專利名稱：尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液的制作方法
尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液 技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明涉及一種尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液；特別是一種尿道炎 衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液的配方及其制備方法。其主要成分是氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫 鉀、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、氯化鈣、水解乳白蛋白、小牛血清、1%谷氨酰胺、2-巰基乙醇、 青霉素、鏈霉素、慶大霉素、EDTA、0. 5%酚紅。沙眼衣原體生殖道感染是最常見性傳播性疾 病之一。沙眼衣原體還被認(rèn)為是盆腔炎及其后遺癥——輸卵管不孕和異位妊娠的重要病 因。孕婦患沙眼衣原體宮頸炎，胎兒經(jīng)產(chǎn)道分娩時(shí)可感染沙眼衣原體結(jié)膜炎和肺炎。衣原 體細(xì)胞培養(yǎng)法是檢查衣原體最敏感、最可靠的方法。該細(xì)胞培養(yǎng)維持液能夠培養(yǎng)檢測(cè)生殖 道衣原體，具有指導(dǎo)臨床診斷和治療的作用，為防止濫用抗菌藥物也具有重要意義。常用 McCoy細(xì)胞或Hela229單層細(xì)胞培養(yǎng)，通過觀察細(xì)胞病變(腫大，變性，脫落)及細(xì)胞內(nèi)特征 性包涵體可確定診斷。其敏感性約為80% 90%，特異性為100%。并可用于藥物敏感試 驗(yàn)，還可檢測(cè)治療后病人是否存在活的衣原體，以判定療效。該方法操作繁鎖、費(fèi)時(shí)，設(shè)備昂 貴，技術(shù)性強(qiáng)，臨床不易推廣。沙眼衣原體需要在實(shí)驗(yàn)室做細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行分離，因此，多年來 細(xì)胞培養(yǎng)一直做為衣原體檢測(cè)的"金標(biāo)準(zhǔn)"，細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)設(shè)備、技術(shù)、標(biāo)本采集和運(yùn)送等的要 求都非常高，從尿道、宮頸采集的柱狀細(xì)胞，不宜混有多核細(xì)胞及粘液膿性分泌物，不宜含 有過多的雜質(zhì)。對(duì)采集拭子也有要求應(yīng)是棉拭子而不應(yīng)是木制拭子，因?yàn)槟局剖昧丝赡芤?制衣原體生長(zhǎng)。宮頸內(nèi)標(biāo)本有細(xì)胞刷可采集到更從的細(xì)胞以提高培養(yǎng)的敏感性。標(biāo)本必須 放置在特制的轉(zhuǎn)運(yùn)培基中，冷凍，24小時(shí)內(nèi)包埋到細(xì)胞培養(yǎng)盤中。培養(yǎng)時(shí)McCoy細(xì)胞的狀態(tài) 也會(huì)影響最終結(jié)果。當(dāng)McCoy細(xì)胞過度生長(zhǎng)、變形、破裂甚至完全失去細(xì)胞形態(tài)時(shí)，則無從 觀察細(xì)胞中的包涵體。 細(xì)胞培養(yǎng)無論在花費(fèi)上、設(shè)備、技術(shù)方面都要求非常高，對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)來講，花費(fèi) 和時(shí)間是影響衣原體細(xì)胞培養(yǎng)作為診斷方法使用和推廣的最大障礙。很多研究人員在細(xì)胞 培養(yǎng)方法的改進(jìn)上進(jìn)了多方面探索。
技術(shù)背景 生殖道感染發(fā)病率很高，流行范圍很廣，其病原菌50%為沙眼衣原 體；30%為尿素分解衣原體；20%由其他致病菌感染引起。所有沙眼衣原體均可在細(xì)胞培 養(yǎng)中生長(zhǎng)，現(xiàn)多采用McCoy或HeLa229細(xì)胞株，在接種衣原體前，以X線照射細(xì)胞，或于細(xì)胞 培養(yǎng)中加入代謝抑制如細(xì)胞松弛素B、 DEAE葡聚糖呈放線菌酮，其目的在于細(xì)胞生長(zhǎng)代謝 緩慢，以利于衣原體的寄生性生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)無論在花費(fèi)上、設(shè)備、技術(shù)方面都要求非常高， 對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)來講，花費(fèi)和時(shí)間是影響衣原體細(xì)胞培養(yǎng)作為診斷方法使用和推廣的最大障 礙。目前，細(xì)胞培養(yǎng)仍是診斷衣原全感染最為可靠的實(shí)驗(yàn)方法，習(xí)慣上把細(xì)胞培養(yǎng)作為"金 標(biāo)準(zhǔn)"。用細(xì)胞培養(yǎng)的方法來確定衣原體的感染涉及4個(gè)方面的影響因素①盡可能采集含 有較多上皮細(xì)胞的樣本；②在轉(zhuǎn)運(yùn)培基中添加抗生素以防止標(biāo)本中細(xì)菌的過度生長(zhǎng)；③使 用抗代謝藥物抑制組織細(xì)胞的復(fù)制；④使用碘、Giemsa、免疫熒光染色來鑒定感染細(xì)胞中的 衣原體。