診斷和監(jiān)視癌癥的體外方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種診斷和/或監(jiān)測(cè)和/或預(yù)測(cè)癌癥疾病進(jìn)展的體外方法，其特征在于在至少一個(gè)樣本中Tregs細(xì)胞與至少另一組T細(xì)胞的比率被測(cè)定，所述另一組T細(xì)胞是包含Th17細(xì)胞，Th1細(xì)胞和/或Th2的組。
【專利說明】診斷和監(jiān)視癌癥的體外方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明證明了在癌癥過程中尤其是卵巢癌的進(jìn)展中腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞模式 (pattern)的改變，并清楚地顯示了從效應(yīng)T細(xì)胞的存在所代表的活化的抗腫瘤免疫應(yīng)答 到疾病晚期的顯著免疫抑制的動(dòng)態(tài)改變（dynamic shift)，其中所述效應(yīng)T細(xì)胞在上皮性 卵巢癌（EOC)的早期階段占優(yōu)勢(shì)，壓制了 T調(diào)節(jié)細(xì)胞（Tregs)。
[0002] 出現(xiàn)于腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞類型在患者生存中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。然而，對(duì)于 疾病進(jìn)展過程中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的動(dòng)態(tài)（dynamics)知之甚少。已經(jīng)在疾病的不同階段 對(duì)浸潤(rùn)于卵巢癌患者的腫瘤組織中的免疫細(xì)胞進(jìn)行研究。卵巢癌進(jìn)展的早期階段是以強(qiáng) Thl7免疫應(yīng)答為特征，然而在II期患者中觀察到大量Thl細(xì)胞的募集。
[0003] 在擴(kuò)散型腫瘤（III-IV期）中，檢測(cè)到Helios+活化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs)的 優(yōu)勢(shì)種群（dominant population)并伴隨有大量的巨噬細(xì)胞和髓樣樹突狀細(xì)胞（mDCs)。腫 瘤浸潤(rùn)Tregs較循環(huán)Tregs具有顯著更低的CCR4表達(dá)，并且腫瘤浸潤(rùn)Tregs的數(shù)量與卵巢 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中CCL22的水平顯著相關(guān)，這暗示著它們的募集是通過CCR4/CCL22 相互作用進(jìn)行。CCL22在原發(fā)性卵巢腫瘤中主要由腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和mDCs產(chǎn)生，并且它 的表達(dá)在應(yīng)答于IFNy時(shí)明顯增加。綜上，Tregs的特異性募集（可能由炎性刺激觸發(fā)的） 導(dǎo)致卵巢癌進(jìn)展階段的顯著免疫抑制。
[0004] 以上總結(jié)的發(fā)現(xiàn)用于診斷和監(jiān)視各種癌癥尤其是卵巢癌癥的體外方法中。該方法 是利用鑒定不同的細(xì)胞類型，優(yōu)選通過使用細(xì)胞表面的標(biāo)記物。受T細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫力包 含多種不同的T細(xì)胞。細(xì)胞毒性T細(xì)胞例如是以表面CD8抗原（MHC I類受體）為特征。T 輔助細(xì)胞可以分為多個(gè)亞群。本發(fā)明最相關(guān)的T細(xì)胞具有表面標(biāo)記物CD4+(MHC II類）， 并尤其包含提高中性粒細(xì)胞應(yīng)答和已知的尤其對(duì)細(xì)胞外細(xì)菌有效的CD4+Thl7細(xì)胞。假定 Thl7細(xì)胞在腫瘤中是具有殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)。另一個(gè)有趣的細(xì)胞群被稱之為Treg，其為 CD4+調(diào)節(jié)T細(xì)胞。這種類型的細(xì)胞抑制T細(xì)胞應(yīng)答。通常這類細(xì)胞具有避免擴(kuò)大的免疫應(yīng) 答（an exaggerated immune response)的作用。但是在腫瘤細(xì)胞中，假定Treg細(xì)胞的出 現(xiàn)下調(diào)了針對(duì)腫瘤細(xì)胞的機(jī)體自身免疫防疫并由此最終增強(qiáng)了腫瘤的生長(zhǎng)。 現(xiàn)有技術(shù)
[0005] Cannon 等人（Expert Opin. Biol. Ther.，2011 ;441_445)記載了針對(duì)卵巢癌癥的 樹突狀細(xì)胞疫苗。討論了 Thl7在癌癥免疫治療中的可能角色。
[0006] Kryczek 等人（J. Immunol.，2011，4388-4395)記載了一個(gè)命名為 Foxp3+CD4+ 的調(diào) 節(jié)型T細(xì)胞亞群。假定這些細(xì)胞在如慢性潰瘍性結(jié)腸炎或癌癥的病理微環(huán)境中可能是炎性 Treg細(xì)胞。
[0007] Leveque 等人（J. Immunother.，2009, 101-108)報(bào)道了在 IL-2 存在下刺激體外分 離的上皮性卵巢癌相關(guān)的TMg將它們轉(zhuǎn)化為TH17細(xì)胞。
[0008] Curiel等人（Nature Medicine, 2004, 942-949)記載了在受卵巢癌影響的患者 中，人類腫瘤TMg細(xì)胞抑制腫瘤特異性T細(xì)胞免疫并對(duì)體內(nèi)人類腫瘤的生長(zhǎng)作出貢獻(xiàn)。
[0009] Zamarron 等人（Int. J. Biol. Sci.，2011，651-658)報(bào)道了 Thl7 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性 T 淋 巴細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子在促進(jìn)或抑制癌癥發(fā)展中發(fā)揮了雙重作用。它們?cè)诎┌Y進(jìn)展中 的最終作用可能主要取決于腫瘤微環(huán)境。
