專利名稱：用于診斷癌癥的生物標(biāo)志物以及使用該生物標(biāo)志物分離癌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文涉及多種用于檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的循環(huán)癌細(xì)胞的生物標(biāo)志物,用于檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包括生物標(biāo)志物，用其診斷癌癥的方法，以及分離癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
在具有實(shí)體癌的患者中出現(xiàn)的腫瘤轉(zhuǎn)移是涉及單個(gè)腫瘤細(xì)胞的釋放和這些細(xì)胞經(jīng)由血管轉(zhuǎn)移至身體其他部位的過(guò)程，是癌癥引起死亡的主要原因。目前，通常使用活組織檢測(cè)(在轉(zhuǎn)移的早期階段將組織的一部分取出并進(jìn)行分析的方法)來(lái)診斷癌癥。但是，該方法的缺點(diǎn)是不易確定準(zhǔn)確的活檢位點(diǎn)。另一方面，目前備受關(guān)注的液體活組織檢測(cè)是僅收集血液樣品并檢測(cè)血液中腫瘤細(xì)胞的方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于確定癌癥進(jìn)展和治療，以及在早期階段檢測(cè)和診斷癌癥。隨著對(duì)能快速確定轉(zhuǎn)移癌病人治療結(jié)果和靈敏反映藥效的檢測(cè)方法的強(qiáng)烈需求，對(duì)因腫瘤浸潤(rùn)而出現(xiàn)在癌癥患者血流中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)、以及患者其它器官中出現(xiàn)了但未被臨床發(fā)現(xiàn)的播散型腫瘤細(xì)胞(disseminatedtumor cell, DTC)的檢測(cè)越來(lái)越受到關(guān)注。CTC是出現(xiàn)在血液中、并因此在機(jī)體中循環(huán)和在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用的罕見(jiàn)腫瘤細(xì)胞。相應(yīng)地，檢測(cè)血液中的腫瘤細(xì)胞仍是癌癥診斷和治療中重要的課題。目前，作為抗癌治療的方法，在所有未經(jīng)確認(rèn)CTC或DTC存在與否的病例中，都對(duì)大多數(shù)患者給藥抗癌藥物。因此，對(duì)于根據(jù)經(jīng)檢測(cè)和分析CTC而確定的CTC的存在與否來(lái)選擇性給予抗癌藥物，或者對(duì)于根據(jù)CTC的分子性質(zhì)來(lái)進(jìn)行個(gè)性化給藥以改進(jìn)抗癌藥物的效力，都有需求。已知CTC涉及癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。尤其是，已有人提出，CTC很可能包含癌癥干細(xì)胞，后者是近期癌癥研究的最重要的主題。因此，人們希望有通過(guò)分析CTC來(lái)預(yù)測(cè)現(xiàn)有活檢方法無(wú)法預(yù)測(cè)的癌癥預(yù)后的新可能性，并希望有基于它來(lái)開(kāi)發(fā)個(gè)性化治療方案的可能性。但是，CTC在血液中的含量非常少且不穩(wěn)定，故很難檢測(cè)CTC和對(duì)其進(jìn)行計(jì)數(shù)。因此，仍需要開(kāi)發(fā)能檢測(cè)患者機(jī)體中CTC、癌細(xì)胞或癌癥干細(xì)胞的高度敏感的診斷方法，以及有效分離生物樣品中所含CTC的方法，以及有關(guān)的設(shè)備。發(fā)明概沭本發(fā)明提供了用于檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的生物標(biāo)志物,該生物標(biāo)志物包括窖蛋白(Caveol in)-1。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括特異性結(jié)合窖蛋白-1的抗體，或其片段或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明提供了用于從生物樣品中檢測(cè)窖蛋白-1以提供癌癥診斷所需的信息的方法。本發(fā)明提供了用窖蛋白-1作為生物標(biāo)志物來(lái)分離癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的方法。


通過(guò)后文對(duì)實(shí)施方案的描述，并結(jié)合附圖，本發(fā)明的這些和/或其他方面將更為明顯和更容易理解:圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式的western印跡結(jié)果，其顯示九種癌細(xì)胞系中窖蛋白-1的表達(dá)水平；圖2k 