本發(fā)明的目的在于提供一種尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液，與其它類試劑相比具 備下列特點(diǎn)尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液，營(yíng)養(yǎng)豐富、配制簡(jiǎn)單、選擇性強(qiáng)和變色靈敏，與 傳統(tǒng)試劑比較，檢出率高，污染小，臨床應(yīng)用效果滿意.檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、時(shí)間短、準(zhǔn)確性強(qiáng)。 可防止標(biāo)本中細(xì)菌的過度生長(zhǎng)，培養(yǎng)組織細(xì)胞的復(fù)制得以抑制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的要點(diǎn)在于選擇合適的組分，并進(jìn)行合理混配，經(jīng)加溫、溶
解、混合、冷卻、分裝、高溫滅菌等工藝而成一種尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液。 本發(fā)明選擇的培養(yǎng)基配方如下(克、ml/每升蒸餾水)氯化鈉70. 0-90. 0 ;磷酸氫
二鈉0. 5-0. 7 ;磷酸二氫鉀0. 5-0. 7 ;氯化鉀3. 0_5. 0 ;硫酸鎂1. 5-3. 0葡萄糖8. 0-12. 0 ;
氯化鈣1. 0-2. 0 ;水解乳白蛋白2. 0-3. 0 ;小牛血清10. 0-12. 0ml ;1%谷氨酰胺1. 0_1. 2ml ;
2-巰基乙醇0. 5-0. 6 ;青霉素、鏈霉素、慶大霉素(10000U/ml) 10. 0-15. 0ml ;EDTA 0. 1-0. 3 ;
0. 5%酚紅3. 0-5. 0ml ;雙蒸水加至1000ml ;調(diào)pH至7. 2-7. 4。 氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、氯化f丐、是組織細(xì)胞的 體液平衡必不可少的物質(zhì)；水解乳白蛋白、小牛血清、1%谷氨酰胺、是組織細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)平衡 必不可少的物質(zhì)；青霉素、鏈霉素、慶大霉素是細(xì)胞培養(yǎng)過程中防止污染必不可少的物質(zhì)； 2-巰基乙醇、EDTA是細(xì)胞培養(yǎng)過程中起到組織塊的消化以提高細(xì)胞的產(chǎn)量。小牛血清使用 前要滅活(56°C，30min)，以消除補(bǔ)體活性。動(dòng)物血清個(gè)體差異大，故而每一批血清都要嚴(yán)格 檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行無菌試驗(yàn)。優(yōu)質(zhì)血清應(yīng)該為淡黃色，透明，無溶血，無沉淀，滅活后顏色稍深。 生化檢測(cè)總蛋白含量3. 5 4. 5g/100ml，球蛋白不高于2g/100ml，保證試驗(yàn)條件的穩(wěn)定。試 驗(yàn)中加入小牛血清后，培養(yǎng)基的pH可能還會(huì)變化，故亦可先加入小牛血清后調(diào)pH值。培養(yǎng) 液配好后，應(yīng)先抽取少許放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37t:溫箱內(nèi)置24 48hr，以檢測(cè)培養(yǎng)液是否有 污染。每次配液量以兩周左右為宜，一次配液不要太多，防止?fàn)I養(yǎng)成分(主要為谷氨酰胺) 損失，造成實(shí)驗(yàn)繁瑣或者污染。
本發(fā)明產(chǎn)品的制備方法是 1)、將氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、EDTA按比例進(jìn)行 加溫、溶解； 2)、將氯化鈣按比例加熱溶解于蒸餾水中，冷至54°C ; 3)、將溶解的1)混合液緩緩加入到溶解的2)溶液中，(注意沉淀)混合、冷卻后 調(diào)PH7. 2-7. 4，加酚紅； 4)、將溶解的1%谷氨酰胺、2_巰基乙醇按比例加入上述混合液中，壓力蒸汽滅菌 115。C，20-30min，冷至50°C ; 5)、在無菌條件下加無菌的水解乳白蛋白、小牛血清、混合抗生素混合均勻；無菌 分裝，冷藏備用。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(l)尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液，營(yíng)養(yǎng)豐富、配制簡(jiǎn)單； (2)臨床應(yīng)用效果滿意，解決了床邊接種的困難，污染?。?3)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、時(shí)間短、選擇 性強(qiáng)、變色靈敏、檢出率高；(4)可防止標(biāo)本中細(xì)菌的過度生長(zhǎng)，培養(yǎng)組織細(xì)胞的復(fù)制得以 抑制。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明
按照下表所列數(shù)據(jù)(克、ml/每升蒸餾水)及其所述步驟進(jìn)行配置
配方一