[0010] Tosolini等人（Cancer Res.，2011，1263-1271)記載了結(jié)腸直腸癌患者中浸潤(rùn)的 T細(xì)胞毒性和輔助細(xì)胞（Thl，Th2，TMg，Thl7)的不同分類的臨床影響。
[0011] Kryczek等人（Blood, 2009, 1141-1149)記載了癌癥患者中Thl7細(xì)胞的活性作用。 研究了卵巢癌患者中的Thl7細(xì)胞，相關(guān)機(jī)制以及臨床意義。
[0012] Chi 等人（Clinical and Experimental Immunology, 2010, 480-489)記載了 T 輔 助類型17 (Thl7)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Ireg)在炎癥的發(fā)病機(jī)理和自身免疫紊亂中的重要作用。 討論了腫瘤和外周血中這些細(xì)胞的貢獻(xiàn)。
[0013] 現(xiàn)有技術(shù)并沒有提出測(cè)量Ireg細(xì)胞和另一個(gè)T細(xì)胞群，尤其是Thl7的比率，以及 將該比率用于預(yù)后和潛在的治療策略。
[0014] 發(fā)明背景
[0015] 卵巢癌是全球女性中十大最常見惡性疾病之一，并且在婦科癌癥中具有最高的死 亡率。由于缺少敏感和特異性的生物標(biāo)記物以及由于該疾病趨于發(fā)展和傳播迅速的特點(diǎn)， 幾乎70%的患者是在腫瘤擴(kuò)散的晚期階段被診斷，具有很差的預(yù)后。雖然傳統(tǒng)治療導(dǎo)致在 80%以上的卵巢癌中惡性細(xì)胞數(shù)量的顯著減少，但由于少量的抗化療腫瘤細(xì)胞的存在導(dǎo)致 大多數(shù)患者在2-5年內(nèi)經(jīng)歷最終致死性的復(fù)發(fā)。為了改善卵巢癌患者的預(yù)后以及腫瘤治療 的更好適應(yīng)性，因此需要更好的預(yù)兆型標(biāo)記物和新的治療策略，從而能分別鑒定高風(fēng)險(xiǎn)患 者和消除復(fù)發(fā)可能性。
[0016] 免疫監(jiān)視被提議是在癌癥發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。免疫缺陷小鼠中的實(shí) 驗(yàn)已經(jīng)顯示免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別并根除腫瘤。但是，雖然癌癥細(xì)胞能引發(fā)腫瘤特異性免疫 應(yīng)答，但是腫瘤與宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用不可能導(dǎo)致疾病的臨床消退（clinical regression)，反而發(fā)展出腫瘤組織中免疫抑制性的微環(huán)境，從而促進(jìn)免疫逃避。甚至，不能 確定的是由實(shí)驗(yàn)室小鼠獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在癌癥患者中也是有效的。
[0017] 盡管不能根除確定的腫瘤，但是在癌癥患者中某些腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的出現(xiàn)能代 表強(qiáng)的預(yù)后性標(biāo)記物。已經(jīng)報(bào)道大量的腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D3+T細(xì)胞是與晚期卵巢癌患者的有利臨 床后果相關(guān)。更多最近的研究已經(jīng)報(bào)道存活的改善與CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量增多相關(guān)。 相反，腫瘤組織中大量的⑶4+⑶25+F 〇XP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs)，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞， 和B7-H4+巨噬細(xì)胞預(yù)示著一個(gè)很差的預(yù)后。對(duì)⑶4+輔助性T細(xì)胞的作用尚無太多文獻(xiàn)記 載，但是有很強(qiáng)的證據(jù)表明Thl7細(xì)胞可能在癌癥免疫中具有實(shí)質(zhì)性的作用（substantial players)〇
[0018] 促炎癥反應(yīng)的Thl7細(xì)胞主要與自身免疫性疾病和粘膜免疫相關(guān)。已經(jīng)證實(shí)Thl7 細(xì)胞在不同類型的腫瘤中出現(xiàn)，包括卵巢癌、頭和頸部癌癥、胃癌、乳癌、結(jié)腸直腸癌和前列 腺癌。雖然被廣泛的研究，但是Thl7細(xì)胞在腫瘤免疫和患者生存中的真實(shí)作用仍存在爭(zhēng) 論。一方面，IL-17生產(chǎn)細(xì)胞已經(jīng)被報(bào)道是促進(jìn)抗腫瘤免疫的，但是另一方面，IL-17已知是 作為能增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)的血管生成因子。
[0019] 大多數(shù)已發(fā)表的研究關(guān)注于不同類型的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的模式和預(yù)后重要性。 但是，對(duì)疾病進(jìn)展過程中腫瘤組織內(nèi)的免疫應(yīng)答的動(dòng)態(tài)知道很少。上皮性卵巢癌（EOC)不 同階段中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DCs)和巨噬細(xì)胞的分布、表型以及臨床病理 意義已經(jīng)被評(píng)估。本發(fā)明的結(jié)果證明了在癌癥發(fā)展過程中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞模式的變化， 并清楚地顯示了從效應(yīng)Thl7細(xì)胞（在EOC早期階段超過Tregs)的浸潤(rùn)到疾病晚期中顯著 Treg累積的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例
