專利名稱：應用嵌合毒素診斷癌癥的方法
1．簡介本發(fā)明涉及運用一種嵌合毒素進行癌癥診斷的方法，特別是，本發(fā)明涉及運用由促性腺激素釋放激素(GnRH)和假單胞菌外毒素A(PE)組成的嵌合毒素檢測人腺瘤表達的腫瘤相關(guān)表位。以能夠結(jié)合但不殺死腫瘤細胞的突變GnRH-PE分子例示。
2．發(fā)明背景GnRH是下丘腦神經(jīng)元產(chǎn)生的十肽，經(jīng)過門血管分泌到垂體血管循環(huán)。首先它作為較大的前體蛋白合成，經(jīng)過蛋白酶剪切并在其C末端甘氨酸處酰胺化。GnRH刺激垂體前葉腺的促性腺激素細胞釋放黃體生成素和促卵泡激素，從而對控制人生殖的下丘腦-垂體生殖腺進行調(diào)控。
GnRH牽連到某些癌癥中，GnRH類似物用于對乳腺，前列腺，胰腺、子宮內(nèi)膜及卵巢癌的治療(Kadar等.，1988，前列腺12:229-307)。這些類似物在體外和體內(nèi)均可抑制腫瘤細胞生長。此外，在某些實體瘤和建樹的細胞系中報道了GnRH結(jié)合位點(Emons等.，1993，臨床內(nèi)分泌學代謝，77:1458-1464)，但初步結(jié)果暗示參與的GnRH受體(GnRHR)可能區(qū)別于以往引證的受體(Kadar等.，1992，《生物化學生物物理研究信息》Biochem.Biophs.Rex.Comm.189:289-295)。
盡管已在腫瘤中證明GnRH結(jié)合位點，這些腫瘤主要從激素依賴組織衍生。最近，Nechushtan等報道某些激素非應答腫瘤如結(jié)腸癌，腎細胞癌和肝細胞癌易被一種嵌合毒素GnRH-PE致死，(生物化學雜志，1997,272:11597)。GnRH使嵌合毒素結(jié)合至GnRHR表達的腫瘤細胞，而PE通過抑制蛋白合成調(diào)節(jié)細胞殺傷。但是，在本發(fā)明之前，并不了解觀察到的作用是緣于激素非應答腫瘤的天然GnRHR表達或是由于GnRH-PE識別與GnRH結(jié)合的表位不同的新表位。
3．發(fā)明概述本發(fā)明涉及用GnRH-RE嵌合毒素檢測腫瘤細胞的方法，且GnRH-PE嵌合毒素結(jié)合但不殺死腫瘤細胞。特別是，它涉及運用GnRH-PE嵌合毒素檢測腺癌表達的表位。本發(fā)明的實行中，優(yōu)選使用經(jīng)過修飾降低了細胞毒性活性但未改變其對腫瘤細胞結(jié)合特異性的GnRH-PE。這樣的分子對于在生物樣品和患有癌癥的被試人中腫瘤細胞的檢測尤其有用。
本發(fā)明部分基于申請人的如下發(fā)現(xiàn)由GnRH和PE組成的兩種突變重組嵌合毒素，稱為LGnRH-PE40M和LGnRH-PE66M，它們結(jié)合但不殺死腫瘤細胞。因為這些嵌合毒素不結(jié)合表達可被GnRH識別的天然GnRHR的顆粒腫瘤細胞，所以本發(fā)明的嵌合毒素能夠識別腺癌表達的新的腫瘤相關(guān)表位。
4．附圖簡述

圖1ALGnRH-PE66的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和圖1B氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。在突變的嵌合毒素，LGnRH-PE66M中，方框內(nèi)指定的氨基酸殘基#575缺失。
圖2LGnRH-PE40的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)和氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。方框內(nèi)指定的氨基酸殘基#336在突變的嵌合毒素LGnRH-PE40M中缺失。
圖3突變的GnRH-PE嵌合毒素，LGnRH-PE40M和LGnRH-PE66M，不表現(xiàn)ADP-核糖基化活性。
圖4突變的GnRH-PE嵌合毒素，LGnRH-PE40M和LGnRH-PE66M，在293腎癌細胞中不抑制蛋白合成，而未突變的嵌合毒素表現(xiàn)了細胞毒性活性對蛋白合成的抑制用作細胞毒性的指征。
圖5GnRH-PE嵌合毒素不抑制表達天然GnRHR的粒膜腫瘤細胞的原始培養(yǎng)物的蛋白合成。
5．發(fā)明詳述5.1GnRH-PE嵌合毒素的制備本發(fā)明的GnRH-PE嵌合毒素可通過化學合成方法或在兩部分之間化學連接制備，優(yōu)選通過如下方法制備在合適的宿主細胞中，在指導事例多核苷酸表達的調(diào)節(jié)序列控制下，將GnRH的編碼序列和PE的編碼序列融合(Nechushstan等.，1997，生物化學雜志，272:11597)。兩個編碼序列的融合可通過分子生物學領(lǐng)域熟知的方法進行。適合在本發(fā)明應用的PE編碼序列，包括但不僅限于，全長PE，PE的部分片斷如PE的結(jié)構(gòu)域Ⅱ和/或Ⅲ，突變的PE，其中結(jié)構(gòu)域Ⅰ的氨基酸殘基發(fā)生改變降低了非特異的細胞毒性，和具有最小細胞毒活性的突變PE(美國專利號4,892,827,Lorberboum-Galski等，1990，生物化學雜志，265:16311)。
優(yōu)選僅在第一編碼序列5’端含AUG翻譯起始密碼子而無第二編碼序列的起始密碼子的融合多核苷酸，以避產(chǎn)生兩個編碼產(chǎn)物。此外，可在多核苷酸的5’端設(shè)置一前導序列，以使表達產(chǎn)物靶向宿主細胞的特異位點或區(qū)室，加速分泌或基因表達后的純化。兩個編碼序列可無接頭直接融合，或通過運用包括重復1到3次的五聚體Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:5)的可變多接頭融合。這樣的接頭已經(jīng)通過到VH和VL之間插入應用于單鏈抗體(scFv)的構(gòu)建(Bird等，1988，科學242:423-426；Huston等，1988。美國國家科學院學報85:5979-5883)。接頭經(jīng)設(shè)計能在兩個β折疊間正確相互作用形成單鏈抗體的可變區(qū)。其它可采用的接頭包括Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-G1y-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp(SEQ ID NO:6)(Chaudhary等，1990，美國國家科學院學報。87:1066-1070)和Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu--Ala-G1n-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(SEQ ID NO:7)(Bird等，1988，科學242:423-426)。
5.2GnRH-PE嵌合毒素的表達一種編碼GnRH-PE嵌合毒素，突變多肽，嵌合蛋白生物活性片斷，或其功能等同物的多核苷酸，可用于在適當宿主細胞中產(chǎn)生指導嵌合毒素，突變多肽，肽片斷或其功能等同物表達的重組DNA分子。由于遺傳密碼的固有簡并性，其它編碼基本相同或功能相當氨基酸序列的DNA序列，也可用于本發(fā)明嵌合毒素的克隆和表達。
依照本發(fā)明可應用的改變后的DNA序列包括不同核苷酸殘基的缺失、添加或取代，這些改變導致生成的序列可以編出相同或功能相當?shù)娜诤匣虍a(chǎn)物?；虍a(chǎn)物本身可包括嵌合序列中導致沉默變化的氨基酸殘基缺失、添加或取代，因而產(chǎn)生功能相當?shù)那逗系鞍住＿@樣的氨基酸取代建立在參與的殘基的極性，電荷，溶解度，疏水性，親水性和/或兩親性的相似性基礎(chǔ)上。例如負電荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正電荷氨基酸包括賴氨酸，組氨酸和精氨酸；具有相似親水性帶有不帶電極性頭基團的氨基酸包括甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸；帶非極性頭基團的氨基酸包括丙氨酸，纈氨酸，異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、色氨酸。
本發(fā)明的DNA序列可經(jīng)過基因工程改變嵌合編碼序列得到多種末端，包括而不限于，改述基因產(chǎn)物的加工和表達的替代。例如，可運用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)引入突變，例如定點誘變，從而插入新的限制性位點，降低細胞毒性，等。
在本發(fā)明可替代的實施例中，可運用本領(lǐng)域熟知的化學方法合成編碼GnRH-PE嵌合毒素的全長或部分序列，見，例Caruther等，1980，核酸研究論文集連載(Nuc.Acids Res.Symp.Ser.)7:215-233；Crea和Horn,180，核酸研究9(10):2331；Matteucei和Caruthers,1980，四面體通訊(Tetrahedron Letter)21:719，和Cow和Kempe,1981，核酸研究，9(12):2807-2817。此外，GnRH十肽和PE的特異結(jié)構(gòu)域可通過固相技術(shù)合成，從樹脂上解離，并通過制備型高性能液相層析純化，隨后化學連接形成一種嵌合毒素(例，見Creighton,1983，蛋白結(jié)構(gòu)和分子原理，W.H.Freeman和Co.,N.Y.pp.50-60)。合成肽的組成可通過氨基酸分析或測序確定(例蛋白結(jié)構(gòu)和分子準則，W.H.Freeman和Co.,N.Y.,pp.34-49)。通過合成或重組方式產(chǎn)生的GnRH和PE也可依照本領(lǐng)域熟知的方法通過化學接頭結(jié)合(Brinkmann和Pastan,1994，Biochemica et Biophysica Acta生物化學和生物物理進展1198:27-45) 。
