血管生成的分子。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的所述結(jié)合分子結(jié)合VEGF或血管生成素(angiopoitin)。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少一個結(jié)合位點，該位點結(jié)合神經(jīng)學(xué)上的靶。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的結(jié)合分子是多特異性的。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的結(jié)合分子是雙特異性的。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合TNF受體家族的兩個成員。在一個具體實施方式
中，本 發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合LTiiR和Trail R2。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的結(jié)合分子包括通過基因工程方法與14A2抗體融合的BHAlOscFv分子。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含具有下述序列的重鏈，所述序列選自由 SEQ ID NO:33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ IDNO:51, SEQ ID NO:53，和 SEQ IDNO:55 所組成的組。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含編碼下文項4_8、11、12、和18_22之任一的分子的多肽的核苷酸序列。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及含核苷酸序列的核酸分子，該核苷酸序列編碼穩(wěn)定化的scFv分子或編碼含本發(fā)明的穩(wěn)定化的scFv分子的結(jié)合分子。在一個具體實施方式
中，核酸分子在載體中。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及包含這種載體的宿主細(xì)胞。在一個具體實施方式
中，宿主細(xì)胞是哺乳動物宿主細(xì)胞，如CHO細(xì)胞或NSO細(xì)胞。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及結(jié)合分子的群體，所述結(jié)合群體含scFv分子，該群體的聚集度與表達(dá)含常規(guī)scFv分子的結(jié)合分子群體的宿主細(xì)胞相比至少低10%。在一個方面,本發(fā)明涉及產(chǎn)生穩(wěn)定化的結(jié)合分子的方法,包括在能產(chǎn)生穩(wěn)定化的結(jié)合分子的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。在一個具體實施方式
中，每升宿主細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)生至少IOmg穩(wěn)定化的結(jié)合分子，而且其中以聚集形式呈現(xiàn)的結(jié)合分子不超過10%。在一個方面，本發(fā)明涉及治療會受益于用本發(fā)明的結(jié)合分子治療的受試者的方法，包括向受試者施用結(jié)合分子，以使所述治療發(fā)生。在一個具體實施方式
中，受試者患有選自由下列所組成的組的疾病或病癥:癌癥、自身免疫性疾病或病癥、和神經(jīng)學(xué)上的疾病或病癥。
在一個方面,本發(fā)明涉及穩(wěn)定化scFv分子的方法,其包括用(Gly4Ser)nScFv接頭通過基因工程方法融合Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域，并基因工程化Vh結(jié)構(gòu)域以在44位氨基酸上包含半胱氨酸，和基因工程化' 結(jié)構(gòu)域以在100位氨基酸上包含半胱氨酸，從而形成穩(wěn)定化的scFv分子。在一個方面，本發(fā)明涉及制備包含穩(wěn)定化的scFv分子的穩(wěn)定化的多價抗體的方法，該方法包括通過基因工程方法將穩(wěn)定化的scFv分子與抗體分子輕鏈或重鏈的氨基末端或羧基末端融合。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及制備穩(wěn)定化的scFv分子的方法，包括替換在scFv分子的VH/VL界面中的至少一個氨基酸和/或支撐scFv分子的VH/VL界面的至少一個氨基酸。與常規(guī)scFv分子相比，所述一個或多個替換同時改善scFv分子VH和VL結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定性。在又一具體實施方式