2C的圖是顯示根據(jù)本發(fā)明多個(gè)實(shí)施方式的免疫細(xì)胞化學(xué)和western印跡結(jié)果，它們表明，在MCF7細(xì)胞系中誘導(dǎo)了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，其中，球形表示上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換-誘導(dǎo)的細(xì)胞；圖3的圖顯示根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式的比較結(jié)果:其比較了具有窖蛋白-1抗體的珠與經(jīng)歷了上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的MCF-7細(xì)胞結(jié)合的結(jié)合親和力、和這些珠與正常癌細(xì)胞結(jié)合的結(jié)合親和力；以及圖4的圖顯示根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的western印跡結(jié)果,確認(rèn)窖蛋白-1、蝸牛蛋白(Snail)、ALDH1、⑶133和⑶44在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換-誘導(dǎo)的MCF7細(xì)胞中的表達(dá)水平。發(fā)明詳沭現(xiàn)在詳細(xì)描述各實(shí)施方案，附圖中舉例說(shuō)明了它們的實(shí)例，其中同樣的參考號(hào)指代全文上下的相同要素。在這點(diǎn)上，當(dāng)前的實(shí)施方案可以具有不同的形式且不應(yīng)解釋為限于本文中所列的描述。因而，下文僅僅為了解釋本說(shuō)明書的各方面而參照附圖來(lái)描述各實(shí)施方案。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明提供用于檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的生物標(biāo)志物，該生物標(biāo)志物包括窖蛋白-1，與正常癌細(xì)胞相比，其在癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞中具有相對(duì)較高的表達(dá)水平。窖蛋白-1是由CAVl編碼的蛋白質(zhì)，已知其是胞膜窖(caveolae)中的主要蛋白質(zhì)，并且是參與促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白質(zhì)，而胞膜窖是能在大多數(shù)類型的人細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞膜上的內(nèi)陷結(jié)構(gòu)。此外，窖蛋白-1的氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示。根據(jù)一實(shí)施方式，窖蛋白-1顯示出與其他在癌細(xì)胞(例如，癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞)中用作現(xiàn)有的生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)相同的表達(dá)增加模式，因此，窖蛋白-1可以作為生物標(biāo)志物用于癌癥診斷的，尤其是用于檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，本發(fā)明提供用于檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒包括與窖蛋白-1或其片段特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。
窖蛋白-1的片段可以例如是免疫原性片段，它是指，具有生物標(biāo)志物蛋白上至少一個(gè)能被抗窖蛋白-1 (其為生物標(biāo)志物蛋白)的抗體識(shí)別的表位的片段。根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式的癌癥診斷試劑盒可以用多種本領(lǐng)域已知方法中的一種來(lái)制備，該試劑盒通?？梢园▋龈傻目贵w以及緩沖液、穩(wěn)定劑、無(wú)活性的蛋白質(zhì)等?？贵w可以用放射性核素、熒光染料或酶來(lái)標(biāo)記。根據(jù)一實(shí)施方式，該試劑盒可以用來(lái)檢測(cè)癌細(xì)胞，例如癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞，但不限于此?？贵w可以是多克隆抗體或單克隆抗體。多克隆抗體可以根據(jù)本領(lǐng)域多種已知方法中的一種，通過(guò)向外源宿主注入生物標(biāo)志物蛋白質(zhì)或其片段作為免疫原來(lái)制備。外源宿主包括哺乳動(dòng)物例如小鼠、大鼠、綿羊、以及兔子。免疫原注射可以通過(guò)肌肉注射、腹腔內(nèi)注射或皮下注射來(lái)進(jìn)行，在這種情況下，通?？梢耘c佐劑一起用以改進(jìn)抗原性。然后，定期從外源宿主采血以收集有增加的滴度和抗原特異性的血清，從中分離和純化抗體。單克隆抗體可以用本領(lǐng)域已知的經(jīng)融合而制備永生化細(xì)胞系的技術(shù)來(lái)制備。下面將簡(jiǎn)述該制備方法。首先，獲得適當(dāng)量(約IOyg)的純蛋白，用它免疫Balb/C小鼠?；蛘?，合成純蛋白的多肽片段，與牛血清白蛋白結(jié)合，用其免疫小鼠。然后，從小鼠中分離出產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞，將其與人或小鼠的骨髓瘤融合，以制備永生化雜交瘤。