一種細(xì)胞共養(yǎng)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞共養(yǎng)的方法，通過(guò)細(xì)胞共培養(yǎng)的手段觀察兩種不同類(lèi)型細(xì)胞之間的相互作用，有助于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)方面今后對(duì)細(xì)胞間相互關(guān)系的研究。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種細(xì)胞共養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種細(xì)胞共養(yǎng)的方法，有助于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)方面今后對(duì)細(xì)胞間相互關(guān)系的研究。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞是組成有機(jī)體的形態(tài)和功能的基本單位，自身又是由許多部分構(gòu)成的。關(guān)于結(jié)構(gòu)的研究不僅要知道它是由哪些部分構(gòu)成的，而且要進(jìn)一步搞清每個(gè)部分的組成。相應(yīng)地，關(guān)于功能不僅要知道細(xì)胞作為一個(gè)整體的功能，而且要了解各個(gè)部分在功能上的相互關(guān)系。有機(jī)體的生理功能和一切生命現(xiàn)象都是以細(xì)胞為基礎(chǔ)表達(dá)的。因此，不論對(duì)有機(jī)體的遺傳、發(fā)育以及生理機(jī)能的了解，還是對(duì)于作為醫(yī)療基礎(chǔ)的病理學(xué)、藥理學(xué)等以及農(nóng)業(yè)的育種等，細(xì)胞學(xué)都至關(guān) 重要。
[0003]對(duì)于研究細(xì)胞起了巨大推動(dòng)作用的是M.J.施萊登和T.A.H.施萬(wàn)。前者在1838年描述了細(xì)胞是在一種粘液狀的母質(zhì)中經(jīng)過(guò)一種像是結(jié)晶樣的過(guò)程產(chǎn)生的，而且首先產(chǎn)生出核(還發(fā)現(xiàn)核仁)。他并且把植物看作細(xì)胞的共同體,就好像水螅蟲(chóng)的群體一樣。在他的啟發(fā)下施萬(wàn)堅(jiān)信動(dòng)、植物都是由細(xì)胞構(gòu)成的。他積累了大量事實(shí)，指出二者在結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)中的一致性，于1839年提出了細(xì)胞學(xué)說(shuō)。與此同時(shí)，捷克動(dòng)物生理學(xué)家J.E.浦肯野提出原生質(zhì)的概念；德國(guó)動(dòng)物學(xué)家C.T.E.von西博爾德(1845)斷定原生動(dòng)物都是單細(xì)胞的。德國(guó)病理學(xué)家R.C.菲爾肖(1855)在研究結(jié)締組織的基礎(chǔ)上提出“一切細(xì)胞來(lái)自細(xì)胞”的名言，并且創(chuàng)立了細(xì)胞病理學(xué)。德國(guó)動(dòng)物學(xué)家M.舒爾策在1861年對(duì)細(xì)胞下了定義:“細(xì)胞是一團(tuán)具有一切生命特征的原生質(zhì)，細(xì)胞核處于其中?！?br> 細(xì)胞間相互關(guān)系是當(dāng)今醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的一個(gè)重要方向。要進(jìn)行這方面的研究往往離不開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)，特別是細(xì)胞共培養(yǎng)(coculture)。我們介紹一種簡(jiǎn)單易行的細(xì)胞共培養(yǎng)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞共養(yǎng)的方法，通過(guò)細(xì)胞共培養(yǎng)的手段觀察兩種不同類(lèi)型細(xì)胞之間的相互作用，有效提高藥物的生物利用度，延緩藥物的釋放，增強(qiáng)藥效，降低毒副作用，達(dá)到緩釋、長(zhǎng)效、靶向的目的。所介紹的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特點(diǎn)為:(1)簡(jiǎn)單易行，在一般實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行；(2)在共培養(yǎng)過(guò)程中可以清楚地觀察到2種細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，便于拍照等觀察，不象微孔底膜套皿不易觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；(3)在細(xì)胞接種時(shí)，玻片大小一樣，玻片上的細(xì)胞數(shù)可由每孔總的細(xì)胞數(shù)減去每孔剩余的細(xì)胞數(shù)而得，只要在實(shí)驗(yàn)前試驗(yàn)幾次即可得到；(4)共培養(yǎng)的是貼壁細(xì)胞，細(xì)胞不易交叉污染；(5)通過(guò)在篩網(wǎng)上再固定蓋玻片的方法還可觀察3種貼壁細(xì)胞的共培養(yǎng)情況；(6)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后可在玻片上進(jìn)行掃描電鏡、免疫組化等研究。
【具體實(shí)施方式】[0005](I)共培養(yǎng)的準(zhǔn)備，蓋玻片、24孔板、不銹鋼篩網(wǎng)；
(2)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，從組織中取細(xì)胞樣品分離鑒定培養(yǎng)；
(3)細(xì)胞共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，取單獨(dú)培養(yǎng)好的細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于24孔板中，加入血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞快呈融合生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，更換小牛血清的DMEM，每孔加入慶大霉素24小時(shí)后進(jìn)行共培養(yǎng)。
[0006]實(shí)施例1 (I)共培養(yǎng)的準(zhǔn)備::蓋玻片用玻璃刀裁成剛好能放入24孔板的正方形，按細(xì)胞培養(yǎng)用品要求清洗后消毒備用，不銹鋼篩網(wǎng)用剪刀剪成正方形，再把篩網(wǎng)的鋼絲彎成垂直于網(wǎng)面的支腳，大小以能放入24孔板孔為宜，使上下二層細(xì)胞相差1mm，清洗后消毒備用。