為表達生物活性GnRH-PE嵌合毒素，將編碼嵌合毒素，或功能相等物的核苷酸序列插入適當表達載體，即，包含有插入的編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件的載體。除嵌合毒素之外，用重組嵌合表達載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細胞或細胞系也可用于多種目的。它們包括但不僅限于制備抗體(即單克隆或多克隆)，該抗體可與蛋白表位結(jié)合從而促進蛋白的純化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可用于構(gòu)建包括GnRH-PE嵌合毒素編碼序列和適當轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)重組/遺傳重組。見，例，Sambrook等，1989，分子克隆實驗指南(冷泉港實驗室，紐約)和Ausubel等，1989；分子生物學通用方法(Greene出版聯(lián)合及Wiley InterScience，紐約)中描述的技術(shù)。
多種宿主表達載體系統(tǒng)可用于表達GnRH-PE嵌合蛋白編碼序列。它們包括但不限于微生物如以包含嵌合毒素編碼序列的重組噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌；以包含嵌合毒素編碼序列的重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母；包含嵌合毒素編碼序列的重組病毒表達載體(例桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；由包含嵌合毒素編碼序列的重組質(zhì)粒表達載體(例Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化或包含嵌合毒素編碼序列的重組病毒表達載體(例，花椰菜花葉病毒，CaMV，煙草花葉病毒TMV)感染的植物細胞系統(tǒng)；或動物細胞系統(tǒng)。必須提到一點由于PE通常殺死哺乳動物細胞，因此優(yōu)選本發(fā)明的嵌合毒素在原核或低等真核細胞中表達。第6部分舉例說明GnRH-PE嵌合毒素可在大腸桿菌中高效表達。但是，因后述的第6部份中突變的GnRH-PE嵌合毒素，不表現(xiàn)針對人細胞的細胞毒性活性，它們也可在真核細胞中表達。
每個系統(tǒng)的表達元件其強度和特異性有所不同。依據(jù)運用的宿主/載體系統(tǒng)，許多適當?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型和誘導型啟動子，都可用于表達載體。例如，當克隆在細菌系統(tǒng)中進行時，可應用誘導型啟動子例如λ噬菌體的PL,Plac,ptrp,ptac(ptrp-lac雜交啟動子；巨細胞病毒啟動子)等；當克隆在昆蟲細胞系統(tǒng)中克隆時，可應用桿狀病毒多角體啟動子；當在植物細胞系統(tǒng)中進行克隆時，可應用從植物細胞基團組衍生的、啟動子(例，熱休克啟動子；RUBISCO核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的小亞基的啟動子；葉綠素α/β結(jié)合蛋白的啟動子)或從植物病毒衍生的啟動子(例，CaMV的35S RNA啟動子；TMV的外殼蛋白啟動子)；當克隆在哺乳動物細胞系統(tǒng)中進行時，可運用從哺乳動物細胞的基因組衍生的啟動子(例，金屬硫蛋白啟動子)或從哺乳動物病毒衍生的啟動子(例，腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)；當制備含嵌合DNA多挎貝的細胞系時，可應用帶適當選擇標記的SV40-BPV-和EBV載體。
在細菌系統(tǒng)中，根據(jù)表達的嵌合毒素的運用目的，可選擇許多表達載體。例如，當生產(chǎn)大量嵌合毒素時，選擇指導易純化的蛋白產(chǎn)物高水平表達的載體。這些載體包括但不限于pHL906載體(Fishman等，1994，生物化學，33:6235-6243)，大腸桿菌表達載體pUR278(Ruther等，1983,EMBOJ歐洲分子生物學雜志2:1791)，其中嵌合蛋白編碼序列可連接到載體中，與lacZ編碼區(qū)同處一個閱讀框，則可制備出雜合lacZ蛋白；pIN載體(Inouye&Inouye,1985，核酸研究13:3101-3109；Van Heeke和Schuster,1989，生物化學雜志，264:5503-5509)；及其它。
能用于表達嵌合毒素的可替代表達系統(tǒng)是昆蟲系統(tǒng)。在此類系統(tǒng)中苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)用作載體表達外源基因。此病毒在草地夜蛾細胞中生長。嵌合毒素編碼序列可克隆至病毒的非基本區(qū)(例，多角體蛋白基因)，置于一個AcNPV啟動子(例多角體蛋白啟動子)的控制下。嵌合蛋白編碼序列的成功插入會導致多角體蛋白基因的鈍化及非包含體的重組病毒(即缺乏多角體蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)表膜外殼的病毒)的制備。這些重組病毒隨后用于感染草地夜蛾細胞，插入基因在其中得以表達。(例見Smith等，1983，病毒學雜志，46:584,Smith，美國專利號4,215,051)。
插入的嵌合毒素編碼序列的有效翻譯還需要特異的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和鄰近序列。當將包括其自身的起始密碼子和鄰近序列的完整嵌合基因插入到適當?shù)谋磉_載體時，無需額外的翻譯控制信號。但是，當嵌合毒素編碼序列不包括其自己的起始密碼子時，則必須提供外源翻譯控制信號；包括ATG起始密碼子。此外，起始密碼子必須與嵌合蛋白編碼序列的閱讀框同相以保證對整個插入片段的翻譯。這些外源性的翻譯控制信號和起始密碼子可為多種來源，天然的或合成的。表達的效率可通過包含適當轉(zhuǎn)錄增強子元件。轉(zhuǎn)錄終止子等而提高(見Bittner等，1987酶學方法，153:516-544)。
此外，可選擇調(diào)節(jié)插入序列的表達，或以特定的預期方式修飾處理基因產(chǎn)物的宿主細胞株。這些蛋白產(chǎn)物的修飾(例糖基化)和加工(例切割)可能對蛋白功能非常重要。不同宿主細胞的蛋白翻譯后加工修飾機制特征鮮明，各不相同?？蛇x擇適當細胞系或宿主系統(tǒng)確保嵌合毒素的正確修飾和加工。為此目的，可使用具有下述細胞機制的真核宿主細胞嵌合蛋白初級轉(zhuǎn)錄物的正確處理、糖基化以及磷酸化。這些哺乳動物宿主細胞包括但不限于CHO.VERO,BHK.HeLa,COS，MDCK，293,WI38等。
進行重組嵌合毒素的長期，大產(chǎn)量生產(chǎn)時，優(yōu)選穩(wěn)定的表達。例如，人工構(gòu)建穩(wěn)定表達嵌合毒素的細菌宿主細胞或真核細胞，宿主細胞可用由適當表達控制元件(例，啟動子，增強子，序列，轉(zhuǎn)錄終止子，聚腺苷酸化位點，等)和選擇性標記控制的嵌合編碼序列轉(zhuǎn)化，而不用包含病毒復制起始點的表達載體。引入外源DNA后，人工改造的細胞可在滋養(yǎng)培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的選擇標記可賦予細胞選擇抗性并使細胞能穩(wěn)定地將質(zhì)粒整合到它們的染色體中，并且生長形成依次能克隆并展開到細胞系的轉(zhuǎn)化灶。
可運用許多選擇系統(tǒng)，包括但不僅限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，細胞11:223)，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski,1962,美國國家科學院學報48:2026)，和腺嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(Lowy等，1980，細胞22:817)?；蚩煞謩e用于tk-,hgprt-或aprt-細胞。還可將抗代謝物抗性用作dhfr、gpt、neo以及hygro選擇的基礎(chǔ)，dhfr可賦予對氨甲蝶呤的抗性(Wigler等.，1980，美國國家科學院學報77:3567；0’Hare等，1981，美國國家科學院學報78:1527)；gpt可賦予對霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg,1981，美國國家科學院學報78:2072)；neo可賦予對氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，分子生物學雜志，150:1)；和hygro可賦予對潮霉素的抗性(Santerre等，1984，基因30:147)。其他選擇基因也已有描述，例如trpB，可使細胞用吲哚替代色氨酸；hisD細胞利用組氨醇替代組氨酸(Hartman和Mulligan,1988，美國國家科學院學報85:8047；和ODC(多氨酸脫羧酶)，賦予對多苷酸脫羧酶抑制劑，2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸，DFMO的抗性(McConlogueL.,1987，現(xiàn)代分子生物學通訊，冷泉港實驗室編)。