然后，用ELISA法選出并僅僅繁殖能產(chǎn)生所需單克隆抗體的雜交瘤，從培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體。單克隆抗體可以以不同方式用于免疫測(cè)定試劑盒(例如，ELISA、抗體包被的試管的測(cè)試、側(cè)向流測(cè)試(lateral-flow test)、便攜式生物傳感器)，還可以通過(guò)開(kāi)發(fā)高度特異和靈敏的抗體來(lái)開(kāi)發(fā)具有針對(duì)各種癌細(xì)胞的檢測(cè)范圍(detection spectrum)的蛋白質(zhì)芯片。在一實(shí)施方式中，抗原結(jié)合片段可以選自:scFV片段、(ScFv)2片段、Fab片段、Fab’片段、以及F(ab' )2片段，但不限于這些。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合片段”是指完整免疫球蛋白的片段，以及多肽上包含抗原結(jié)合區(qū)的任何部分。Fab片段具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并且含有輕鏈和重鏈兩者的可變區(qū)，輕鏈的恒定區(qū)，以及重鏈的第一恒定區(qū)CHI。Fab’片段不同于Fab片段，因?yàn)镕ab’片段另外包括重鏈的鉸鏈區(qū)，其在重鏈Chi區(qū)的C末端包括至少一個(gè)半胱氨酸殘基。Fab’片段的半胱氨酸殘基通過(guò)在鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接形成了F(ab/ )2片段。Fv片段是僅具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的最小抗體片段，制備Fv片段的重組技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。雙鏈Fv片段可以具有將重鏈可變區(qū)通過(guò)非共價(jià)鍵與輕鏈可變區(qū)連接的結(jié)構(gòu)。單鏈Fv片段通常具有在下述雙鏈Fv片段中的二聚體結(jié)構(gòu)，在所述雙鏈Fv片段中，重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)通過(guò)肽接頭共價(jià)連接或在其C-末端彼此直接連接?？乖Y(jié)合片段可以用蛋白酶獲得(例如，完整抗體用木瓜蛋白酶消化以獲得Fab片段或用胃蛋白酶消化以獲得F(ab’)2片段)，也可以通過(guò)基因重組技術(shù)來(lái)制備。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，本發(fā)明提供從生物樣品中檢測(cè)窖蛋白-1的方法，以提供診斷癌癥所需的信息，該方法包括從很可能患有癌癥的生物樣品中檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞，與正常癌細(xì)胞相比，癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞具有相對(duì)較高的窖蛋白-1表達(dá)水平；并且根據(jù)檢測(cè)結(jié)果來(lái)確定是否在生物樣品中發(fā)展了癌癥。根據(jù)從生物樣品中檢測(cè)窖蛋白-1的方法，該方法可以包括從很可能患有癌癥的生物樣品中檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞，與正常癌細(xì)胞相t匕，癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞具有相對(duì)較高的窖蛋白-1表達(dá)水平。該檢測(cè)方法可以通過(guò)用檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的試劑盒來(lái)進(jìn)行，以及可以通過(guò)免疫測(cè)定法來(lái)進(jìn)行。免疫測(cè)定法可以用常規(guī)開(kāi)發(fā)的免疫測(cè)定或免疫染色法來(lái)準(zhǔn)備。免疫測(cè)定或免疫染色法的實(shí)例包括:放射免疫分析、放射免疫沉淀、免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、捕獲-ELISA、抑制或競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)、夾心分析、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色和免疫親和純化，但不限于此。例如，在放射免疫測(cè)定法的實(shí)施方式中，可以使用放射性同位素標(biāo)記的抗體來(lái)檢測(cè)窖蛋白-1。放射性同位素可以是例如C14、I125、P32 或 S35。在ELISA方法的實(shí)施方式中，該方法可以包括:(i)利用正常人和很可能患有癌癥的受試者各自的 血液樣品來(lái)包被固體基質(zhì)的表面；(ii)使血液樣品與特異性結(jié)合窖蛋白-1的抗體或其片段(作為第一抗體)接觸；(iii)使(II)步驟所得產(chǎn)物與偶聯(lián)酶的第二抗體反應(yīng)；以及(iv)檢測(cè)酶的活性。固體基質(zhì)可以是碳?xì)渚酆衔锢缇郾揭蚁┗蚓郾?、玻璃、金屬或凝膠。例如，固體基質(zhì)可以是微量滴定板。與第二抗體偶聯(lián)的酶可以是催化顯色反應(yīng)、熒光反應(yīng)、發(fā)光反應(yīng)或紅外反應(yīng)的酶，但不限于上述。