[0021] 免疫學(xué)領(lǐng)域中常使用的多個(gè)術(shù)語用于本發(fā)明中。對(duì)于術(shù)語的含義我們由此尤其參 考了以下教科書：
[0022] -Janeway's Immunobiology,第 7 版,Kenneth Murphy, Paul Travers, Mark Walport(2008)
[0023] -Fundamental Immunology,第 6 版，William E. Paul (2008)，Wolters Kluwer, or
[0024] -Pezzutto, Ulrichs, Burmester ；Taschenatlas der Immunologie, Thieme,第 2 版（2007)，
[0025] 其包含了⑶標(biāo)記物和其解釋，細(xì)胞因子和其常用的縮寫的一個(gè)很長(zhǎng)的列表 (extensive list)〇
[0026] 本發(fā)明中形成了以下觀點(diǎn)：
[0027] A)Thl7淋巴細(xì)胞在腫瘤組織中累積，并且它們的比例與疾病進(jìn)展呈負(fù)性相關(guān)
[0028] Thl7淋巴細(xì)胞在100 %被分析的卵巢腫瘤樣本中被檢測(cè)到（區(qū)間=0. 06-22. 8%)。取自于局限性疾?。‵IG0 I期）患者的腫瘤組織中的Thl7細(xì)胞在⑶4+T細(xì)胞亞群 中的比例顯著高于取自于罹患擴(kuò)散性疾病（FIG0 III-IV期）患者的（參見圖1A，B)。全腫 瘤來源單細(xì)胞懸液中Thl7細(xì)胞的頻率顯示同樣的模式，這意味著Thl7細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在 晚期疾病中顯著減少。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，11-17和IL-21在早期患者腫瘤組織來源的細(xì)胞培養(yǎng) 上清液中的濃度是明顯高于在非刺激培養(yǎng)物以及PM-和伊屋諾霉素（ionomycin)刺激的 培養(yǎng)物中的濃度（參見圖1C)。盡管在疾病更晚期Thl7細(xì)胞比例顯著降低，腫瘤浸潤(rùn)Thl7 細(xì)胞的比例當(dāng)與患者外周血比較時(shí)仍是顯著升高（參見圖ID)。Thl7細(xì)胞在單獨(dú)外周血中 的頻率并不預(yù)示著腫瘤組織中Thl7細(xì)胞的數(shù)量或比例。但是它可以被用作控制的目的。
[0029] B)腫瘤浸潤(rùn)Tregs的比例在腫瘤組織中是升高的并隨著疾病的進(jìn)展增加
[0030] 與Thl7細(xì)胞相反，來自于患有擴(kuò)散性疾病（FIG0 III-IV期）患者的腫瘤組織中 的⑶4+⑶25+CD127_F〇XP3+Treg S當(dāng)與來自于I期疾病患者的樣本比較時(shí)是顯著升高的（參 見圖2A，B)。腫瘤浸潤(rùn)Tregs(Ti-Treg s)的比例顯著高于來自于處于疾病各期患者的外周 血中發(fā)現(xiàn)的比例（參見圖2C)。為了更好地表征Ti-Tregs的狀況，轉(zhuǎn)錄因子Helios(Treg 活化的標(biāo)記物）也被分析。EOC患者中Helios+Tregs在腫瘤組織中的比例（67. 8±2· 5% ) 顯著高于外周血中的比例（56. 3±4. 2% )(參見圖2D)。Helios+Tregs的比例在疾病的不同 期中沒有區(qū)別。疾病進(jìn)展過程中穩(wěn)定的Ti-Tregs的增長(zhǎng)比例進(jìn)一步通過基于實(shí)時(shí)定量PCR 的甲基化分析證實(shí)，該分析評(píng)估了穩(wěn)定的Tregs (在腫瘤組織來源的單細(xì)胞懸液中在FoxP3 TSDR位點(diǎn)去甲基）的百分比（參見圖2E)。在相同的腫瘤中Tregs和Thl7淋巴細(xì)胞的比 例是呈負(fù)相關(guān)（r =-0. 44, p〈0. 01)(參見圖2F)，然而Tregs的比例與巨噬細(xì)胞的數(shù)量呈正 相關(guān)（r = 0· 47, ρ〈0· 01)(圖 2G)。
[0031] C)疾病進(jìn)展過程中Thl和⑶8+Τ淋巴細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞（DCs)和巨噬細(xì)胞的比例 沒有出現(xiàn)明顯變化
[0032] 除了 Thl7細(xì)胞和Tregs，還在腫瘤組織中分析了其他免疫細(xì)胞亞群（包括Thl細(xì) 胞，CD8+T細(xì)胞，pDCs，髓樣樹突狀細(xì)胞（mDCs)以及巨噬細(xì)胞）的存在。雖然在晚期腫瘤中 mDC和巨噬細(xì)胞的比例呈上升趨勢(shì)（參見圖3)，但是這些細(xì)胞類型中沒有一種在卵巢癌進(jìn) 展過程中顯示出任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的動(dòng)態(tài)。
[0033] D)腫瘤來源的單細(xì)胞懸液的細(xì)胞因子和趨化因子譜支持極化的Th淋巴細(xì)胞募集 到腫瘤組織中而不是在它們的原位引發(fā)并極化
[0034] 為了更好的表征腫瘤微環(huán)境和評(píng)估是否細(xì)胞因子譜支持T淋巴細(xì)胞的原位引發(fā) 和極化，評(píng)定腫瘤來源細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子和趨化因子譜。在未刺激的培養(yǎng)上清中， 僅檢測(cè)到3種量大的細(xì)胞因子IL-6, IL-10和TNFa (參見圖4A)。IL-2, IL-4, IL-12,和 IL-23的水平在多數(shù)受檢患者樣本中是低于MILLIPLEX?試驗(yàn)的檢測(cè)極限，IL-17僅在I期 疾病患者的細(xì)胞懸液中檢測(cè)到。重要的是，I期患者雖然有最高比例的腫瘤浸潤(rùn)性Thl7細(xì) 胞，但在其培養(yǎng)上清液中僅檢測(cè)到最小濃度的IL-I β (4. 2±2. 5pg/ml)，而IL-I β對(duì)Thl7 極化至關(guān)重要（參見圖4C)。除了 IL-17,在無刺激培養(yǎng)中沒有觀察到與疾病進(jìn)展的其它顯 著相關(guān)性。在PM和伊屋諾霉素（ionomycin)刺激中，除了 IL-12和IL-23,大多數(shù)被檢測(cè) 的細(xì)胞因子都有生成（參見圖4A)。處于疾病晚期的患者的培養(yǎng)上清液中IL-21的生產(chǎn)較 來自于I期患者的培養(yǎng)上清液明顯減少（參見圖1C)。在所有患者樣本中觀察到TGF β mRNA 的表達(dá)并且與疾病階段無顯著相關(guān)（圖4D)。