5.3蛋白純化本發(fā)明的GnRH-PE嵌合毒素能通過本領(lǐng)域已知技術(shù)純化，如高效液相層析，離子交換層析，凝膠電泳，親和層析。每種蛋白純化的實際條件部分決定于這樣一些因素如凈電荷，疏水性、親水性等，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
任何與GnRH,PE或通過GnRH和PE融合產(chǎn)生的構(gòu)象性表位特異結(jié)合的抗體都可用于親和層析純化。制備抗體時，可用GnRH-PE嵌合毒素或其部分注射免疫多種宿主動物，包括而不限于兔，小鼠，大鼠等。蛋白可連結(jié)于適當載體，如牛血清清蛋白(BSA)，通過側(cè)鏈功能基團或連于側(cè)鏈功能基團的連接子。各種佐劑都可用于增強免疫應答，決定于宿主種類，包括但不限于，弗氏佐劑(完全和不完全)，礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂，pluronic多元醇類，聚陰離子，肽，油乳劑，匙孔血藍蛋白，二硝基苯酚，和潛在有用的人佐劑如BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Coryhebacteriumparvum)。
抗GnRH-PE單克隆抗體的制備可采用通過連續(xù)細胞培養(yǎng)制備抗體分子時提供的任一項技術(shù)。這些包括但不限于由Kothler和Milstein最初描述的雜交瘤技術(shù)(1975，自然256:495-497)。此外，可運用為制備“嵌合抗體”而發(fā)展起來的技術(shù)(Morrison等，1984，美國國家科學院學報81:6851-6855；Neuberger等，1984，自然312:604-608；Takeda等，1985，自然314:452-454)，該技術(shù)將具有適當抗原特異性的鼠抗體分子基因與具有適當生物活性的人抗體分子基因剪接在一起。替代地，還可使用用于單鏈抗體制備的技術(shù)(U.S.專利號4,946,778)制備用于蛋白純化和檢測的GnRH-PE特異的單鏈抗體。
5.4運用GnRH-PE嵌合毒素診斷癌癥本發(fā)明的GnRH-PE嵌合毒素可用于在體內(nèi)和體外檢測人腫瘤。優(yōu)選這些毒素經(jīng)過突變?nèi)コ鼈兊募毎拘远挥绊懰鼈儗δ[瘤細胞的結(jié)合特異性。這樣的GnRH-PE的兩個實例在后述的第6部分舉例論證。本發(fā)明的GnRH-PE嵌合毒素可用于檢測許多種人腺癌表達的表位，包括但不僅限于，結(jié)腸腺癌，胸腺癌，肺腺癌，卵巢腺癌，子宮內(nèi)膜腺癌、腎腺癌，肝腺癌，前列腺癌，胃腺癌，子宮頸腺癌，膽囊腺癌和胰腺癌。本發(fā)明的嵌合毒素在區(qū)分腺癌與表達有天然GnRHR的非腺癌及正常細胞方面的作用尤為突出。
5.4.1體外診斷應用本發(fā)明的GnRH-PE嵌合毒素可用于檢測生物樣本如組織和細胞樣本中的癌細胞，和，特別是從正常組織和非惡性腫瘤中分辨惡性腫瘤，從而確定外科手術(shù)的邊緣和微弱分化腫瘤的改良的組織特征。組織樣本可通過嵌合毒素及它們由對嵌合毒素部分特異的二級抗體結(jié)合而染色。二級抗體與可檢測的標記結(jié)合，如放射性同位素，酶如過氧化物酶和堿性磷酸酶，超聲探針，核磁共振(NMR)探針等。
此外，免疫熒光技術(shù)也可用GnRH-PE檢測人組織，細胞和體液樣本。在典型方法中，將凍存的未固定的組織活體解剖樣品的載片或細胞涂片在空氣中干燥，福爾馬林或丙酮固定，用GnRH-PE在調(diào)濕器室中室溫溫育。
載片經(jīng)過沖洗并用抗GnRH-PE的二級抗體制備物溫育。二級抗體用特定波長的熒光化合物標記，如若丹明，藻紅蛋白或異硫氰酸熒光素。樣品的染色圖案和強度隨后用熒光顯微鏡確認并記錄下最佳圖象。
在另一個實施方案中，可使用GnRH-PE通過電腦增強的熒光影像分析或流式細胞儀來檢測組織樣本或片狀剝落細胞，即來自腫瘤組織活檢吸取樣本單細胞制備物。本發(fā)明的GnRH-PE嵌合毒素在通過電腦增強的熒光影像分析或流式細胞儀檢測對活腫瘤細胞，即來自腺癌組織活檢吸取樣本的單細胞培養(yǎng)物定量中特別有用。部分的GnRH-PE結(jié)合的細胞群體，單獨的或與測定這些細胞的DNA倍性染色體相結(jié)合，作為病程進展的早期指示物從而提供非常有用的前兆信息。
GnRH-PE的運用可擴展到篩選人生物體液中是否存在被識別的特異性抗原決定簇。因而，患者生物體液的體外免疫血清評估可以提供非侵害性的癌斷方法。舉例而言，人體液如全血，胸膜滲出液，大腦脊髓液，滑液，前列腺液，精液或尿可采自患者，并進行特異性表位分析，這些表位可以是樣品液中釋放的抗原也可以定細胞上的膜結(jié)合表位。在標準放射免疫分析或酶聯(lián)免疫分析，競爭性結(jié)合酶聯(lián)免疫分析；點印跡或Western印跡或其本領(lǐng)域已知的其它分析中運用GnRH-PE。
可以制備含有GnRH-PE的試劑盒，通過上述的免疫組織學，免疫細胞學和免疫血清學方法對腺癌進行體外診斷、預后和/或監(jiān)測。試劑盒的組分可包裝在含水培養(yǎng)基中或以凍干形式包裝。當GnRH-PE以與標記部分結(jié)合的形式在試劑盒中運用時，如與酶或放射活性金屬離子結(jié)合時，這些結(jié)合物的組分可以采用完全結(jié)合形式、中間物形式或留待用戶去結(jié)合的獨立單元。
試劑盒可包括一種可分隔的容器，從而可以完全封閉的形式容納一個或多個或者一系列或多系列的器皿，如試管，玻璃瓶，長頸瓶，瓶，注射器等。第一個或第一系列所述容器可裝入GnRH-PE。第2個或第二系列所述容器可裝入標記物或能夠與GnRH-PE結(jié)合的連接子標記過的中間物。
5.4.2體內(nèi)診斷應用GnRH-PE嵌合毒素對體內(nèi)靶向腺癌細胞也有用。它們可用于在原始腫瘤及轉(zhuǎn)移腫瘤，尤其是淋巴結(jié)腫瘤的檢測和監(jiān)測中腫瘤定位。對腫瘤擴散的范圍的初級估計會影響到對治療模式的選擇。對殘留腫瘤的連續(xù)監(jiān)測還有利于挽救治療的更好監(jiān)視和早期開始。也可內(nèi)操作運用標記后的GnRH-PE，以便更好暴露腫瘤，并將對正常組織(如淋巴結(jié))的破壞減至最小。對體內(nèi)應用而言，優(yōu)選運用高度純化的GnRH-PE。
體內(nèi)探測和/或監(jiān)測腺癌時，純化的GnRH-PE可直接或通過連接子，共價連接到一種化合物上，此化合物作為報告基團在共軛物或復合體的引入和定位后可使特異性組織或器官成像。許多不同類型的物質(zhì)可作為報告基團，包括如不透X線染料，放射性金屬和非金屬同位素，熒光化合物，正電子發(fā)射同位素，非順磁金屬等。
可制備出含有與任一類型上述底物結(jié)合的GnRH-PE的試劑盒，用于所述的體內(nèi)腫瘤定位方法。試劑盒的組分可溶于含水培養(yǎng)基中或為凍干形式。當嵌合毒素以與標記物結(jié)合的共軛物形式在試劑盒中使用時，這些共軛物的組分可以完全共軛形式，中間物形式或留待用戶結(jié)合的獨立單元的形式提供。
6．實施例突變的GnRH-PE嵌合毒素結(jié)合但不殺死腫瘤細胞6.1材料和方法6.1.1GnRH-PE嵌合毒素的構(gòu)建用NdeⅠ和Hind Ⅲ切割攜帶全長PE基團的質(zhì)粒載體(pJY3A1136-1,3)(Chaudnary等，1990，生物化學雜志，265:16306-16310；Neshushtan等，1997，生物化學雜志，272:11597)。側(cè)面為NdeⅠ(5’端)和Hind Ⅲ(3’端)限制性位點的36堿基對合成寡聚體與載體連接。此寡聚體插入片段包括GnRH編碼序列，其中殘基#6的編碼氨基酸為色氨酸而非甘氨酸。此外，編碼連接子Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:5)的序列重復兩次置于GnRH編碼序列和PE編碼序列之間。合成的質(zhì)粒編碼嵌合毒素，LGnRH-PE66’，由限制性核酸內(nèi)切酶消化和DNA序列分析確認(圖1A和1B)。
為制備第2種嵌合毒素LGnRH-PE40，用NdeI和BamHI消化編碼LGnRH-PE66的質(zhì)粒載體，并將其連接到從質(zhì)粒pHL-906獲得的Nde I-Bam HI 750bp片段上(Fishman等，1994，生物化學33:6235-6243)，并與包含GnRH編碼序列的36bp合成寡聚物相連，其中第6位氨基酸由色氨酸代替甘氨酸。編碼以上連接子的序列再次置于GnRH編碼序列和PE編碼序列之間。合成的質(zhì)粒編碼一種嵌合毒素，LGnRH-PE40；限制性核酸內(nèi)切酶消化和DNA序列分析確認(圖2)。此質(zhì)粒編碼的毒素包括全長PE的結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ。
6.1.2突變的GnRH-PE嵌合毒素的產(chǎn)生為構(gòu)建對人細胞無細胞毒性的GnRH-PE嵌合毒素，用Bam HI和ECORⅠ切去上述質(zhì)粒中的下述區(qū)域，即編碼LGnRH-PE66和LGnRH-PE40C末端122個氨基酸的區(qū)域，并用包括缺失了編碼天然PE分子第553位氨基酸的單個密碼子的相應片段替換(圖1A,1B和2)(Fishman等，1997，歐洲免疫學雜志，27:486；Lukoo等，1988，傳染免疫學56:3095)。突變的嵌合毒素分別稱為LGnRH-PE66M和LGnRH-PE40M。
