專利名稱：沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液的制作方法
沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液 技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液；特別是一種沙眼衣原體細 胞營養(yǎng)液的配方及其制備方法。其主要成分是氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、 硫酸鎂、葡萄糖、氯化鈣、水解乳白蛋白、小牛血清、1%谷氨酰胺、2-巰基乙醇、青霉素、鏈霉 素、慶大霉素、EDTA、0.5X酚紅。沙眼衣原體生殖道感染是最常見性傳播性疾病之一。沙眼 衣原體還被認為是盆腔炎及其后遺癥——輸卵管不孕和異位妊娠的重要病因。孕婦患沙眼 衣原體宮頸炎，胎兒經(jīng)產(chǎn)道分娩時可感染沙眼衣原體結(jié)膜炎和肺炎。衣原體細胞培養(yǎng)法是 檢查衣原體最敏感、最可靠的方法。該細胞營養(yǎng)液能夠培養(yǎng)檢測生殖道衣原體，具有指導(dǎo)臨 床診斷和治療的作用，為防止濫用抗菌藥物也具有重要意義。常用McCoy細胞或Hela229 單層細胞培養(yǎng)，通過觀察細胞病變(腫大，變性，脫落)及細胞內(nèi)特征性包涵體可確定診斷。 其敏感性約為80% 90%，特異性為100%。并可用于藥物敏感試驗，還可檢測治療后病 人是否存在活的衣原體，以判定療效。該方法操作繁鎖、費時，設(shè)備昂貴，技術(shù)性強，臨床不 易推廣。沙眼衣原體需要在實驗室做細胞培養(yǎng)進行分離，因此，多年來細胞培養(yǎng)一直做為衣 原體檢測的"金標(biāo)準(zhǔn)"，細胞培養(yǎng)對設(shè)備、技術(shù)、標(biāo)本采集和運送等的要求都非常高，從尿道、 宮頸采集的柱狀細胞，不宜混有多核細胞及粘液膿性分泌物，不宜含有過多的雜質(zhì)。對采集 拭子也有要求應(yīng)是棉拭子而不應(yīng)是木制拭子，因為木制拭了可能抑制衣原體生長。宮頸內(nèi) 標(biāo)本有細胞刷可采集到更從的細胞以提高培養(yǎng)的敏感性。標(biāo)本必須放置在特制的轉(zhuǎn)運培基 中，冷凍，24小時內(nèi)包埋到細胞培養(yǎng)盤中。培養(yǎng)時McCoy細胞的狀態(tài)也會影響最終結(jié)果。當(dāng) McCoy細胞過度生長、變形、破裂甚至完全失去細胞形態(tài)時，則無從觀察細胞中的包涵體。細 胞培養(yǎng)無論在花費上、設(shè)備、技術(shù)方面都要求非常高，對于細胞培養(yǎng)來講，花費和時間是影 響衣原體細胞培養(yǎng)作為診斷方法使用和推廣的最大障礙。很多研究人員在細胞培養(yǎng)方法的 改進上進了多方面探索。
技術(shù)背景 生殖道感染發(fā)病率很高，流行范圍很廣，其病原菌50%為沙眼衣原 體；30%為尿素分解衣原體；20%由其他致病菌感染引起。所有沙眼衣原體均可在細胞培 養(yǎng)中生長，現(xiàn)多采用McCoy或HeLa229細胞株，在接種衣原體前，以X線照射細胞，或于細胞 培養(yǎng)中加入代謝抑制如細胞松弛素B、 DEAE葡聚糖呈放線菌酮，其目的在于細胞生長代謝 緩慢，以利于衣原體的寄生性生長。細胞培養(yǎng)無論在花費上、設(shè)備、技術(shù)方面都要求非常高， 對于細胞培養(yǎng)來講，花費和時間是影響衣原體細胞培養(yǎng)作為診斷方法使用和推廣的最大障 礙。目前，細胞培養(yǎng)仍是診斷衣原全感染最為可靠的實驗方法，習(xí)慣上把細胞培養(yǎng)作為"金 標(biāo)準(zhǔn)"。用細胞培養(yǎng)的方法來確定衣原體的感染涉及5個方面的影響因素①盡可能采集含 有較多上皮細胞的樣本；②在轉(zhuǎn)運培基中添加抗生素以防止標(biāo)本中細菌的過度生長； 使用抗代謝藥物抑制組織細胞的復(fù)制；⑤使用碘、Giemsa、免疫熒光染色來鑒定感染細胞中 的衣原體。本發(fā)明的目的在于提供一種沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液，與其它類試劑相比具備下 列特點沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液營養(yǎng)豐富、配制簡單、選擇性強和變色靈敏，與傳統(tǒng)試劑比 較，檢出率高，污染小，臨床應(yīng)用效果滿意.檢測方法簡單、時間短、準(zhǔn)確性強?？煞乐箻?biāo)本 中細菌的過度生長，培養(yǎng)組織細胞的復(fù)制得以抑制。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的要點在于選擇合適的組分，并進行合理混配，經(jīng)加溫、溶解、混合、冷卻、分裝、高溫滅菌等工藝而成一種沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液。