[0035] 無刺激的腫瘤來源細(xì)胞生產(chǎn)大量的CCL20和CCL22以及炎性的CXCL9和 CXCLlO (參見圖 4B)，卻生產(chǎn)少量的 CCL2, CCL5, CCL17, CCL19 和 CCL21。CCL22 (參見圖 5A)，CXCL9和CXCLlO (未顯示）的水平在疾病進(jìn)展過程中增加，但是這些數(shù)據(jù)并不具有統(tǒng)計(jì) 學(xué)顯著性。CXCL9 的水平與腫瘤浸潤(rùn) CD4+(r = 0· 65, ρ〈0· 01)和 CD8+(r = 0· 64, ρ〈0· 01)T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著相關(guān)。與特定的Th淋巴細(xì)胞亞群無相關(guān)性（未顯示）。最重要的是， CCL22水平與Ti-Tregs數(shù)量顯著相關(guān)（r = 0· 66, ρ〈0· 01)(圖5B)。未發(fā)現(xiàn)趨化因子與腫 瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞之間的其它相關(guān)性。
[0036] Ε) Tregs有可能通過CCL22/CCR4相互作用被募集到腫瘤組織并在原位增殖
[0037] 如前面所記載的，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ti-Tregs的數(shù)量與CCL22水平顯著相 關(guān)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，Ti-Tregs與來自于外周血的Tregs相比CCR4顯著低表達(dá)（平均熒光 強(qiáng)度分別為6, 280±35和3, 487±333 ;η = 6)(參見圖5C)。為了評(píng)價(jià)Ti-Tregs是否原位 增殖，對(duì)腫瘤組織來源的細(xì)胞上清液和PBMCs進(jìn)行Ki67染色。與外周血中的Tregs比較， 顯著更高百分比的Ti-Tregs表達(dá)Ki67(分別為2L 8±5· 1%和12. 9土L 8% ;n = 6)。與 Tregs相比，Ki67在很低比例的傳統(tǒng)⑶4+FoxP3_T細(xì)胞上表達(dá)（腫瘤組織中7. 6 ± 2. 7 %，夕卜 周血中2. 3±0· 4% )(參見圖E)。
[0038] F)在IFN Y刺激下，卵巢癌細(xì)胞系生產(chǎn)趨化因子，包括CCL22
[0039] 為了評(píng)估卵巢癌細(xì)胞系是否能夠生產(chǎn)CCL22,將0V-90和SK0V3細(xì)胞在無刺激或用 重組人IFN γ刺激的條件下培養(yǎng)，因?yàn)镮FN γ已經(jīng)顯示在乳癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)CCL22的生產(chǎn)。 對(duì)比于原發(fā)性腫瘤來源的細(xì)胞上清液，自發(fā)的CCL22分泌在卵巢癌細(xì)胞系中是不能檢測(cè)到 的，該結(jié)果與本研究中所檢測(cè)的大多數(shù)其它趨化因子類似。SK0V3細(xì)胞系自發(fā)性地生產(chǎn)少量 的CXCL9 (參見圖6A)，然而未經(jīng)刺激的0V-90細(xì)胞生產(chǎn)大量的CXCL9, CXCLlO和CCL20 (參 見圖6B)。添加IFN γ在兩種被測(cè)細(xì)胞系中誘導(dǎo)了 CCL19, CCL21和CCL22的大量分泌。令 人吃驚的是，在IFN γ刺激下，CXCL9, CXCLlO和CCL20的生產(chǎn)在SK0V3細(xì)胞中增加但是在 0V-90細(xì)胞中減少（參見圖6A，B)。
[0040] G)在IFN γ刺激下，原發(fā)性卵巢腫瘤來源的細(xì)胞的CCL22生產(chǎn)顯著增加 [0041] 為了評(píng)價(jià)IFNy對(duì)原發(fā)性腫瘤來源的單細(xì)胞懸液的作用，分離自患者腫瘤組織（η =6)的細(xì)胞培養(yǎng)于正^^存在下。如圖6(：所顯示，正^^刺激下僅0(^21，0(^22和0乂(^10 在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的濃度是增加的，觀測(cè)到CCL22有最顯著的增加。作為CCL22分 泌的來源，EpCAM+腫瘤細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和mDCs在無刺激培養(yǎng)物和經(jīng)過刺激的培養(yǎng)物中進(jìn)行 鑒別（參見圖6D)。
[0042] 本發(fā)明提供了一種診斷和/或監(jiān)測(cè)和/或預(yù)測(cè)癌癥疾病進(jìn)展的體外（ex vivo)方 法，其中在至少一個(gè)樣本中測(cè)定Tregs細(xì)胞與至少一組另外的T細(xì)胞（包含Thl7細(xì)胞，Thl 細(xì)胞和/或Th2細(xì)胞的組）的比值。
[0043] 本發(fā)明中所記載的體外方法的優(yōu)勢(shì)在于能更好地診斷特定類型的腫瘤。哪種治療 劑應(yīng)該施用給患者常常是決定性的。通過更好的表征癌癥的類型，能夠使治療適于使患者 受益。
[0044] 在此公開的體外（in vitro)方法優(yōu)選用于將卵巢癌患者劃分為特定的風(fēng)險(xiǎn)組， 是能通過有區(qū)別地強(qiáng)化的輔助化療進(jìn)行治療的組。為了治療患有卵巢癌的患者，知曉該 患者所患癌癥的類型這是有實(shí)質(zhì)性優(yōu)勢(shì)的。雖然在一組患者中施用強(qiáng)化的化療可能是有 益處的，然而在另一組患者中同樣的治療可能有相反的作用。靜脈內(nèi)給予卡鉬和紫杉醇 (paclitaxel)通常被認(rèn)為是卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案?？紤]到轉(zhuǎn)移性卵巢癌主要連累腹膜表 面，活性的化療劑也可以通過腹膜內(nèi)途徑給予?？蛇x擇地，基于鉬的化療也可以用。其它化 療藥物，如脂質(zhì)體化多柔比星（liposomal doxorubicin)和拓?fù)涮婵担╰opotecan)或吉西 他濱（gemcitabine)也可以用。