例如，酶可以是堿性磷酸酶、￠-半乳糖苷酶、辣根過(guò)氧化物酶、熒光素酶或細(xì)胞色素P45(l。當(dāng)使用堿性磷酸酶時(shí)，可以使用溴-氯-吲哚-磷酸(BCIP)、氮藍(lán)四唑(NBT)、萘酚-AS-Bl-磷酸、或增強(qiáng)型化學(xué)熒光(ECF)作為底物。當(dāng)使用辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，可以使用氯萘酚、氨基乙基咔唑、二氨基聯(lián)苯胺、D-熒光素、光澤精(雙N-甲基卩丫唳硝酸)、7-節(jié)氧基試齒靈(resorufin benzyl ether)、魯米諾、Amplex紅試劑(10-乙?；?3，7- 二羥基吩嗪)、超敏反應(yīng)溶液(HYR:p-苯二胺-HCl和鄰苯二酚)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、2，2-聯(lián)氮雙[3-乙基苯并噻唑啉磺酸](ABTS)、鄰苯二胺(OPD)和萘酚/派若寧、葡萄糖氧化酶和t-氮藍(lán)四唑(t-NBT)或m-吩嗪硫酸甲酯(m-PMS)作為底物。在捕獲-ELISA法的實(shí)施方式中，該方法可以包括:(i)利用特異性結(jié)合窖蛋白-1的抗體或其片段(作為捕獲抗體)包被固體基質(zhì)的表面；(ii)使捕獲抗體和很可能患有癌癥的受試者的血液樣品接觸來(lái)誘導(dǎo)抗原-抗體反應(yīng)；(iii)使(II)步驟的產(chǎn)物與附著有產(chǎn)信號(hào)的標(biāo)記的檢測(cè)抗體反應(yīng)；以及(iv)檢測(cè)標(biāo)記所產(chǎn)生的信號(hào)。所述檢測(cè)抗體可以具有能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)的標(biāo)記。所述標(biāo)記可以是化學(xué)標(biāo)記例如生物素；酶標(biāo)記例如堿性磷酸酶、P -半乳糖苷酶、辣根過(guò)氧化物酶和細(xì)胞色素P45tl ;放射性標(biāo)記例如C14、I125、P32和S35 ；熒光標(biāo)記例如熒光素；發(fā)光標(biāo)記；化學(xué)發(fā)光標(biāo)記；或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)標(biāo)記，但不限于此。ELISA法和捕獲-ELISA法中的酶活性或信號(hào)的最終測(cè)定可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)進(jìn)行，從而能夠定量或定性地分析窖蛋白-1。例如，在使用生物素標(biāo)記抗體的情況下，信號(hào)可以簡(jiǎn)單地通過(guò)鏈霉親和素來(lái)檢測(cè)，在使用熒光素酶標(biāo)記的抗體的情況下，信號(hào)可以簡(jiǎn)單地通過(guò)熒光素來(lái)檢測(cè)。作為上述試劑盒，可以使用微芯片或自動(dòng)微陣列系統(tǒng)，它們通過(guò)在微芯片上固定特異性結(jié)合窖蛋白-1的抗體或其片段，以及然后使所述抗體與從受試者分離的生物樣品反應(yīng)，可以檢測(cè)所述抗體的抗原。用這種方法，可以一次分析大量生物樣品。
根據(jù)一實(shí)施方式，生物樣品可以是含有癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的任何樣品。例如，生物樣品可以選自:血液、骨髓液、淋巴液、唾液、淚液、尿液、粘液、羊水、以及它們的組合，但是不限于此。檢測(cè)窖蛋白-1的方法可以包括根據(jù)測(cè)定結(jié)果確定是否在生物樣品中發(fā)展了癌癥。換言之，可以通過(guò)分析來(lái)自上述免疫測(cè)定的最終信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)診斷癌癥。例如，當(dāng)很可能罹患癌癥的受試者的樣品(例如血液)的窖蛋白-1信號(hào)強(qiáng)于正常對(duì)照樣品的相應(yīng)信號(hào)時(shí)，可以診斷受試者罹患了癌癥。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，分離癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的方法包括:從生物樣品中檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞(其表面上表達(dá)了窖蛋白-1);以及從生物樣品中分離檢測(cè)到的癌癥干細(xì)胞或檢測(cè)到的經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞。根據(jù)分離癌細(xì)胞的方法，首先，該方法可以包括從生物樣品中檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞(其表面上表達(dá)了窖蛋白-1)。根據(jù)一實(shí)施方式，癌細(xì)胞可以是癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞，但不限于此。如上所述，窖蛋白-1可以用作用于檢測(cè)癌細(xì)胞，例如癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的生物標(biāo)志物。