本發(fā)明選擇的培養(yǎng)基配方如下(克、ml/每升蒸餾水)氯化鈉70. 0-90. 0 ;磷酸氫 二鈉0. 5-0. 7 ;磷酸二氫鉀0. 5-0. 7 ;氯化鉀3. 0_5. 0 ;硫酸鎂1. 5-3. 0葡萄糖8. 0-12. 0 ; 氯化鈣1. 0-2. 0 ;水解乳白蛋白2. 0-3. 0 ;小牛血清10. 0-12. 0ml ;1%谷氨酰胺1. 0_1. 2ml ; 2-巰基乙醇0. 5-0. 6 ;青霉素、鏈霉素、慶大霉素(10000U/ml) 10. 0-15. 0ml ;EDTA 0. 1-0. 3 ; 0. 5%酚紅3. 0-5. 0ml ;雙蒸水加至1000ml ;調(diào)pH至7. 2-7. 4。 氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、氯化^、是組織細胞的 體液平衡必不可少的物質(zhì)；水解乳白蛋白、小牛血清、1%谷氨酰胺、是組織細胞的營養(yǎng)平衡 必不可少的物質(zhì)；青霉素、鏈霉素、慶大霉素是細胞培養(yǎng)過程中防止污染必不可少的物質(zhì)； 2-巰基乙醇、EDTA是細胞培養(yǎng)過程中起到組織塊的消化以提高細胞的產(chǎn)量。小牛血清使用 前要滅活(56°C，30min)，以消除補體活性。動物血清個體差異大，故而每一批血清都要嚴格 檢測，同時進行無菌試驗。優(yōu)質(zhì)血清應(yīng)該為淡黃色，透明，無溶血，無沉淀，滅活后顏色稍深。 生化檢測總蛋白含量3. 5 4. 5g/100ml，球蛋白不高于2g/100ml，保證試驗條件的穩(wěn)定。試 驗中加入小牛血清后，培養(yǎng)基的pH可能還會變化，故亦可先加入小牛血清后調(diào)pH值。培養(yǎng) 液配好后，應(yīng)先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37t:溫箱內(nèi)置24 48hr，以檢測培養(yǎng)液是否有 污染。每次配液量以兩周左右為宜，一次配液不要太多，防止?fàn)I養(yǎng)成分(主要為谷氨酰胺) 損失，造成實驗繁瑣或者污染。
本發(fā)明產(chǎn)品的制備方法是 1)、將氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、EDTA按比例進行 加溫、溶解； 2)、將氯化鈣按比例加熱溶解于蒸餾水中，冷至54°C ; 3)、將溶解的1)混合液緩緩加入到溶解的2)溶液中，(注意沉淀)混合、冷卻后 調(diào)PH7. 2-7. 4，加酚紅； 4)、將溶解的1%谷氨酰胺、2_巰基乙醇按比例加入上述混合液中，壓力蒸汽滅菌 115。C，20-30min，冷至50°C ; 5)、在無菌條件下加無菌的水解乳白蛋白、小牛血清、混合抗生素混合均勻；無菌 分裝，冷藏備用。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(l)沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液，配制簡單；(2)臨床應(yīng)用效果
滿意，解決了床邊接種的困難，污染小；(3)檢測方法簡單、時間短、選擇性強、變色靈敏、檢
出率高；(4)可防止標(biāo)本中細菌的過度生長，培養(yǎng)組織細胞的復(fù)制得以抑制。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明 按照下表所列數(shù)據(jù)(克、ml/每升蒸餾水)及其所述步驟進行配置
4配方一
氯化鈉70. 0-90. 0;磷酸氫二鈉O. 5-0. 7;磷酸二氫鉀0. 5-0. 7;氯化鉀3. 0-5. 0;硫酸 鎂1.5-3. 0葡萄糖8. 0-12.0;氯化鈣1.0-2.0;水解乳白蛋白2. 0-3. 0;小牛血清10. 0-12. 0 ml; 1%谷氨酰胺1.0-1.2 ml; 2 —巰基乙醇0. 5-0. 6;青霉素、鏈霉素、慶大霉素(10000U /ml)10.0-15. 0 ml; EDTA 0. 1-0. 3; 0. 5 %酚紅3. 0-5. 0 ml;雙蒸水加至1000 ml;調(diào)pH至 7.2 — 7.4。