[0045] 另一個(gè)可選用的治療方案是異環(huán)磷酰胺（iphosphamid),順鉬（cisplatin)和紫 杉醇，其中優(yōu)選異環(huán)磷酰胺與順鉬組合或異環(huán)磷酰胺與紫杉醇組合。本發(fā)明公開的體外方 法允許為通過體外（ex vivo)診斷方法測(cè)定的特定風(fēng)險(xiǎn)組選擇最有效的化療。
[0046] 根據(jù)所選治療的效果來監(jiān)測(cè)患者癌癥的進(jìn)展也很重要。通過本發(fā)明記載的方法可 以實(shí)施體外（ex vivo)診斷方法和觀察通過特定治療所獲得的效果。在獲得所述診斷方法 的結(jié)果之后可以決定治療模式是否繼續(xù)、調(diào)整或改變。進(jìn)一步地更好的預(yù)測(cè)癌癥疾病的進(jìn) 展通常是想要的。
[0047] 在本發(fā)明的體外（in vitro)方法中，樣本經(jīng)過這樣一種方式治療以至于Treg細(xì) 胞與Thl7細(xì)胞或Treg細(xì)胞與Thl和/或Th2細(xì)胞的比率被測(cè)定。在本發(fā)明的一個(gè)特定優(yōu) 選實(shí)施例中Treg細(xì)胞與Thl7細(xì)胞的比例被測(cè)定。該測(cè)定是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的 方法實(shí)施。通常細(xì)胞是通過針對(duì)該類細(xì)胞群體特有的特異性表面標(biāo)記物的抗體來鑒定。也 可以組合使用多種針對(duì)特異性表面標(biāo)記物的抗體。然而重要的是至少一種針對(duì)表面標(biāo)記 物的抗體被使用，該表面標(biāo)記物對(duì)特定的細(xì)胞類型是特異的。為了鑒定Treg細(xì)胞，優(yōu)選使 用至少一種、優(yōu)選至少2種和更優(yōu)選至少3種選自由抗-⑶3,抗-⑶4,抗⑶8,抗-⑶25， 抗-CD127和抗-CR4構(gòu)成的組的抗體、尤其優(yōu)選抗FoxP3和/或抗-Helios。
[0048] 細(xì)胞特征通常是通過流式細(xì)胞分析進(jìn)行（熒光激活細(xì)胞分選術(shù)，F(xiàn)ACS)，其允許測(cè) 定細(xì)胞群體。在一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施例中，測(cè)定細(xì)胞是否屬于Treg細(xì)胞群或?qū)儆赥hl7細(xì) 胞群。
[0049] 用于區(qū)別方法（differentiation method)中的樣本可以來自于癌組織或癌組織 的轉(zhuǎn)移部位。例如這樣的樣本可以是手術(shù)后從患者中去除的，當(dāng)原發(fā)性腫瘤或大的轉(zhuǎn)移性 腫瘤去除時(shí)這是常見的。樣本也可以由活組織檢查獲得。
[0050] 可選擇地，樣本可以來自于細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞可來源于腫瘤組織?？梢约羲槟[ 瘤組織并分離腫瘤細(xì)胞，將它們培養(yǎng)在常規(guī)條件下。但是需要注意避免因添加細(xì)胞因子到 生長(zhǎng)培養(yǎng)基中導(dǎo)致的錯(cuò)誤結(jié)果，細(xì)胞因子可能對(duì)細(xì)胞區(qū)別具有影響。
[0051] 為了控制的目的可以要求在來自于血液的細(xì)胞上實(shí)施本發(fā)明記載的方法，尤其是 來自于外周單核血細(xì)胞。
[0052] 腫瘤組織中不同類型的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的存在和預(yù)后價(jià)值已經(jīng)被廣泛研究，然 而對(duì)于疾病進(jìn)展過程中腫瘤組織內(nèi)的免疫細(xì)胞模式的變化知道的很少。為了研究癌癥組織 內(nèi)免疫細(xì)胞分布的動(dòng)態(tài)，選擇足夠的早期和晚期疾病患者至關(guān)重要。然而，由于僅有少于 15%的EOC患者在I期時(shí)被診斷出，因此在前瞻性研究中對(duì)早期卵巢癌病灶的微環(huán)境的研 究非常困難。盡管很難獲得早期疾病患者的新鮮腫瘤組織樣品，仍有6份I期患者的腫瘤 樣本能與來自更晚期疾?。↖I-IV期）的患者的38個(gè)腫瘤樣本一起分析。
[0053] 所述實(shí)驗(yàn)的主要部分已經(jīng)在患有卵巢癌的患者中實(shí)施。但猜測(cè)所測(cè)T細(xì)胞的比率 變化的一般規(guī)律會(huì)隨癌癥進(jìn)展而類似地變化。因此本發(fā)明公開的方法能用于所有類型的癌 癥，尤其是前列腺癌、乳癌、結(jié)腸癌。然而優(yōu)選的是體外（in vitro)診斷方法的使用應(yīng)用于 患有卵巢癌的患者。
[0054] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)⑶4+T細(xì)胞的不同亞型，而不是其它的免疫細(xì)胞類型，在疾病進(jìn)展過程 中存在并展示出明顯不同的模式。實(shí)際上，EOC的早期階段是以強(qiáng)的Thl7免疫應(yīng)答為特點(diǎn) (參見圖1A)，然而在疾病的晚期階段檢測(cè)到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)種群（參見圖2A)。令人 吃驚的是，⑶8+T淋巴細(xì)胞與pDCs并沒有顯示出任何實(shí)質(zhì)性改變，然而mDCs和巨噬細(xì)胞的 比例在疾病進(jìn)展過程中出現(xiàn)增加。Thl細(xì)胞的比例在II期腫瘤中輕微增加然后在疾病晚期 再降低。然而，mDCs和巨噬細(xì)胞的變化以及Thl細(xì)胞中的變化均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。一種 類似的CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞動(dòng)力學(xué)已經(jīng)在EAE和感染的小鼠模型中記載，即Thl7的早期爆 發(fā)被大量的IFNy生產(chǎn)細(xì)胞取代。