因此，可以使用抗窖蛋白-1的抗體或其抗原結(jié)合片段來(lái)進(jìn)行窖蛋白-1的檢測(cè)。例如，可以用抗窖蛋白-1的抗體或其抗原結(jié)合片段，以及結(jié)合了可檢測(cè)標(biāo)記例如熒光標(biāo)記的珠，通過(guò)與生物樣品中癌細(xì)胞表面的窖蛋白-1發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，來(lái)進(jìn)行檢測(cè)步驟。在檢測(cè)步驟之后，該方法可以包括從生物樣品中分離檢測(cè)出的癌癥干細(xì)胞或檢測(cè)出的經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞。例如，當(dāng)使用抗窖蛋白-1的抗體或其抗原結(jié)合片段，以及結(jié)合了可檢測(cè)標(biāo)記例如熒光標(biāo)記的珠來(lái)檢測(cè)癌細(xì)胞時(shí)，分離步驟可以通過(guò)離心、過(guò)濾或色譜法來(lái)進(jìn)行。分離出的癌細(xì)胞可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的培養(yǎng)方法來(lái)培養(yǎng)，從而使其適于在實(shí)驗(yàn)中使用。本發(fā)明的一或多個(gè)實(shí)施方式參考下述實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步充分地描述。但是，提供的這些實(shí)施例僅為示例性的，不意在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:通過(guò)微陣列檢測(cè)在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)的具有低EpCAM表達(dá)水平的蛋
BM.
51種乳腺癌細(xì)胞系根據(jù)是否表達(dá)EpCAM來(lái)區(qū)分，參考了 CancerCell, 10(6):515-527), 2006，表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞系表面的蛋白用微陣列數(shù)據(jù)來(lái)分析。根據(jù)微陣列數(shù)據(jù)，確認(rèn)了包括ZR 75-1、SKBR3、MCF-7等20種乳腺癌細(xì)胞系具有EpCAM的高表達(dá)水平，并確認(rèn)了包括MDA231、MDA436、MCFlOA等31種乳腺癌細(xì)胞系具有EpCAM的低表達(dá)水平。分析結(jié)果表明，具有EpCAM的低表達(dá)水平的乳腺癌細(xì)胞系具有窖蛋白-1的高表達(dá)水平。實(shí)施例2:確認(rèn)各種癌細(xì)胞系的窖蛋白-1表達(dá)水平窖蛋白-1在各種癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平通過(guò)western印跡確認(rèn)。9種癌細(xì)胞系(購(gòu)自ATCC(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心))，包括乳腺癌細(xì)胞系(即ZR75-1、SKBR3、MCF7、MDA-MB-231、MDA-MB-436、MCFIOA)和前列腺癌細(xì)胞系(即 PC3、LnCAP, DU145)，在IOOmm培養(yǎng)皿中的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再?gòu)闹蝎@得細(xì)胞提取物。每種細(xì)胞提取物取20 ii g,用NovexNuPAGE Bis-Tris電泳系統(tǒng)(Invitrogen)分離，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(InvitTOgen，產(chǎn)品目錄號(hào)#LC2006)。每個(gè)膜用3%脫脂牛奶封閉I小時(shí)，然后與稀釋至1:1000的窖蛋白-1抗體(AbCAM，產(chǎn)品目錄號(hào)#2910)在4°C反應(yīng)18小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。然后，將所得膜用TBS-T溶液充分清洗，以除去未反應(yīng)的抗體，再將每個(gè)膜與山羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)在室溫反應(yīng)I小時(shí)。然后，將所得膜用TBS-T溶液充分清洗，向其中添加過(guò)氧化物酶底物溶液(Thermo Scientific Pierce ECL Western Blotting Substrate,產(chǎn)品目錄號(hào)#32106)，以產(chǎn)生熒光。檢測(cè)產(chǎn)生的熒光，以比較窖蛋白-1在這9種癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平。結(jié)果如圖1所示，確認(rèn)了在9種癌細(xì)胞系中，MDA-MB-231、MDA-MB-436、MCF-10A和DU145細(xì)胞系這幾種無(wú)EpCAM 表達(dá)的細(xì)胞系具有較強(qiáng)的窖蛋白-1表達(dá)水平。