中，本發(fā)明涉及制備穩(wěn)定化的scFv分子的方法，包括替換在VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域中至少一個與VH和VL結(jié)構(gòu)域之間界面上的兩個或多個氨基酸共變(covary)的氨基酸。在又一具體實施方式
中，本發(fā)明涉及制備含scFv分子的穩(wěn)定化的融合蛋白分子的方法，包括替換在scFv分子的VH/VL界面中的至少一個氨基酸和/或替換在scFv分子的VH/VL支架(scaffold)中的至少一個氨基酸，并通過基因工程方法將scFv分子與多肽融合，由此制備穩(wěn)定化的融合蛋白。

在又一具體實施方式
中，本發(fā)明涉及改善含至少一個scFv分子的多價分子的穩(wěn)定性的方法，該方法包括將至少一個穩(wěn)定化突變導(dǎo)入所述至少一個scFv分子中，由此改善多價分子的穩(wěn)定性。在又一具體實施方式
中，本發(fā)明涉及改善scFv分子的穩(wěn)定性的方法，該方法包括將至少一個穩(wěn)定化突變導(dǎo)入scFv分子中，由此改善scFv分子的穩(wěn)定性。在又一方面，本發(fā)明涉及大規(guī)模制備穩(wěn)定化的融合蛋白的方法，該方法包括:(a)進(jìn)行scFv分子的熱穩(wěn)定性測試以確定候選scFv分子的熱穩(wěn)定性；(b)將候選scFv分子的熱穩(wěn)定性與合適對照比較，以鑒定與對照相比熱穩(wěn)定性增加的穩(wěn)定化scFv分子，(c)選擇步驟(b)中鑒定出的穩(wěn)定化的scFv分子；(d)通過基因工程方法將至少一個穩(wěn)定化的scFv分子與蛋白質(zhì)融合，以形成穩(wěn)定化的融合蛋白；(e)用帶有編碼穩(wěn)定化的融合蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)染哺乳動物宿主細(xì)胞，(g)在能使穩(wěn)定化的融合蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟(f)的宿主細(xì)胞；其中當(dāng)在IOL或更大的培養(yǎng)基中生長時，穩(wěn)定化的融合蛋白被表達(dá)后蛋白質(zhì)聚集不超過10%。在又一方面，本發(fā)明涉及從含候選氨基酸序列的免疫球蛋白(Ig)超家族多肽中確定蛋白質(zhì)折疊的熱穩(wěn)定性的方法，該方法包括以下步驟:a)提供序列的輔助參考集(curated reference set)的比對,所述序列與多肽的Ig折疊對應(yīng)；b)計算比對的序列氨基酸殘基之間的共變(covariation),以產(chǎn)生出共變數(shù)據(jù)；
c)從共變數(shù)據(jù)內(nèi)的共變中確定候選序列內(nèi)氨基酸位置的序列位置特異性共變評分；和d)儲存或輸出氨基酸位置特異性序列共變評分以作為多肽穩(wěn)定性量度。在一個具體實施方式
中，對于數(shù)種免疫球蛋白(Ig)超家族多肽，該方法包括至少重復(fù)步驟c)和d)。在又一具體實施方式
中，基于候選序列的序列位置特異性共變評分，該方法進(jìn)一步包括從數(shù)種免疫球蛋白(Ig)超家族多肽中選出用于生產(chǎn)的Ig超家族多肽的步驟。 在另一個具體實施方式
中，該方法進(jìn)一步包括生產(chǎn)所選擇的Ig超家族多肽和為治療用途而制備它的步驟。在另一個具體實施方式
中，Ig超家族多肽源自選自由下列所組成的組的蛋白質(zhì):免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段、免疫球蛋白受體、細(xì)胞粘附蛋白、整聯(lián)蛋白、過敏原、T-細(xì)胞受體、和主要組織相容性復(fù)合物(MHC)。在一個具體實施方式
中，Ig超家族多肽選自由重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(')、和單鏈抗體(scFv)所組成的組。在另一個具體實施方式
中，Ig折疊選自由V類折疊、I類折疊、Cl類折疊、和C2類折疊所組成的組。在一個具體實施方式
中，輔助參考集或比對具有至少50%的多樣性。在一個具體實施方式
中，比對中的每個序列與比對中的其它每個序列具有小于90%的同一性。在另一個具體實施方式
中，至少一個序列來自哺乳動物物種，而且至少一個序列來自非哺乳動物物種。在一個具體實施方式
中，對于在比對的相應(yīng)位置上找到的令人滿意的正共變，候選序列被賦予殘基位置特異性共變正評分。在一個具體實施方式