[0055] 與這些發(fā)現(xiàn)一致的，Lohr 等人（Microbiol. Infect. 2009, 11，589-593)將抗原特 異性T細(xì)胞轉(zhuǎn)入至表達(dá)被所述T細(xì)胞識(shí)別的抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠中，發(fā)現(xiàn)依次是Thl7發(fā)展再 是Thl效應(yīng)性T細(xì)胞發(fā)展然后是疾病晚期Treg發(fā)展。該動(dòng)態(tài)還沒有在人類腫瘤的微環(huán)境 中描述，不確定由小鼠模型中獲得的檢測(cè)結(jié)果是否能轉(zhuǎn)至人類。
[0056] 值得注意的是，腫瘤浸潤(rùn)性Thl7細(xì)胞的來源以及它們?cè)谀[瘤免疫中的真正作用 仍有爭(zhēng)議。Kryczek等人[Blood (2009)，114, 1141-1149]已報(bào)道分離自EOC組織的巨噬細(xì) 胞能夠體外誘導(dǎo)Thl7細(xì)胞。但是，由于IL-I β，IL-6和IL-23被認(rèn)為對(duì)人Thl7細(xì)胞的分 化是必不可少的，那些在本申請(qǐng)中觀察到的腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞因子譜（cytokine profile), 尤其是IL-I β在I期患者中的非常低水平和IL-23的完全缺乏（參見圖4C)，不支持Thl7 原位極化的假設(shè)。已經(jīng)顯示Thl7運(yùn)輸可通過CCR6/CCL20軸調(diào)節(jié)。令人吃驚的是，在本研 究中未觀察到腫瘤組織中Thl7細(xì)胞的數(shù)量和CCL20水平之間的相關(guān)性。
[0057] 對(duì)比于Thl7細(xì)胞，更加多的研究關(guān)注于腫瘤中Tregs的運(yùn)輸特性和預(yù)后重要性。 Curiel等人[Nat. Med. (2004) 10, 942-949]已顯示浸潤(rùn)卵巢癌組織的Tregs在體內(nèi)和體外 有效地抑制TAA特異性免疫并對(duì)腫瘤生長(zhǎng)做出貢獻(xiàn)。這些作者還提出Treg腫瘤運(yùn)輸可由 CL22調(diào)節(jié)。通過CCL22/CCR4將Treg募集到腫瘤組織最近已經(jīng)在乳癌患者中得到證實(shí)。
[0058] 本研究中已顯示Ti-Tregs主要為Hel ios+激活的Tregs。大量的這些Ti-Tregs在 FoxP3 TSDR中去甲基。自然發(fā)生的，而不是體外TGFP誘導(dǎo)的，F(xiàn)oxp3+Tregs已顯示出穩(wěn)定 的Foxp3表達(dá)，其與TSDR的選擇性去甲基化反應(yīng)相關(guān)。類似地，Ikaros家族成員，Helios, 已經(jīng)被報(bào)道為一種標(biāo)記物用于區(qū)分天然發(fā)生的胸腺來源的Tregs (nTregs)和從天然⑶4+T 經(jīng)外周誘導(dǎo)的Tregs (iTregs)，但是這些發(fā)現(xiàn)最近被質(zhì)疑。因此，與其用于區(qū)分nTregs和 iTregs，Helios表現(xiàn)出可用于指示活化Tregs而不考慮它們的來源。綜上所述，本發(fā)明公 開的EOC組織內(nèi)Ti-Tregs中發(fā)現(xiàn)的Helios高表達(dá)和TSDR去甲基化，標(biāo)示了這些細(xì)胞的穩(wěn) 定性和高度活化狀態(tài)。
[0059] 與關(guān)于Treg腫瘤運(yùn)輸?shù)难芯恳恢碌兀呀?jīng)證實(shí)了在卵巢腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 Ti-Tregs的數(shù)量與CCL22的濃度高度相關(guān)。一致性地，Ti-Tregs與循環(huán)的Tregs比較，CCR4 表達(dá)明顯更低。低水平的CCR4反應(yīng)了其因CCL22的主動(dòng)參與（active engagement)所致 的內(nèi)在化。還發(fā)現(xiàn)了大量比例的Ti-Tregs(21.8±5. 1% )表達(dá)增殖標(biāo)記物Ki67,這意味著 它們的大量局部擴(kuò)增。
[0060] Faget 等人[Cancer Research (2011)，71，6143-6152]已經(jīng)證實(shí)了 IFN Y 觸發(fā)乳 腺腫瘤細(xì)胞生產(chǎn)CCL22。實(shí)際上，腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)物（尤其是巨噬細(xì)胞和NK細(xì) 胞）之間的協(xié)作已經(jīng)顯示出對(duì)誘導(dǎo)大量CCL22是必不可少的。同樣地，觀察到卵巢癌細(xì)胞 系在IFNy刺激下生產(chǎn)趨化因子，包括大量的CCL22。最重要的是，在原發(fā)性卵巢癌組織來 源的細(xì)胞中，重組IFN γ選擇性擴(kuò)大CCL22生產(chǎn)但對(duì)其他所檢測(cè)的趨化因子僅有很小的作 用（參見圖6C)。在我們的研究中，腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和mDCs被確定為癌癥組織樣本中 CCL22的關(guān)鍵來源。
[0061] 總之，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，在卵巢癌患者中抗腫瘤免疫應(yīng)答的發(fā)展是高度動(dòng)態(tài)的。 在疾病的早期階段觀察到Thl7細(xì)胞的強(qiáng)大的募集，緊隨其后為Thl細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和mDCs 的募集。在EOC的稍晚期，IFNy水平的升高（可能由遷移細(xì)胞生產(chǎn)的），以及巨噬細(xì)胞和 mDCs的比例的升高可能促成了 CCL22的生產(chǎn)和通過CCL22/CCR4的Tregs募集，由此促進(jìn)了 抑制性微環(huán)境的發(fā)展。由于公開的研究結(jié)果清楚地展現(xiàn)了在晚期EOC中由活性的抗腫瘤免 疫應(yīng)答到顯著的免疫抑制的動(dòng)態(tài)改變，因此新的癌癥免疫治療方案的研發(fā)應(yīng)該不僅包括免 疫增強(qiáng)策略還應(yīng)該靶向晚期疾病中的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境。