6.1.3GnRH-PE嵌合毒素的表達將分別編碼突變的GnRH-PE嵌合毒素LGnRH-PE66M和LGnRH-PE40M的質(zhì)粒pVM1和pVM2，在大腸桿菌BL21(λDE3)進行表達。編碼LGnRH-PE40和LGnRH-PE66的質(zhì)粒也在相同細菌中表達。質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中，細胞在含安比西林的培養(yǎng)基中生長。A600值到達1.5-1.7時，培養(yǎng)物在37℃以1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導。離心收集細胞，沉淀在-70℃貯存若干小時。
將表達細胞的沉淀重懸于裂解緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.0，含0.2mg/ml溶菌酶的1mM EDTA)，超聲處理(3次30秒脈沖)，30000g離心30min。轉(zhuǎn)移上清(可溶部分)供分析用。將沉淀(不可溶部分)置于抽提緩沖液(6M鹽酸胍，0.1M Tris-HCl,pH8.6,1mM EDTA,0.05M NaCl，和10mM二硫蘇糖醇)中變性，4℃攪拌30分鐘。懸浮液30000g離心15分鐘，棄去沉淀。上清透析，0.1MTris-HCl pH8.0,1mM EDTA,0.25mM NaCl和0.25mM L-精氨酸16小時。透析液15000g離心15分鐘，所獲上清(重折疊部分)作為GnRH-PE嵌合毒素的來源。
SDS/PAGE對該部分分析顯色相應于嵌合毒素的主帶。抗PE的多克隆抗體免疫印跡確認GnRH PE嵌合毒素的產(chǎn)生。
6.1.4重組GnRH-PE嵌合毒素的純化重折疊的蛋白部分用TE20緩沖液(20mM Tris.pH8.0,1mMEDTA)稀釋。加入DEAE瓊脂糖(Pharmacia瑞典)，4℃攪拌半小時，裝入柱中。含80mM或50mM NaCl的TE20緩沖液洗柱。用2×200ml含0.08-0.35m NaCl的TE20(20mM Tris pH8.0,1mM EDTA)緩沖液以線性梯度洗脫蛋白。收集峰部分，磷酸鹽透析，分裝，-20℃保存。
6.2結(jié)果重組的GnRH-嵌合毒素，LGnRH-PE66，通過GnRH編碼序列和PE編碼序列與兩部分之間的連接子插入片段融合產(chǎn)生。另一種GnRH-PE嵌合毒素，LGnRH-PE40，以相似方式制備，不同之處為只有PE的結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ是由毒素編碼序列編碼。此外，這兩種嵌合毒素的編碼序列經(jīng)過突變導致在PE部分的單個氨基酸缺失。突變的嵌合毒素也作為重組蛋白表達。
從大腸桿菌裂解物中純化并重折疊4種GnRH-PE嵌合毒素。因為PE通過在蛋白合成中ADP-核糖基化鈍化延伸因子2從而殺死真核細胞，所以將GnRH-PE嵌合毒素的4種形式在無細胞分析中檢測它們在ADP-核糖基化中的酶活性(Chung和Collier,1977，傳染免疫學雜志，16:832-841)。兩種未突變的GnRH-PE嵌合毒素，LGnRH-PE40和LGnRH-PE66表現(xiàn)ADP-核糖基化活性，而突變的嵌合毒素，LGnRH-PE40M和LGnRH-PE66M，在相同分析中完全失活(圖3)。所以，PE中的單個氨基酸取代去除了嵌合毒素的酶活性。
額外的，對所有4種GnRH-PE嵌合毒素均檢測它們殺死293腎腺癌細胞的能力。結(jié)果表明僅非突變的嵌合毒素顯現(xiàn)對靶細胞中蛋白合成的劑量依賴抑制(圖4)。但是，當嵌合毒素與相同靶細胞溫育而它們的結(jié)合由標記的抗PE抗體及FACS分析檢測時，所有4種毒素都能結(jié)合腎腺癌細胞而不結(jié)合對照T24A膀胱腺癌細胞。因此，當突變的GnRH-PE嵌合毒素不能殺死靶細胞時，它們?nèi)跃哂信c腫瘤細胞結(jié)合的能力。這樣的非細胞毒性嵌合毒素對體外和體內(nèi)的癌癥診斷尤為有用。
獲取初級顆粒腫瘤細胞，使用相應于GnRHR特異部分的引物PCR顯示表達GnRHR。顆粒細胞中的PCR產(chǎn)物與從表達天然GnRHR的垂體細胞中得到的量相同。與之對照，GnRHR陰性細胞如正常人淋巴細胞不產(chǎn)生可檢測的PCR產(chǎn)物。盡管表達天然GnRHR，顆粒細胞對4種GnRH-PE嵌合毒素殺傷并不敏感，說明嵌合毒素與腺癌細胞表達的新表位結(jié)合，該表位能夠?qū)⑺龅募毎陨鞧nRH的結(jié)合識別開來(圖5)。
本發(fā)明的范圍不僅限于那些為說明本發(fā)明單一方面而列舉的實施方案，任何功能相同的序列都在本發(fā)明范圍內(nèi)。事實上，除本發(fā)明已顯示和描述之外對發(fā)明所作的各種修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可明顯從前面的描述及附圖中得知。這樣的修改都在附加的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
本發(fā)明引述的所有出版物在此引入僅作參考。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人耶路撒冷希伯萊大學，伊森姆研究發(fā)展公司(ⅱ)發(fā)明題目一種應用嵌合毒素診斷癌癥的方法(ⅲ)序列數(shù)7(ⅳ)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Pennie和Edmonds,LLP(B)街道the Americas 1155大道(C)城市紐約(D)州紐約(E)國家USA(F)郵編10036-2811(ⅴ)機讀形式(A)介質(zhì)類型磁盤(B)電腦IBM兼容(C)操作系統(tǒng)Windows(D)軟件FastSEQ for Windows Version 2.0b(ⅵ)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)提交日期(C)分類(ⅶ)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?9/046,992(B)提交日期1998年3月24日(ⅷ)代理人信息(A)名字Poissant,Brian M(B)登記號28,462(C)參考/文檔9457-0013-228(Ⅸ)電信信息(A)電話650-493-4935(B)傳真650-493-5556(C)電報66141 PENNIE(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長度1908堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲學線性(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置1...1905(D)其它信息(Ⅺ)序列描述SEQ ID NO:1:ATG GAG CAC TGG TCC TAT TGG CTG CGC CCT GGA GAA GCT GGA GGA GGA 48Met Glu His Trp Ser Tyr Trp Leu Arg Pro Gly Glu Ala Gly Gly Gly1 5 10 15GGA TCC GGA GGA GGA GGA TCC GGT CAA GCT TTC GAC CTC TGG AAC GAA 96Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu20 25 30TGC GCC AAA GCC TGC GTG CTC GAC CTC AAG GAC GGC GTG CGT TCC AGC144Cys Ala Lys Ala Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser35 40 45CGC ATG AGC GTC GAC CCG GCC ATC GCC GAC ACC AAC GGC CAG GGC GTG192Arg Met Ser Val Asp Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val50 55 60CTG CAC TAC TCC ATG GTC CTG GAG GGC GGC AAC GAC GCG CTC GAG CTG240Leu His Tyr Ser Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Glu Leu65 70 75 80GCC ATC GAC AAC GCC CTC AGC ATC ACC AGC GAC GGC CTG ACC ATC CGC 288Ala Ile Asp Asn Ala Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg85 90 95CTC GAA GGC GGC GTC GAG CCG AAC AAG CCG CTG CGC TAC AGC TAC ACG 336Leu Glu Gly Gly Val Glu Pro Asn Lys Pro Leu Arg Tyr Ser Tyr Thr100 105 110CGC CAG GCG CGC GGC AGG TGG TCG CTG