中，對于在比對的相應(yīng)位置上找到的令人滿意的負(fù)共變，候選序列被賦予殘基位置特異性共變負(fù)評分。在一個具體實施方式
中，正共變的Φ關(guān)聯(lián)系數(shù)(phi association coefficient)(Φ)約 +0.25 至約 +1.0。在一個具體實施方式
中，負(fù)共變的Φ關(guān)聯(lián)系數(shù)(Φ)約-0.25至約-1.0。在一個具體實施方式
中，比對選自由下列所組成的組:基于結(jié)構(gòu)的序列比對、基于序列的序列比對、和基于結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)比對。在一個具體實施方式
中，確定比對中每個殘基位置上的所有可能殘基對的位置特異性共變評分。在一個具體實施方式
中，比對通過如下來獲得:(i)由初始比對產(chǎn)生隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model, HMM) ；(ii)用HMM獲得其他序列；和(iii)將其他序列與初始比對進(jìn)行比對。在一個方面，本發(fā)明涉及計算機(jī)程序或計算機(jī)程序產(chǎn)品或計算機(jī)可讀介質(zhì)，其具有處理器可執(zhí)行指令集，當(dāng)執(zhí)行時，所述指令集使處理器進(jìn)行本發(fā)明的方法。 在又一具體實施方式
中，本發(fā)明涉及適用于電子設(shè)備中的計算機(jī)程序或計算機(jī)程序產(chǎn)品或計算機(jī)可讀介質(zhì)，其包括對應(yīng)于本發(fā)明方法的比對的數(shù)據(jù)。
在又一具體實施方式
中，本發(fā)明涉及適用于電子設(shè)備中的計算機(jī)程序或計算機(jī)程序產(chǎn)品或計算機(jī)可讀介質(zhì)，其包括本發(fā)明方法的共變數(shù)據(jù)。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及被安排來執(zhí)行本發(fā)明方法的設(shè)備。在一個方面，本發(fā)明涉及計算設(shè)備中的系統(tǒng)，包括:(i)初始序列收集過程；(ii)能從下文項58-74之任一的比對中保存序列數(shù)據(jù)的儲存位置(storagelocation)；(iii)分析工具(analysis facility),其程序性地分析比對內(nèi)殘基對之間的共變以獲得共變數(shù)據(jù)；

(iv)與所述電子設(shè)備有交互界面的輸出設(shè)備，所述輸出設(shè)備輸出所述共變數(shù)據(jù)。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及計算設(shè)備中的介質(zhì)，其保存進(jìn)行包括本發(fā)明方法任何步驟的方法的可執(zhí)行步驟。在又一具體實施方式
中，對殘基使用頻率數(shù)據(jù)的顯示包括矩陣，其包括(i)對應(yīng)于多肽序列的連續(xù)殘基位置；和(ii)針對每個殘基位置上的殘基類型的殘基使用頻率。在又一具體實施方式
中，符號化描述殘基使用頻率。在一個具體實施方式
中，要表示所有20種天然氨基酸、缺口、和不明確的殘基。在一個具體實施方式
中，殘基使用頻率與符號大小相關(guān)。在一個具體實施方式
中，殘基使用頻率與符號大小正相關(guān)。在一個具體實施方式
中，(i)殘基位置以列顯示；和(ii)殘基使用頻率以行顯示。在另一個具體實施方式
中，共變殘基中的共變由網(wǎng)絡(luò)覆蓋圖來描述。在一個方面,本發(fā)明涉及圖形用戶界面(graphical user interface),包括用圖形顯示:(i)柵格布局(grid layout)，其包括多肽序列參考集的殘基使用頻率數(shù)據(jù)集；和(ii)共變覆蓋圖(covariation overlay) 在一個具體實施方式
中，界面進(jìn)一步包括:(iii)對感興趣的序列的顯示。在一個方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有改善的生物物理性質(zhì)的免疫球蛋白(Ig)超家族多肽的方法，所述方法包括以下步驟:a)提供對應(yīng)于多肽的Ig折疊的序列輔助參考集的比對；b)計算比對的序列殘基之間的共變以鑒定出共變的殘基；c)替換未能滿足與在比對的相應(yīng)位置上找到的共變殘基的共變的多肽殘基。在另一個具體實施方式
中，生物物理性質(zhì)選自由下列所組成的組:熱穩(wěn)定性、pH解折疊譜、糖基化的穩(wěn)定去除、溶解性、生化功能、和其組合。在一個具體實施方式
中，生化功能選自由蛋白質(zhì)靶或化學(xué)部分的識別所組成的組，該化學(xué)部分選自由磷酸、甲基、乙?；⒅?、去污劑、金屬離子、鹵素、RNA、DNA、寡核苷酸、和寡核苷所組成的組。在一個具體實施方式