[0007](2)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng):大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞和大鼠腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定按文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行，培養(yǎng)成功后進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)，以觀察上述裝置培養(yǎng)細(xì)胞的可行性，實(shí)驗(yàn)前大鼠腎小管上皮細(xì)胞和大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞均作錐蟲(chóng)藍(lán)(0.4 %)染色，檢測(cè)細(xì)胞的活性狀態(tài)。
[0008](3)細(xì)胞共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn):將原代培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，按每孔I X IO5個(gè)細(xì)胞接種于預(yù)先放有備用蓋玻片的24孔板中，以含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞快呈融合生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，更換培養(yǎng)液為含1%小牛血清的DMEM，每孔加入200 μ g/ml慶大霉素24小時(shí)后進(jìn)行共培養(yǎng)。取第3代的大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，按每孔I X IO5細(xì)胞數(shù)植入24孔板內(nèi)以含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時(shí)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)液更換為含1%小牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，放入備用不銹鋼篩網(wǎng)，再放入上述長(zhǎng)有大鼠腎小管上皮細(xì)胞的蓋玻片，共培養(yǎng)48小時(shí)后，去蓋玻片及不銹鋼篩網(wǎng)，用四甲基偶氮多胍(MTT)摻入法測(cè)定大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖情況。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞共養(yǎng)的方法，其特征是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的: (1)共培養(yǎng)的準(zhǔn)備，蓋玻片、24孔板、不銹鋼篩網(wǎng)； (2)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，從組織中取細(xì)胞樣品分離鑒定培養(yǎng)； (3)細(xì)胞共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，取單獨(dú)培養(yǎng)好的細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于24孔板中，加入血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞快呈融合生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，更換小牛血清的DMEM，每孔加入慶大霉素24小時(shí)后進(jìn)行共培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞共養(yǎng)方法，其特征是:步驟(1)共培養(yǎng)的準(zhǔn)備:蓋玻片用玻璃刀裁成剛好能放入24孔板的正方形，按細(xì)胞培養(yǎng)用品要求清洗后消毒備用，不銹鋼篩網(wǎng)用剪刀剪成正方形，再把篩網(wǎng)的鋼絲彎成垂直于網(wǎng)面的支腳，大小以能放入24孔板孔為宜，使上下二層細(xì)胞相差1_，清洗后消毒備用。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞共養(yǎng)方法，其特征是:步驟(2)細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng):大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞和大鼠腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定按文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行，培養(yǎng)成功后進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)，以觀察上述裝置培養(yǎng)細(xì)胞的可行性，實(shí)驗(yàn)前大鼠腎小管上皮細(xì)胞和大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞均作錐蟲(chóng)藍(lán)(0.4%)染色，檢測(cè)細(xì)胞的活性狀態(tài)。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞共養(yǎng)方法，其特征是:步驟(3)細(xì)胞共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn):將原代培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞消化后計(jì)數(shù)，按每孔1 X 105個(gè)細(xì)胞接種于預(yù)先放有備用蓋玻片的24孔板中，以含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞快呈融合生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，更換培養(yǎng)液為含1%小牛血清的DMEM，每孔加入200 μ g/ml慶大霉素24小時(shí)后進(jìn)行共培養(yǎng)，取第3代的大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞，按每孔1 X 105細(xì)胞數(shù)植入24孔板內(nèi)以含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時(shí)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)液更換為含1%小牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，放入備用不銹鋼篩網(wǎng)，再放入上述長(zhǎng)有大鼠腎小管上皮細(xì)胞的蓋玻片，共培養(yǎng)48小時(shí)后，去蓋玻片及不銹鋼篩網(wǎng)，用四甲基偶氮多胍(MTT)摻入法測(cè)定大鼠腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖情況。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK103834612SQ201210481063
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月23日
【發(fā)明者】王英俊, 郝智慧, 張 浩 申請(qǐng)人:青島康地恩動(dòng)物藥業(yè)有限公司