AAC TGG CTG GTA CCG ATC GGC 384Arg Gln Ala Arg Gly Arg Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly115 120 125CAC GAG AAG CCC TCG AAC ATC AAG GTG TTC ATC CAC GAA CTG AAC GCC 432His Glu Lys Pro Ser Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala130 135 140GGC AAC CAG CTC AGC CAC ATG TCG CCG ATC TAC ACC ATC GAG ATG GGC 480Gly Asn Gln Leu Ser His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly145 150 155 160GAC GAG TTG CTG GCG AAG CTG GCG CGC GAT GCC ACC TTC TTC GTC AGG 528Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg165 170 175GCG CAC GAG AGC AAC GAG ATG CAG CCG ACG CTC GCC ATC AGC CAT GCC 576Ala His Glu Ser Asn Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala180 185 190GGG GTC AGC GTG GTC ATG GCC CAG AAC CAG CCG CGC CGG GAA AAG CGC624Gly Val Ser Val Val Met Ala Gln Asn Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg195 200 205TGG AGC GAA TGG GCC AGC GGC AAG GTG TTG TGC CTG CTC GAC CCG CTG672Trp Ser Glu Trp Ala Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu210 215 220GAC GGG GTC TAC AAC TAC CTC GCC CAG CAA CGC TGC AAC CTC GAC GAT720Asp Gly Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp225 230 235 240ACC TGG GAA GGC AAG ATC TAC CGG GTG CTC GCC GGC AAC CCG GCG AAG768Thr Trp Glu Gly Lys Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys245 250 255CAT GAC CTG GAC ATC AAA CCC ACG GTC ATC AGT GAA GAG CTG GAG TTT816His Asp Leu Asp Ile Lys Pro Thr Val Ile Ser Glu Glu Leu Glu Phe260 265 270CCC GAG GGC GGC AGC CTG GCC GCG CTG ACC GCG CAC CAG GCT TGC CAC864Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His275 280 285CTG CCG CTG GAG ACT TTC ACC CGT CAT CGC CAG CCG CGC GGC TGG GAA912Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu290 295300CAA CTG GAG CAG TGC GGC TAT CCG GTG CAG CGG CTG GTC GCC CTC TAC960Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr305 310 315 320CTG GCG GCG CGG CTG TCG TGG AAC CAG GTC GAC CAG GTG ATC CGC AAC 1008Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn325 330 335GCC CTG GCC AGC CCC GGC AGC GGC GGC GAC CTG GGC GAA GCG ATC CGC 1056Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg340 345 350GAG CAG CCG GAG CAG GCC CGT CTG GCC CTG ACC CTG GCC GCC GCC GAG 1104Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu355 360 365AGC GAG CGC TTC GTC CGG CAG GGC ACC GGC AAC GAC GAG GCC GGC GCG 1152Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala370 375 380GCC AAC GCC GAC GTG GTG AGC CTG ACC TGC CCG GTC GCC GCC GGT GAA 1200Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu385 390 395 400TGC GCG GGC CCG GCG GAC AGC GCC GAC GCC CTG CTG GAG GCG AAC TAT 1248Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Ala Asn Tyr405 410 415CCC ACT GGC GCG GAG TTC CTC GGC GAC GGC GGC GAC GTC AGC TTC AGC 1296Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser420 425 430ACC CGC GGC ACG CAG AAC TGG ACG GTG GAG CGG CTG CTC CAG GCG CAC 1344Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His435 440 445CGC CAA CTG GAG GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC TAC CAC GGC ACC 1392Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr450 455 460TTC CTC GAA GCG GCC CAA AGC ATC GTC TTC GGC GGG GTG CGC GCG CGC 1440Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg465 470 475 460AGC CAG GAC CTC GAC GCG ATC TGG CGC GGT TTC TAT ATC GCC GGC GAT 1488Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ila Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp485 490 495CCG GCG CTG GCC TAC GGC TAC GCC CAG GAC CAG GAA CCC GAC GCA CGC 1536Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg500 505 510GGC CGG ATC CGC AAC GGT GCC CTG CTG CGG GTC TAT GTG CCG CGC TCG 1584Gly Ars Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser515 520 525AGC CTG CCG GGC TTC TAC CGC ACC AGC CTG ACC CTG GCC GCG CCG GAG 1632Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu530 535 540GCG GCG GGC GAG GTC GAA CGG CTG ATC GGC CAT CCG CTG CCG CTG CGC 1680Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ila Gly His Pro Leu Pro Leu Arg545 550 555 560CTG GAC GCC ATC ACC GGC CCC GAG GAG GAA CGC GGG CGC CTG GAG ACC 1728Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr565 570 575ATT CTC GGC TGG CCG CTG GCC GAG