實(shí)施例3:制備結(jié)合有窖蛋白-1的抗體的珠直徑I或3 ii m的COOH聚苯乙烯(polystyrene)珠用EDC (N-輕基琥拍酰亞胺)/NHSd-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)處理，將處理過(guò)的珠添加到制得的PBS溶液中，向其中添加0.65mg/ml特異性結(jié)合窖蛋白-1的抗體，將所得溶液在室溫緩慢搖動(dòng)2小時(shí)，從而制得帶有特異性結(jié)合窖蛋白-1的抗體的珠。實(shí)施例4:在乳腺癌細(xì)胞系中人工誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換為了在乳腺癌細(xì)胞系MCF7中誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，采用了下文描述的乳球體培養(yǎng)方法(mammosphere culture method)代替現(xiàn)有的貼壁培養(yǎng)(DMEM+10%FBS)方法。用含DMEM-Fl2Ux B27、20ng/ml FGF、20ng/mlEGF和5ug/ml胰島素的培養(yǎng)基作為進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基，將MCF7細(xì)胞(2xl05個(gè)細(xì)胞/ml)接種在IOOmm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)I周。之后，對(duì)培養(yǎng)的MCF7細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析。結(jié)果如圖2A所示，確認(rèn)EpCAM(其是上皮性標(biāo)志物)無(wú)表達(dá)，并確認(rèn)波形蛋白(其是間充質(zhì)標(biāo)志物)的表達(dá)增加。此外，western印跡結(jié)果見(jiàn)圖2B，圖中顯示，￠-聯(lián)蛋白(已知在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換被誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)下降的蛋白)量減少，蝸牛蛋白、N-鈣黏著蛋白和波形蛋白(都是已知在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換被誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)增加的蛋白)量增加，由此證實(shí)，已經(jīng)誘導(dǎo)了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換。在這一方面，圖2B和2C表明，當(dāng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換被誘導(dǎo)時(shí)，窖蛋白-1的表達(dá)水平顯著增加。實(shí)施例5:確認(rèn)攜有窖蛋白-1抗體的珠與經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的結(jié)合栄和力為確認(rèn)窖蛋白-1是否在經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的MCF-7細(xì)胞系表面表達(dá)，首先，如實(shí)施例4，在高水平表達(dá)EpCAM的乳腺癌細(xì)胞系MCF7中誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換。隨后，將根據(jù)實(shí)施例3而制得的結(jié)合有窖蛋白-1抗體的珠以30 u I添加至在DMEM培養(yǎng)基中懸浮的Ix IO5個(gè)MCF-7細(xì)胞系中，放置I小時(shí)。然后，用熒光顯微鏡(Olympus IX-81)通過(guò)熒光素的熒光強(qiáng)度來(lái)確認(rèn)這些珠是否與MCF-7細(xì)胞系結(jié)合。在該實(shí)施例中，用結(jié)合有EpCAM抗體的珠作對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)圖3，其表明，結(jié)合有窖蛋白-1抗體的珠與經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的MCF-7細(xì)胞系的結(jié)合比與正常癌細(xì)胞的結(jié)合顯著增加。然后，通過(guò)離心分離這些結(jié)合有窖蛋白-1抗體的珠。實(shí)施例6:確認(rèn)窖蛋白-1是癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的標(biāo)志物為了確認(rèn)窖蛋白-1能用作癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的標(biāo)志物，用western印跡確認(rèn)，ALDH1、⑶133和⑶44 (都已知是癌癥干細(xì)胞的標(biāo)志物)，以及蝸牛蛋白(已知是經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的標(biāo)志物)，是否在誘導(dǎo)了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的乳腺癌細(xì)胞系MCF7中表達(dá)。