[0062] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)于圖中：
[0063] 圖 1
[0064] 按照疾病的分期的原發(fā)性卵巢腫瘤組織和外周血中Thl7細(xì)胞的比例表示為％ Thl7淋巴細(xì)胞相關(guān)于所有⑶4+T細(xì)胞。
[0065] ㈧數(shù)據(jù)以⑶4+T細(xì)胞中的Thl7淋巴細(xì)胞的比例表示，代表了每一期的平均值。
[0066] ⑶散點(diǎn)圖門控于⑶3+CD4+細(xì)胞，顯示了在兩個(gè)代表性患者中的IL-17和IFN Y。
[0067] (C)柱代表了由PMA+伊屋諾霉素（ionomycin)刺激的腫瘤組織來源的細(xì)胞生產(chǎn)的 IL-17和IL-21的均值+標(biāo)準(zhǔn)誤（S. E. M)。
[0068] (D)柱代表了腫瘤組織和外周血單核細(xì)胞（PBMC)中Thl7細(xì)胞的平均比例+標(biāo)準(zhǔn) 誤。*ρ〈0· 05, **ρ〈0· Ol (A, ANOVA 后面跟著 Scheff6 檢驗(yàn)；D,成對(duì) t 檢驗(yàn)）。
[0069] g| 2
[0070] 按照疾病分期的原發(fā)性卵巢腫瘤組織和外周血中Tregs的比例。
[0071] (A)數(shù)據(jù)以CD4+T細(xì)胞中的CD4+CD25+CD127-FoxP3+Tregs的比例表示，代表了每一 期的平均值。
[0072] (B)散點(diǎn)圖門控于⑶3+⑶4+細(xì)胞，顯示了在兩個(gè)代表性患者中的 CD25+FoxP3+Tregs。
[0073] (C)柱代表了腫瘤組織和PBMC中Tregs的平均比例+標(biāo)準(zhǔn)誤。
[0074] (D)散點(diǎn)圖門控于⑶3+⑶4+CD25+⑶127_細(xì)胞，顯示了一個(gè)代表性患者腫瘤組織中 的 FoxP3+Helios+Tregs。箱線圖代表 CD^z+CDzs+CDlZTT7OxPS+Tregs 中 Helios+Tregs 的比例。 箱邊緣代表了第25和第75個(gè)百分點(diǎn)，箱內(nèi)線代表中值。須代表第10和第90個(gè)百分點(diǎn)。
[0075] (E)柱代表分離自疾病不同期的原發(fā)性卵巢腫瘤組織的細(xì)胞中FoxP3TSDR去甲基 的Tregs的比例。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤。
[0076] (F)線顯示了 ％腫瘤浸潤(rùn)Tregs和％ Thl7細(xì)胞之間的負(fù)性相關(guān)。
[0077] (G)線顯示％腫瘤浸潤(rùn)Tregs和腫瘤浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞數(shù)量之間的負(fù)性相關(guān)。 *p〈0. 05, #p〈0. 01 (A, ANOVA 后面跟著 Scheff6 檢驗(yàn)；C, D,成對(duì) t 檢驗(yàn)）。
[0078] g| 3
[0079] 依據(jù)疾病分期的原發(fā)性卵巢腫瘤組織中Thl淋巴細(xì)胞、髓樣樹突狀細(xì)胞（mDCs)和 巨噬細(xì)胞的比例。（A)數(shù)據(jù)表示為⑶4+T細(xì)胞中⑶3+⑶4+IFN γ +Thl細(xì)胞的平均比例+標(biāo) 準(zhǔn)誤。（B)柱代表在IM分離的腫瘤來源細(xì)胞中⑶45+系TlLA-DR+⑶14XDllc+mDCs的平均數(shù) 量+標(biāo)準(zhǔn)誤。（C)柱代表在IM分離的腫瘤來源細(xì)胞中⑶45+系_HLA-DR +⑶14+巨噬細(xì)胞的 平均數(shù)量+標(biāo)準(zhǔn)誤。
[0080] g| 4
[0081] 腫瘤來源單細(xì)胞懸液中細(xì)胞因子和趨化因子譜。（A)白柱代表平均的自發(fā)的細(xì)胞 因子生產(chǎn)；黑柱代表在PM和伊屋諾霉素（ionomycin)刺激下細(xì)胞因子的生產(chǎn)。（B)柱代 表平均的自發(fā)性的趨化因子生產(chǎn)。所有的誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)誤。（C)點(diǎn)代表疾病進(jìn)展過程中 Thl7極化細(xì)胞因子和IL-17的平均自發(fā)性生產(chǎn)的動(dòng)態(tài)。（D)以β -肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)的 平均比例表示的點(diǎn)指示著在疾病進(jìn)展過程中TGFi3 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)。
[0082] 圖 5
[0083] 募集Tregs到卵巢腫瘤組織中可能是由CCL22介導(dǎo)的。（A)柱代表腫瘤組織來 源的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中CCL22(巨噬細(xì)胞來源的趨化因子）的生產(chǎn)+標(biāo)準(zhǔn)誤。（B)散點(diǎn)圖 代表CCL22生產(chǎn)和Ti-Tregs數(shù)量之間的正相關(guān)。（C)柱狀圖顯示了一個(gè)代表性患者的腫 瘤組織（黑線）和外周血（灰線，帶色彩的）中CD4+CD25 +CD127-FoxP3+Tregs上CCR4的表 達(dá)。柱代表腫瘤組織和外周血中⑶4+CD25+⑶127ToxP3+Tregs上CCR4的平均熒光強(qiáng)度+標(biāo) 準(zhǔn)誤（η = 6)。（D)柱代表腫瘤組織和外周血中增殖性Ki67+CD4+CD25+CD127ToxP3+Tregs 和CD4+FoxP3_傳統(tǒng)T細(xì)胞（Tconv)的平均比例+標(biāo)準(zhǔn)誤（η = 6)。（E)散點(diǎn)圖門控于 CD3+CD4+細(xì)胞，顯示了在一個(gè)代表性III期患者中Ki67+FoxP3+Tregs和FoxPSTconv的比 例。*ρ〈0·05(成對(duì)t檢驗(yàn)）