中，Ig超家族多肽源自蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自由抗體或其抗原結(jié)合片段、免疫球蛋白受體、細(xì)胞粘附蛋白、整聯(lián)蛋白、過敏原、T-細(xì)胞受體、和主要組織相容性復(fù)合物(MHC)分子所組成的組。在一個具體實施方式
中，Ig超家族多肽選自由重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(')、和單鏈抗體(sFv)所組成的組。在一個具體實施方式
中，Ig折疊選自由V類折疊、I類折疊、Cl類折疊、和C2類折疊所組成的組。在另一個具體實施方式
中，Ig超家族多肽是修飾的抗體，所述修飾的抗體選自由結(jié)構(gòu)域抗體、人源化抗體、人抗體、非人單克隆抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、含scFv的抗體、和結(jié)構(gòu)域缺失的抗體所組成的組。在一個具體實施方式
中，共變的殘基是選自由二硫鍵、鹽橋、配體結(jié)合口袋或表面的一部分、和范德華網(wǎng)絡(luò)、氫鍵、和/或電荷-電荷相互作用所組成的組的結(jié)構(gòu)特征的一部分。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有改善的穩(wěn)定性的抗體或修飾的抗體的方法，所述方法包括以下步驟:a)提供經(jīng)實驗確認(rèn)為穩(wěn)定的模板抗體的高解析度結(jié)構(gòu)模型；b)用結(jié)構(gòu)模型鑒定模板抗體中的VH/VL界面和/或支撐界面的殘基；c)用同源模型鑒定抗體或修飾的抗體中對穩(wěn)定界面至關(guān)重要的相應(yīng)VH/VL界面殘基；和d)用來自模板蛋白質(zhì)的界面殘基替換抗體或修飾的抗體中的相應(yīng)VH/VL界面殘基。在一個具體實施方式
中，模板蛋白質(zhì)的界面殘基掩蓋(bury)該界面中至少10A2:的表面區(qū)域。在一個具體實施方式
中，修飾的抗體選自由單結(jié)構(gòu)域抗體、人源化抗體、人抗體、非人單克隆抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、含scFv的抗體、和結(jié)構(gòu)域缺失的抗體所組成的組。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的方法產(chǎn)生的多肽。在一個具體實施方式
中，多肽顯示出生物物理性質(zhì)有改善，所述生物物理性質(zhì)選自由熱穩(wěn)定性、PH解折疊譜、糖基化的穩(wěn)定去除、溶解性、生化功能、和其組合所組成的組。在一個具體實施方式
中，生化功能是配體結(jié)合親和性或特異性。在另一個方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生含穩(wěn)定化的scFv分子的文庫的方法，該方法包括:(a)提供對應(yīng)于scFv分子可變區(qū)序列的序列參考集；(b)鑒定可變區(qū)內(nèi)在參考集中相應(yīng)位置上缺失或以低頻率存在的氨基酸；和(c)將該信息與共變數(shù)據(jù)相組合，所述共變數(shù)據(jù)提示修飾參考集中以低頻率鑒定出的氨基酸可滿足可變區(qū)內(nèi)現(xiàn)有的共變限制；和(d)用候選穩(wěn)定化氨基酸替換步驟(b)的氨基酸，由此產(chǎn)生含穩(wěn)定化的scFv分子的文庫。在一個具體實施方式
中，步驟(b)的氨基酸具有小于0.5的共有(concensus)評分。在另一個具體實施方式
中，步驟(b)的氨基酸在參考集的序列中少于10%。在另一個具體實施方式
中，步驟(b)的氨基酸是非共有殘基。在一個具體實施方式
中，候選的穩(wěn)定化氨基酸在參考集內(nèi)相應(yīng)位置上被發(fā)現(xiàn)。在又一具體實施方式
中，候選的穩(wěn)定化氨基酸是共有氨基酸。
在一個具體實施方式
中，通過分析可變區(qū)序列的3-D結(jié)構(gòu)來鑒定候選的穩(wěn)定化氨基酸。在另一個具體實施方式
中，通過側(cè)鏈重包裝計算(side-chain repackingcalculation)來鑒定穩(wěn)定化氨基酸。