氯化鈉70. 0-90. 0;磷酸氫二鈉O. 5-0. 7;磷酸二氫鉀0. 5-0. 7;氯化鉀3.0-5. 0;硫酸 鎂1.5-3.0葡萄糖8.0-12.0;氯化鈣1.0-2.0;水解乳白蛋白2. 0-3. 0;小牛血清10. 0-12. 0 ml; 1%谷氨酰胺1.0-1.2 ml; 2—巰基乙醇0. 5-0. 6;青霉素、鏈霉素、.慶大霉素(10000U /ml) 10. 0-15. 0 ml; EDTA 0.1-0.3; 0. 5 %酚紅3. 0-5. 0 ml;雙蒸水加至1000 ml;調(diào)pH至 7. 2—7. 4。
配方二
氯化鈉70. 0-80. 0;磷酸氫二鈉0. 6-0. 7;磷酸二氫鉀0. 6-0. 7;氯化鉀4.0-5.0;硫酸 鎂2. 5-3. 0葡萄糖9.0-12.0;氯化鈣1.5-2. 0;水解乳A蛋A 2. 5-3. 0;小牛血清11.0-12. 0 ml; 1%谷氨酰胺1. 1-1. 2 ml; 2—巰基乙醇0. 5-0. 6;青霉素、鏈霉素、慶大霉素(10000U /m1)12. 0-丄5. 0 ml; EDTA 0. 2-0. 3; 0. 5 %酚紅4. 0-5. 0 ml;雙蒸水加至1000 ml;調(diào)pH至 7. 2 — 7. 4。
配方三
氯化鈉80. 0-90. 0;磷酸氫二鈉0. 5-0. 6;磷酸二氫鉀0. 5-0. 6;氯化鉀3. 0-4. 0;硫酸 鎂1.5-2. O葡萄糖8.0-10.0;氯化鈣1.0-1.5;水解乳白蛋白2. 0-2. 5;小牛血清IO. 0-11. 0 ml; 1%谷氨酰胺l.O-丄.1 ml; 2—巰基乙醇0. 5-0. 6;青霉素、鏈霉素、慶大霉素(10000U /ml) 10. 0-13. 0 m丄;EDTA 0.卜0. 2; 0. 5 %酚紅3. 0-4. 0 m丄;雙蒸水加至1000 ml;調(diào)pH至 7. 2 — 7. 4。
權(quán)利要求
本發(fā)明涉及一種尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液，特別是一種尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液的配方及其制備方法，其特征在于具有如下配方(克、ml/每升蒸餾水)氯化鈉70.0-90.0；磷酸氫二鈉0.5-0.7；磷酸二氫鉀0.5-0.7；氯化鉀3.0-5.0；硫酸鎂1.5-3.0葡萄糖8.0-12.0；氯化鈣1.0-2.0；水解乳白蛋白2.0-3.0；小牛血清10.0-12.0ml；1％谷氨酰胺1.0-1.2ml；2-巰基乙醇0.5-0.6；青霉素、鏈霉素、慶大霉素(10000U/ml)10.0-15.0ml；EDTA 0.1-0.3；0.5％酚紅3.0-5.0ml；雙蒸水加至1000ml；調(diào)pH至7.2-7.4。
2. —種權(quán)利要求1所述尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液的制備方法，其特征在于具有如下的步驟1) 、將氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂、葡萄糖、EDTA按比例進(jìn)行加 溫、溶解；2) 、將氯化鈣按比例加熱溶解于蒸餾水中，冷至54°C ;3) 、將溶解的1)混合液緩緩加入到溶解的2)溶液中，(注意沉淀)混合、冷卻后調(diào) PH7. 2-7. 4，加酚紅；4) 、將溶解的1%谷氨酰胺、2-巰基乙醇按比例加入上述混合液中，壓力蒸汽滅菌 115。C，20-30min，冷至50°C ;5) 、在無菌條件下加無菌的水解乳白蛋白、小牛血清、混合抗生素混合均勻；無菌分裝， 冷藏備用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液；特別是一種尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液的配方及其制備方法。沙眼衣原體生殖道感染是最常見性傳播性疾病之一。沙眼衣原體還被認(rèn)為是盆腔炎及其后遺癥——輸卵管不孕和異位妊娠的重要病因。孕婦患沙眼衣原體宮頸炎，胎兒經(jīng)產(chǎn)道分娩時(shí)可感染沙眼衣原體結(jié)膜炎和肺炎。衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法是檢查衣原體最敏感、最可靠的方法。該細(xì)胞維持液能夠培養(yǎng)檢測(cè)生殖道衣原體，具有指導(dǎo)臨床診斷和治療的作用，為防止濫用抗菌藥物也具有重要意義。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)尿道炎衣原體細(xì)胞培養(yǎng)維持液營(yíng)養(yǎng)豐富、配制簡(jiǎn)單；(2)臨床應(yīng)用效果滿意，解決了床邊接種的困難，污染?。?3)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、時(shí)間短、選擇性強(qiáng)、變色靈敏、檢出率高；(4)可防止標(biāo)本中細(xì)菌的過度生長(zhǎng)，培養(yǎng)組織細(xì)胞的復(fù)制得以抑制。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101698872SQ20081009341
公開日2010年4月28日 申請(qǐng)日期2008年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月21日
發(fā)明者曲奕 申請(qǐng)人:曲奕