[0084] 里^
[0085] 在卵巢癌細(xì)胞系和患者中IFNy誘導(dǎo)趨化因子的生產(chǎn)。（A，B)柱代表了在有 (黑柱）或無 IFNy (白柱）刺激下卵巢癌細(xì)胞系中平均的趨化因子生產(chǎn)+標(biāo)準(zhǔn)誤。（C) 數(shù)據(jù)以IFNy刺激的原發(fā)性腫瘤來源的細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)比于無刺激培養(yǎng)的趨化因子水平的 平均倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)誤表示。（D)柱狀圖表示原發(fā)性腫瘤來源的細(xì)胞中CCL22的自發(fā) 性表達(dá)。細(xì)胞門控于⑶45-EpCAM +腫瘤細(xì)胞、⑶45+系-HLA-DR+⑶14+巨噬細(xì)胞和⑶45+ 系 IA-DR+CD14TD11 c+mDCs。
[0086] 圖 7
[0087] 顯示了卵巢癌的不同分期時(shí)Tregs和Thl7細(xì)胞之間比例的差異。圖7清楚的顯 示了 FIGO I期的平均值為0. 7左右，F(xiàn)IGO II期為6. 7左右，F(xiàn)IGO III/IV期為約47。
[0088] 實(shí)施例1
[0089] a)患者和組織樣本
[0090] 外周血和原發(fā)性卵巢上皮癌標(biāo)本獲自于2009年3月至2011年10月期間在布拉 格Motol大學(xué)醫(yī)院經(jīng)歷初次細(xì)胞減滅術(shù)的44位患者。研究中登記的患者在手術(shù)之前沒有 接受過新的輔助化療。所有的組織標(biāo)本在患者同意后收集，該研究是經(jīng)過Motol大學(xué)醫(yī)院 機(jī)構(gòu)審批委員為批準(zhǔn)。
[0091] 表 1
[0092]
【權(quán)利要求】
1. 診斷和/或監(jiān)測(cè)和/或預(yù)測(cè)癌癥疾病的進(jìn)展的體外方法，其特征為測(cè)定至少一個(gè)樣 本中Tregs細(xì)胞與包含Thl7細(xì)胞、Thl細(xì)胞和/或Th2細(xì)胞的組的至少另一組T細(xì)胞的比 率。
2. 權(quán)利要求1所述的體外方法，其特征在于為了確定Tregs細(xì)胞與所述另一組T細(xì)胞 組的比率，將Thl7細(xì)胞、Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞視為一個(gè)組。
3. 權(quán)利要求1或2的體外方法，其中所述診斷是用于將患者劃分為特定的風(fēng)險(xiǎn)組。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于測(cè)定Tregs細(xì)胞與Thl7細(xì)胞的比率。
5. 權(quán)利要求1-4所述的方法，其特征在于樣本來自于腫瘤或腫瘤來源的細(xì)胞培養(yǎng)。
6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的體外方法，其特征在于樣本是腫瘤的活組織檢查標(biāo)本。
7. 權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的體外方法，其特征在于樣本是卵巢癌樣本。
8. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的體外方法，其特征在于Tregs細(xì)胞的比率通過流式細(xì)胞 術(shù)分析來測(cè)定。
9. 權(quán)利要求8所述的體外方法，其特征在于對(duì)Tregs細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析是用至少 一種選自由抗 CD3,抗-CD4,抗-CD8,抗-CD25,抗-CD127,抗-CR4,抗-FoxP3 和抗-Helios 構(gòu)成的組中的抗體進(jìn)行表面染色。
10. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的體外方法，其特征在于Tregs細(xì)胞對(duì)比于其它T細(xì)胞的 比率是通過ELISA測(cè)定。
11. 權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的體外方法，其特征在于Tregs細(xì)胞的百分比是通過實(shí)時(shí) PCR測(cè)定。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的在測(cè)試個(gè)體內(nèi)診斷和/或監(jiān)測(cè)和/或預(yù)測(cè)癌癥疾病的進(jìn)展 的體外方法，所述方法包含步驟： a. 測(cè)量來自于所述測(cè)試個(gè)體的樣本中Tregs細(xì)胞和選自于由Thl7細(xì)胞、Thl細(xì)胞和/ 或Th2細(xì)胞構(gòu)成的組中的至少另一組T細(xì)胞的數(shù)量； b. 確定步驟a)中所測(cè)量的所述Tregs細(xì)胞數(shù)量與所述至少另一組T細(xì)胞數(shù)量之間的 比率；和 c. 將步驟（b)中所確定的比率與預(yù)定的基線閾值比較，其中測(cè)出差異則指示癌癥。
13. 權(quán)利要求12所述的體外方法，進(jìn)一步包含步驟（d)，是基于步驟（b)確定的比率和 步驟（c)中所述的預(yù)定的基線閾值之間的關(guān)系，將所述測(cè)試個(gè)體劃分為特定的癌癥階段或 風(fēng)險(xiǎn)組。
14. 權(quán)利要求12所述的體外方法，其中所述的至少另一組T細(xì)胞包含Thl7細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK104364656SQ201380030845
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2013年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月2日
【發(fā)明者】J.巴滕科瓦, R.斯皮塞克 申請(qǐng)人:索蒂奧公司