在又一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生穩(wěn)定化的scFv分子的方法，該方法包括:(a)提供根據(jù)下文項56的方法設(shè)計的scFv文庫，(b)用熱攻擊試驗篩選scFv文庫以鑒定候選scFv分子，(c)將scFv文庫的候選scFv分子的熱穩(wěn)定性與合適對照比較，由此，候選scFv分子的熱穩(wěn)定性相對于對照增加，則鑒定出作為穩(wěn)定化的scFv分子的候選scFv分子。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的方法鑒定出的穩(wěn)定化的scFv分子或含本發(fā)明穩(wěn)定化的scFv分子的融合蛋白。在另一個方面，本發(fā)明涉及預(yù)測候選蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的方法，所述候選蛋白質(zhì)含具有候選結(jié)構(gòu)域序列的氨基酸序列，該方法包括:(a)提供氣基酸序列參考集，其對應(yīng)于候選蛋白質(zhì)的候選結(jié)構(gòu)域序列；(b)確定在測試結(jié)構(gòu)域序列內(nèi)的各氨基酸位置上的殘基頻率以獲得共有評分；和(C)用共有評分預(yù)測候選蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，其中共有評分與候選蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性相關(guān)。在另一個方面，本發(fā)明涉及預(yù)測候選蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的方法，該方法包括:(a)提供序列參考集，其對應(yīng)于候選蛋白質(zhì)的測試結(jié)構(gòu)域序列；(b)確定在測試結(jié)構(gòu)域序列內(nèi)的各氨基酸位置上的殘基頻率以獲得共有評分；和(C)用共有評分預(yù)測候選蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，其中共有評分與候選蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性相關(guān)。在另一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及預(yù)測候選蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的方法，該方法包括:(a)提供序列參考集，其對應(yīng)于候選蛋白質(zhì)的測試結(jié)構(gòu)域序列；(b)確定在測試結(jié)構(gòu)域序列內(nèi)的氨基酸位置上的殘基頻率以獲得共有評分；(C)確定在參考集序列內(nèi)的相應(yīng)氣基酸位置上的殘基頻率以確定平均共有評分；(d)比較共有評分與平均共有評分以確定序列評分；和(e)用序列評分預(yù)測候選蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，其中共有評分與候選蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性直接相關(guān)。在又一具體實施方式
中，本發(fā)明涉及預(yù)測候選抗體或候選修飾的抗體的穩(wěn)定性的方法，該方法包括:(a)提供VH結(jié)構(gòu)域的序列參考集，其對應(yīng)于候選抗體或修飾的抗體的測試VH結(jié)構(gòu)域序列；(b)確定在測試VH結(jié)構(gòu)域序列內(nèi)的氨基酸位置上的殘基頻率以獲得共有評分；(c)確定在參考集序列內(nèi)的相應(yīng)氨基酸位置上的殘基頻率以確定平均共有評分；(d)比較共有評分與平均共有評分以確定序列評分；和(e)用序列評分預(yù)測候選抗體或修飾的抗體的穩(wěn)定性，其中共有評分與候選抗體或修飾的抗體的穩(wěn)定性直接相關(guān)。
在一個具體實施方式
中，參考集包含蛋白質(zhì)序列，所述蛋白質(zhì)序列來自帶有與候選蛋白質(zhì)類別相同的蛋白質(zhì)折疊的蛋白質(zhì)。在另一個具體實施方式
中，參考集包含直系同源序列(orthologous sequence)。在一個具體實施方式
中，參考集包含人序列，如人VH序列，諸如同一 Kabat類別的人VH序列。在一個具體實施方式
中，參考集包含人VH胚系序列。在一個具體實施方式
中，測試結(jié)構(gòu)域序列是候選蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域序列的一部分。在一個具體實施方式
中，確定測試序列每個位置的共有評分，以獲得總共有評分，其中總共有評分與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性相關(guān)。在另一個具體實施方式
中，用以下公式計算總共有評分:
權(quán)利要求