CGC ACC GTG GTG ATT CCC TCG GCG 1776Ile Leu Gly Trp Pro Teu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala580 585 590ATC CCC ACC GAC CCG CGC AAC GTC GGC GGC GAC CTC GAC CCG TCC AGC 1824Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser595 600 605ATC CCC GAC AAG GAA CAG GCG ATC AGC GCC CTG CCG GAC TAC GCC AGC 1872Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser610 615 620CAG CCC GGC AAA CCG CCG CGC GAG GAC CTG AAG TAA 1908Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys625 630 635(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度635氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Glu His Trp Ser Tyr Trp Leu Arg Pro Gly Glu Ala Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ala Phe Asp Len Trp Asn Glu20 25 30Cys Ala Lys Ala Cys Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser35 40 45Arg Met Ser Val Asp Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val50 55 60Leu His Tyr Ser Met Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Glu Leu65 70 75 80Ala Ile Asp Asn Ala Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg85 90 95Leu Glu Gly Gly Val Glu Pro Asn Lys Pro Leu Arg Tyr Ser Tyr Thr100 105 110Arg Gln Ala Arg Gly Arg Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly115 120 125His Glu Lys Pro Ser Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Geu Asn Ala130 135 140Gly Asn Gln Leu Ser His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly145 150 155 160Asp Glu Leu Leu Ala Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg165 170 175Ala His Glu Ser Asn Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala180 185 190Gly Val Ser Val Val Met Ala Gln Asn Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg195 200 205Trp Ser Glu Trp Ala Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu210 215 220Asp Gly Val Tyr Asn Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Len Asp Asp225 230 235 240Thr Trp Gln Gly Lys Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys245 250 255His Asp Leu Asp Ile Lys Pro Thr Val Ile Ser Glu Glu Leu Glu Phe260 265 270Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His275 280 285Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu290 295 300Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr305 310 315 320Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn325 330 335Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg340 345 350Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Gln355 360 365Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala370 375 380Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu385 390 395 400Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Ala Asn Tyr405 410 415Pro Thr Gly Ala Glu Phr Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser420 425 430Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His435 440 445Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr450 455 460Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg465 470 475 480Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp485 490 495Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg500 505 5l0Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser515 520 525Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu530 535 540Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg545 550 555 560Leu Asp ALa Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr565 570 575Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala580 585 590Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser595 600 605Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ila Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser610 615 620Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys625 630 635(2) SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1191堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞編碼序列(B)位置1...1188(D)其它信息