配方二
氯化鈉70. 0-80. 0;磷酸氫二鈉0. 6-0. 7;磷酸二氫鉀0. 6-0. 7;氯化鉀4. 0-5. 0;硫酸 鎂2. 5-3.0葡萄糖9. 0-2. 0;氯化纟丐l. 5-2. 0;水解乳白蛋白2. 5-3. 0;小牛血清11.0-12. 0 ml; 1%谷氨酰胺1. 1-1.2 ml; 2 —巰基乙醇O. 5-0.6;青霉素、鏈霉素、慶大霉素(丄OOOOU /ml) 12.0-15.0 ml; EDTA 0.2-0.3; 0.5 %酚紅丄0-5. 0 ml;雙蒸水加至1000 ml;調(diào)pH至 7. 2 — 7. 4。
配方三
氯化鈉80. 0-90. 0;磷酸氫二鈉0. 5-0. 6;磷酸二氫鉀0. 5-0. 6;氯化鉀3.0-4.0;硫酸 鎂1. 5-2. O葡萄糖8. 0-10.0;氯化鈣1.0-1.5;水解乳白蛋白2. 0-2. 5;小牛血清IO. O-ll. 0 ml; PZ。谷氨酰胺1. 0-1. 1 ml; 2 —巰基乙醇O. 5-0.6;青霉素、鏈霉素、慶大霉素(IOOOOU /ml) 10. 0-13. 0 ml; EDTA 0.1-0.2; 0.5 %酚紅3. 0-4. 0 ml;雙蒸水加至1000 ml;調(diào)pH至 7. 2 — 7. 4。
權(quán)利要求
本發(fā)明涉及一種沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液，特別是一種沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液的配方及其制備方法，其特征在于具有如下配方(克、ml/每升蒸餾水)氯化鈉70.0-90.0；磷酸氫二鈉0.5-0.7；磷酸二氫鉀0.5-0.7；氯化鉀3.0-5.0；硫酸鎂1.5-3.0葡萄糖8.0-12.0；氯化鈣1.0-2.0；水解乳白蛋白2.0-3.0；小牛血清10.0-12.0ml；1％谷氨酰胺1.0-1.2ml；2-巰基乙醇0.5-0.6；青霉素、鏈霉素、慶大霉素(10000U/ml)10.0-15.0ml；EDTA 0.1-0.3；0.5％酚紅3.0-5.0ml；雙蒸水加至1000ml；調(diào)pH至7.2-7.4。
2. —種權(quán)利要求1所述沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液的制備方法，其特征在于具有如下的步驟1) 、將氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、EDTA按比例進行加 溫、溶解；2) 、將氯化鈣按比例加熱溶解于蒸餾水中，冷至54°C ;3) 、將溶解的1)混合液緩緩加入到溶解的2)溶液中，(注意沉淀)混合、冷卻后調(diào) PH7. 2-7. 4，加酚紅；4) 、將溶解的1%谷氨酰胺、2-巰基乙醇按比例加入上述混合液中，壓力蒸汽滅菌 115。C，20-30min，冷至50°C ;5) 、在無菌條件下加無菌的水解乳白蛋白、小牛血清、混合抗生素混合均勻；無菌分裝， 冷藏備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液；特別是一種沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液的配方及其制備方法。沙眼衣原體生殖道感染是最常見性傳播性疾病之一。沙眼衣原體還被認為是盆腔炎及其后遺癥——輸卵管不孕和異位妊娠的重要病因。衣原體細胞培養(yǎng)法是檢查衣原體最敏感、最可靠的方法。該細胞營養(yǎng)液能夠培養(yǎng)檢測生殖道衣原體，具有指導(dǎo)臨床診斷和治療的作用，為防止濫用抗菌藥物也具有重要意義。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)沙眼衣原體細胞營養(yǎng)液，營養(yǎng)豐富、配制簡單；(2)臨床應(yīng)用效果滿意，解決了床邊接種的困難，污染?。?3)檢測方法簡單、時間短、選擇性強、變色靈敏、檢出率高；(4)可防止標(biāo)本中細菌的過度生長，培養(yǎng)組織細胞的復(fù)制得以抑制。
文檔編號C12Q1/04GK101698871SQ20081009341
公開日2010年4月28日 申請日期2008年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月21日
發(fā)明者曲奕 申請人:曲奕