1.穩(wěn)定化ScFv分子群,其中所述穩(wěn)定化scFv分子包含 i)插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭，其中Vh和\結(jié)構(gòu)域由Vh結(jié)構(gòu)域中的氨基酸和\結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中scFv分子的Vh和\結(jié)構(gòu)域具有大于55° C的Tm值；或 )插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭，其中V1^P \結(jié)構(gòu)域由Vh中的氨基酸和\結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中scFv分子具有大于49° C的T5Q。
2.穩(wěn)定化scFv分子,其包含 i)具有插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列(Gly4Ser)n的scFv接頭，其中Vh和\結(jié)構(gòu)域由Vh位置44的氨基酸和\位置100的氨基酸之間的二硫鍵連接； ii)VH結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域，其中該分子具有至少一個選自由如下所組成的組的替換: a)在VH的Kabat位置13上替換氨基酸； b)在VH的Kabat位置16上替換氨基酸； c)在VL的Kabat位46上替換氨基酸； d)在VL的Kabat位置49上替換氨基酸； e)在VL的Kabat位置50上替換氨基酸； f)在VL的Kabat位置49和50上替換氨基酸； g)在VH的Kabat位置101上替換氨基酸； h)在VH的Kabat位置20上替換氨基酸； i)在VH的Kabat位置48上替換氨基酸； j)在VL的Kabat位置3上替換氨基酸； k)在Kabat位置55上替換氨基酸； I)在VH的Kabat位置67上替換氨基酸； m)在VH的Kabat位置6上替換氨基酸； η)在VH的Kabat位置32上替換氨基酸； O)在VH的Kabat位置49上替換氨基酸； P)在VH的Kabat位置43上替換氨基酸； q)在VH的Kabat位置72上替換氨基酸； r)在VH的Kabat位置79上替換氨基酸； s)在VL的Kabat位置50上替換氨基酸； t)在VL的Kabat位置75上替換氨基酸； u)在VH的Kabat位置80上替換氨基酸； V)在VH的Kabat位置83上替換氨基酸；或 iii)帶有位于scFv的VH和VL之間的穩(wěn)定化界面的Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域，其中該分子在直接位于所述界面內(nèi)的氨基酸位置上和/或在支撐VH和VL間相互作用的氨基酸位置上具有至少一個替換，其中該至少一個氨基酸位置選自由如下所組成的組:按照Kabat編號的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L, 79L, 85L, 98L, 58L, 74L, 77L,83L，89L，和 104L,而且其中該穩(wěn)定化scFv分子具有比缺少所述替換的scFv分子大的T5(l。
3.穩(wěn)定化多價抗原結(jié)合分子群，其中所述穩(wěn)定化結(jié)合分子包含至少一個穩(wěn)定化scFv分子，其包含插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭，其中Vh和\結(jié)構(gòu)域由Vh中的氨基酸和\結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中所述穩(wěn)定化結(jié)合分子群包含單體的可溶蛋白，這種蛋白中不超過10%以聚集形式呈現(xiàn)。
4.穩(wěn)定化多價抗原結(jié)合分子群，其中每個多價抗原結(jié)合分子包含 i)至少一個scFv分子,其包含插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭,其中Vh和Vl結(jié)構(gòu)域由Vh中的氨基酸和\結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中至少一個scFv分子的Vh和\結(jié)構(gòu)域具有大于55° C的Tm值；或 ii)至少一個scFv分子,其包含插入Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域之間的scFv接頭,其中Vh和\結(jié)構(gòu)域由Vh中的氨基酸和\結(jié)構(gòu)域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中多價抗原結(jié)合分子的至少一個scFv分子具有大于49° C的T5(l。