Western印跡按照實(shí)施例2所述進(jìn)行，不同在于，用窖蛋白-1抗體(AbCAM,產(chǎn)品目錄號(hào)#2910)、蝸牛蛋白抗體(Cell signaling產(chǎn)品目錄號(hào)#3879)、ALDHl抗體(AbCAM,產(chǎn)品目錄號(hào)#23375)、CD 133抗體(AbCAM,產(chǎn)品目錄號(hào)#27699)、以及CD44抗體(Cell signaling產(chǎn)品目錄號(hào)#5640)分別作為這些標(biāo)志物的第一抗體。結(jié)果見(jiàn)圖4，其表明，在誘導(dǎo)了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的乳腺癌細(xì)胞系MCF7中，窖蛋白-1、蝸牛蛋白、ALDHl、⑶133和⑶44的表達(dá)水平都增加。鑒于窖蛋白_1的表達(dá)增長(zhǎng)模式與蝸牛蛋白、ALDHl、⑶133和⑶44的相同，這表明，窖蛋白_1也能用作經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的標(biāo)志物，或用作癌癥干細(xì)胞的標(biāo)志物。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的一或多種上述實(shí)施方式，通過(guò)使用癌癥診斷的生物標(biāo)志物以及包含抗所述生物標(biāo)志物的抗體的試劑盒，可以有效地檢測(cè)和分離癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解本文所述的示例性實(shí)施方式僅為描述性的，并不意在限制。應(yīng)理解，每個(gè)實(shí)施方式中眾多特征或眾多方面的描述可也適用于其他實(shí)施方式中的其他相似特征。
權(quán)利要求
1.試劑盒，用于檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞，所述試劑盒包括與窖蛋白-1或其片段特異性結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述抗原結(jié)合片段選自:SCFv片段、(ScFv)2片段、Fab片段、Fab’片段、以及F (ab’)2片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述抗體是單克隆抗體。
4.檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的方法，包括: 檢測(cè)正常癌細(xì)胞、以及很可能患有癌癥的生物樣品的細(xì)胞中窖蛋白-1的表達(dá)水平。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中生物樣品選自:血液、骨髓液、淋巴液、唾液、淚液、尿液、粘液、羊水、以及它們的組合。
6.分離癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的方法，該方法包括: 在生物樣品中檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞，其中窖蛋白-1在所述癌癥干細(xì)胞或循環(huán)癌細(xì)胞表面表達(dá)；以及 從生物樣品中分離出檢測(cè)到的癌癥干細(xì)胞或檢測(cè)到的經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述生物樣品選自:血液、骨髓液、淋巴液、唾液、淚液、尿液、粘液、羊水、以及它們的組合。
8.窖蛋白-1在制備用于檢測(cè)或分離癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的試劑盒中的用途。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述試劑盒包含特異性結(jié)合窖蛋白-1的抗體或其片段或其抗原結(jié)合片段。
全文摘要
用于檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的生物標(biāo)志物，用于檢測(cè)癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的試劑盒(該試劑盒包括抗生物標(biāo)志物的抗體)，使用該試劑盒診斷癌癥的方法，以及分離癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞的方法。通過(guò)使用癌癥診斷的生物標(biāo)志物以及包括抗生物標(biāo)志物的抗體的試劑盒，有效地檢測(cè)和分離癌癥干細(xì)胞或經(jīng)歷了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的循環(huán)癌細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/09GK103197076SQ20121051737
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者金淵正, 金俞善, 李錠建, 白相鉉, 吳真美, 鄭孝英 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社, 亞洲大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)