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ATG GAG CAC TGG TCC TAT TGG CTG CGC CCT GGA GAA GCT GGA GGA GGA48Met Glu His Trp Ser Tyr Trp Leu Arg Pro Gly Glu Ala Gly Gly Gly1 5 10 15GGA TCC GGA GGA GGA GGA TCC GGT CAA GCT TTT GTT AAC GCC CAT ATG96Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ala Phe Val Asn Ala His Met20 25 30GCC GAA GAG GGC GGC AGC CTG GCC GCG CTG ACC GCG CAC CAG GCT TGC 144Ala Glu Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys35 40 45CAC CTG CCG CTG GAG ACT TTC ACC CGT CAT CGC CAG CCG CGC GGC TGG 192His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp50 55 60GAA CAA CTG GAG CAG TGC GGC TAT CCG GTG CAG CGG CTG GTC GCC CTC 240Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu65 70 75 80TAC CTG GCG GCG CGG CTG TCG TGG AAC CAG GTC GAC CAG GTG ATC CGC 288Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg85 90 95AAC GCC CTG GCC AGC CCC GGC AGC GGC GGC GAC CTG GGC GAA GCG ATC 336Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile100 105 110CGC GAG CAG CCG GAG CAG GCC CGT CTG GCC CTG ACC CTG CCC GCC GCC 384Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala115 120 125GAG AGC GAG CGC TTC GTC CGG CAG GGC ACC GGC AAC GAC GAG GCC GGC 432Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly130 135 140GCG GCC AAC GCC GAC GTG GTG AGC CTG ACC TGC CCG GTC GCC GCC GGT 480Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Glyl45 150 155 160GAA TGC GCG GGC CCG GCG GAC AGC CCC GAC GCC CTG CTG GAG CGC AAC 528Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn165 170 175TAT CCC ACT GGC GCG GAG TTC CTC GGC GAC GGC GGC GAC GTC AGC TTC 576Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe180 1a5 190AGC ACC CGC GGC ACG CAG AAC TGG ACG GTG GAG CGG CTG CTC CAG GCG 624Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala195 200 205CAC CGC CAA CTG GAG GAG CGC GGC TAT GTG TTC GTC GGC TAC CAC GGC 672His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly
210 215220ACC TTC CTC GAA GCG GCG CAA AGC ATC GTC TTC GGC GGG GTG CGC GCG 720Thr Phe Leu Glu ALa Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly GIy Val Arg Ala225 230 235 240CGC AGC CAG GAC CTC GAC GCG ATC TGG CGC GGT TTC TAT ATC GCC GGC 768Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly245 250 255GAT CCG GCG CTG GCC TAC GGC TAC GCC CAG GAC CAG GAA CCC GAC GCA816Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala260 265 270CGC GGC CGG ATC CGC AAC GGT GCC CTG CTG CGG GTC TAT GTG CCG CGC864Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg275 280 285TCG AGC CTG CCG GGC TTG TAC CGC ACC AGC CTG ACC CTG GCC GCG CCG912Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro290 295 300GAG GCG GCG GGC GAG GTC GAA CGG CTG ATC GGC CAT CCG CTG CCG CTG960Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu305 310315 320CGC CTG GAC GCC ATC ACC GGC CCC GAG GAG GAA GGC GGG CGC CTG GAG 1008Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu325 330 335ACC ATT CTC GGC TGG CCG CTG GCC GAG CGC ACC GTG GTG ATT CCC TCG 1056Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser340 345 350GCG ATC CCC ACC GAC CCG CGC AAC GTC GGC GGC GAC CTC GAC CCG TCC 1104Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser355 360 365AGC ATC CCC GAC AAG GAA CAG GCG ATC AGC GCC CTG CCG GAC TAC GCC 1152Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala370 375 380AGC CAG CCC GGC AAA CCG CCG CGC GAG GAC CTG AAG TAA 1191Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys385 390 395(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度396氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白
(ⅴ)片段類型內(nèi)部的(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Met Glu His Trp Ser Tyr Trp Leu Arg Pro Gly Glu Ala Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ala Phe Val Asn Ala His Met20 25 30Ala Glu Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys35 40 45His Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp50 55 50Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu65 70 75 80Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg85 90 95Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile100 105 110Arg Glu Gln gro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala115 120 125Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly130 135 140Ala Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly145 150 155 160Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn165 170 175Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe180 185 190Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala195 200 