5.穩(wěn)定化多價抗原結(jié)合分子，其包含 i)至少一個穩(wěn)定化scFv分子,其包含插入Vh結(jié)構(gòu)域和Vlj結(jié)構(gòu)域之間的(Gly4Ser)nscFv接頭，而且其中V1^P \結(jié)構(gòu)域由二硫鍵連接； ii)至少一個穩(wěn)定化scFv分子,其包含scFv接頭,所述接頭具有插入Vh結(jié)構(gòu)域和Vlj結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中V1^P \結(jié)構(gòu)域由由Vh位置44的氨基酸和 '位置100的氨基酸之間的二硫鍵連接； iii)至少一個穩(wěn)定化scFv分子,其中該穩(wěn)定化scFv分子包含至少一個選自由如下所組成的組的替換: a)在VH的Kabat位置13上替換氨基酸； b)在VH的Kabat位置16置上替換氨基酸； c)在VL的Kabat位置46上替換氨基酸； d)在VL的Kabat位置49上替換氨基酸； e)在VL的Kabat位置50上替換氨基酸； f)在VL的Kabat位置49和50上替換氨基酸； g)在VH的Kabat位置101上替換氨基酸； h)在VH的Kabat位置20上替換氨基酸； i)在VH的Kabat位置48上替換氨基酸； j)在VL的Kabat位置3上替換氨基酸； k)在VH的Kabat位置55上替換氨基酸； I)在VH的Kabat位置67上替換氨基酸； m)在VH的Kabat位置6上替換氨基酸； η)在VH的Kabat位置3 2上替換氨基酸； O)在VH的Kabat位置49上替換氨基酸； P)在VH的Kabat位置43上替換氨基酸； q)在VH的Kabat位置72上替換氨基酸； r)在VH的Kabat位置79上替換氨基酸； s)在VL的Kabat位置50上替換氨基酸；t)在VL的Kabat位置75上替換氨基酸； u)在VH的Kabat位置80上替換氨基酸； V)在VH的Kabat位置83上替換氨基酸；或 iv)帶有位于scFv的VH和VL之間的穩(wěn)定化界面的\^結(jié)構(gòu)域和Vlj結(jié)構(gòu)域,其中該分子在直接位于所述界面內(nèi)的氨基酸位置上和/或在支撐VH和VL間相互作用的氨基酸位置上具有至少一個替換，其中該至少一個氨基酸位置選自由如下所組成的組:按照Kabat編號的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L, 79L, 85L, 98L, 58L, 74L, 77L,83L，89L，和 104L。
6.穩(wěn)定scFv分子的方法，其包括用(Gly4Ser)nscFv接頭通過基因工程將Vh結(jié)構(gòu)域和Vl結(jié)構(gòu)域融合，并改造Vh結(jié)構(gòu)域使之在位置44的氨基酸上包含半胱氨酸和改造\結(jié)構(gòu)域使之在氨基酸100位上包含半胱氨酸，從而形成穩(wěn)定化scFv分子。
7.制備包含穩(wěn)定化scFv分子的穩(wěn)定化多價抗體的方法，該方法包括通過基因工程將穩(wěn)定化scFv分子與抗體分子輕或重鏈的氨基末端或羧基末端融合。
8.制備穩(wěn)定化scFv分子的方法，包括替換scFv分子的VH/VL界面中的至少一個氨基酸和/或替換支撐scFv分子的VH/VL界面的至少一個氨基酸，其中所述替換使scFv分子的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域兩者的熱穩(wěn)定性都比常規(guī)scFv分子的提高。
9.制備穩(wěn)定化scFv分子的方法，包括替換VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸，該氨基酸與位于所述VH和VL結(jié)構(gòu)域之間界面上的兩個或多個氨基酸一起變化。
10.制備含ScFv分子的穩(wěn)定化融合蛋白的方法，包括替換scFv分子的VH/VL界面中的至少一個氨基酸和/或scFv分 子的VH/VL支架中的至少一個氨基酸，并通過基因工程將所述scFv分子與多肽融合，由此制備穩(wěn)定化融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的多肽組合物。本發(fā)明至少部分基于開發(fā)由穩(wěn)定化scFv組成或包含它的穩(wěn)定化結(jié)合分子和制備這些穩(wěn)定的分子的方法。
文檔編號C12N15/13GK103073639SQ20121056303
公開日2013年5月1日 申請日期2007年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者斯蒂芬.德馬雷斯特, 斯科特.格拉澤, 布賴恩.R.米勒, 吳秀鳳, 威廉.B.斯奈德, 諾曼.王, 莉薩.J.克羅納, 亞歷克西.A.盧戈夫斯科伊 申請人:比奧根艾迪克Ma公司