205His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly210 215 220Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala225 230 235 240Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly245 250 255Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala260 265 270Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg275 280 285Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Asg Thr Ser Leu Thr leu Ala Ala Pro290 295 300Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu305 310 315 320Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu325 330 335Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser340 345 350Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Vel Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser355 360 365Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala370375 380Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys385 390 395(2)SEQ ID NO:5的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度5氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(Ⅺ)序列描述SEQ ID NO:5:Gly Gly Gly Gly Ser1 5(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp1 5 10(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser1 5 10 15Leu Asp
權(quán)利要求
1．一種在生物樣本中檢測腫瘤細胞的方法，包括將生物樣本與嵌合毒素接觸，并在樣本中檢測嵌合毒素結(jié)合細胞，所述嵌合毒素包括促性腺激素釋放激素和假單胞菌外毒素A。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述的生物樣本中包含腺癌細胞。
3．權(quán)利要求2的方法，其中所述腺癌細胞選自結(jié)腸腺癌，胸腺癌，肺腺癌，卵巢腺癌，子宮內(nèi)膜腺癌，緊腺癌，肝腺癌，前列腺腺癌，胃腺癌；子宮頸腺癌，膽囊腺癌和胰腺腺癌。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述假單胞菌外毒素是全長毒素。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述的假單胞菌外毒素僅包括全長毒素中的結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ。
6．權(quán)利要求1的方法，其中嵌合毒素包括如SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
7．權(quán)利要求6的方法，其中嵌合毒素由包括如SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。
8．權(quán)利要求1的方法，其中所述的嵌合毒素包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述的嵌合毒素由包括如SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼。
10．權(quán)利要求1的方法，其中所述的假單胞菌外毒素處理成為非細胞毒性的。
11．權(quán)利要求10的方法，其中通過缺失一個氨基酸殘基使假單胞菌外毒素成為非細胞毒性的。
12．權(quán)利要求1的方法，其中嵌合毒素包括如SEQ ID NO:2所示但其中氨基酸殘基#575缺失的氨基酸序列。
13．權(quán)利要求12的方法，其中嵌合毒素由一種多核苷酸編碼，此多核苷酸包括如SEQ ID NO:1所示的而核苷酸#1822-1824缺失的核苷酸序列。
14．權(quán)利要求1的方法，其中嵌合毒素包括如SEQ ID NO:4所示而其中氨基酸殘基#336缺失的氨基酸序列。
15．權(quán)利要求14的方法，其中嵌合毒素由一種多核苷酸編碼，此多核苷酸包括如SEQ ID NO:3所示而核苷酸#1105-1107缺失的核苷酸序列。
16．權(quán)利要求1的方法，其中所述的嵌合毒素與一種可檢測的標記物結(jié)合。
17．權(quán)利要求16的方法，其中所述的可檢測標記物為放射性同位素，熒光染料，酶，超聲探針或NMR探針。
18．權(quán)利要求1的方法，其中所述的生物樣本為活檢樣本。
19．權(quán)利要求1的方法，其中所述的生物樣本為體液。
20．權(quán)利要求19的方法，其中所述的體液為全血。
21．權(quán)利要求19的方法，其中所述的體液為胸膜滲出液。
22．權(quán)利要求19的方法，其中所述的體液為尿。
23．一種在人類受試者中檢測腫瘤細胞的方法，包括向受試者施加一種包括促性腺激素釋放激素和假單胞菌外毒素A的嵌合毒素，并在受試者中檢測嵌合毒素結(jié)合細胞。
24．權(quán)利要求23的方法，其中所述的受試者為腺癌。
25．權(quán)利要求24的方法，其中所述腺癌選自結(jié)腸腺癌，胸腺癌，肺腺癌，卵巢腺癌，子宮內(nèi)膜腺癌，腎腺癌，肝腺癌，前列腺腺癌，胃腺癌，子宮頸腺癌，膽囊腺癌和胰腺癌．
26．權(quán)利要求1的方法，其中假單胞菌外毒素處理為非細胞毒性的。
27．權(quán)利要求26的方法，其中通過缺失一個氨基酸殘基使假單胞菌外毒素為非細胞毒性。
28．權(quán)利要求1的方法，其中嵌合毒素包括如SEQ ID NO:2的氨基酸序列，而其中氨基酸殘基#575缺失。
29．權(quán)利要求28的方法，其中嵌合毒素由一種多核苷酸編碼，此多核苷酸包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，而其中核苷酸#1822-1824缺失。
30．權(quán)利要求1的方法，其中嵌合毒素包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，而其中氨基酸殘基#336缺失。
31．權(quán)利要求30的方法，其中嵌合毒素由一種多核苷酸編碼，此多核苷酸包括如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，而其中核苷酸#1105-1107缺失。
32．權(quán)利要求23的方法，其中嵌合毒素與一種可探測的標記物結(jié)合。
33．權(quán)利要求32的方法，其中可探測的標記物為放射性同位素，熒光染料，酶，超聲探針或NMR探針。
34．一種包括促性腺激素釋放激素和假單胞菌外毒素A的嵌合毒素，此毒素結(jié)合但不殺死腫瘤細胞。
35．權(quán)利要求34的嵌合毒素，它包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列但其中氨基酸殘基#575缺失。
36．權(quán)利要求35的嵌合毒素，它由包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的多核苷酸編碼，但此多核苷酸中核苷酸#1822-1824缺失。
37．權(quán)利要求34的嵌合毒素，它包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，但此氨基酸序列中氨基酸殘基#336缺失。
38．權(quán)利要求37的嵌合毒素，它由包括如SEQ ID NO:3所示但序列中核苷酸#1105-1107缺失的多核苷酸編碼。
全文摘要
本發(fā)明涉及應用一種嵌合毒素進行癌癥診斷的方法。具體地說,本發(fā)明涉及應用由促性腺激素釋放激素(GnRH)和假單胞菌外毒素A(PE)組成的嵌合毒素檢測人腺癌表達的腫瘤相關(guān)表位。以與腫瘤細胞結(jié)合而不殺死腫瘤細胞的突變GnRH－PE分子為例證明。
文檔編號C07K7/23GK1303438SQ99806580
公開日2001年7月11日 申請日期1999年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月24日
發(fā)明者H·羅爾伯布姆－加爾斯基, A·本-耶胡達, A·內(nèi)楚施坦, S·雅科尼, I·馬里爾諾夫斯基 申請人:耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發(fā)展公司