專利名稱：一種能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株及其構(gòu)建方法、蛋白表達(dá)純化方法和蛋白應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組菌株及其構(gòu)建方法、蛋白表達(dá)純化方法和蛋白應(yīng)用。
背景技術(shù)：
金針 免疫調(diào)節(jié)蛋白(fungal immunomodulatory protein from flammulinavelutipes，F(xiàn)IP-fve)是從金針菇中分離獲得的非特異性免疫增強(qiáng)劑，對(duì)機(jī)體免疫具有雙向調(diào)節(jié)作用，具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌癥、抗過敏等活性，特別是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞因子含量和維持平衡的角度起到預(yù)防和治療過敏癥的目的，具有副作用小、標(biāo)本兼治的優(yōu)勢(shì)。作為不含糖基的小分子單純蛋白質(zhì)，金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白方便操作與應(yīng)用，是非常有前景的可應(yīng)用于臨床的藥用蛋白，因此將其開發(fā)成抗過敏產(chǎn)品造福人類很有必要。但由于金針菇生產(chǎn)周期長(zhǎng)，天然FIP-fve含量極微，產(chǎn)率不足90mg/kg，且分離成本極高，所以通過其他生物反應(yīng)器生產(chǎn)該蛋白是其走上應(yīng)用的有效途徑。目前國(guó)內(nèi)外幾家研究機(jī)構(gòu)也對(duì)其進(jìn)行了原核和真核表達(dá)，但是普遍存在原核表達(dá)率低、多數(shù)形成不溶性的包涵體或可溶性蛋白所占比例較小，不能形成正確的二級(jí)結(jié)構(gòu)或以不溶性的包涵體形式存在，需要變性復(fù)性處理影響生物活性，不適合開發(fā)應(yīng)用。真核表達(dá)雖然有較高的表達(dá)率和能形成糖基化結(jié)構(gòu)，但是發(fā)酵工藝復(fù)雜、成本高、細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白時(shí)采用甲醇等有害試劑、操作繁瑣，而且表達(dá)蛋白糖基化程度過高，與天然蛋白不符，結(jié)構(gòu)不確定，產(chǎn)物不純，有多種不同的形式，活性難以穩(wěn)定，另外因沒有純化標(biāo)簽，純化工藝復(fù)雜，成本過高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白工程菌株表達(dá)率低，表達(dá)產(chǎn)物多為不溶性的包涵體，結(jié)構(gòu)不確定以及菌體破碎率低、純化工藝復(fù)雜不適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的一個(gè)或多個(gè)問題，而提供一種能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株及其構(gòu)建方法、蛋白表達(dá)純化方法和蛋白應(yīng)用。本發(fā)明的能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株包含有插入了編碼金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET30a ( + )，使得獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化到Transetta (DE3)大腸桿菌中時(shí)能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白。本發(fā)明的能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株的構(gòu)建方法，是按照以下步驟進(jìn)行的一、采用試劑盒提取金針菇總RNA ；二、以步驟一提取的金針菇總RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR，獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA ；三、將步驟二得到的編碼金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA插入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET30a ( + )中，得到重組載體pET30a ( + ) -FIP-fve連接產(chǎn)物；四、將步驟三獲得的重組載體pET30a( + )-FIP_fve連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Transetta (DE3)大腸桿菌中，獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株。本發(fā)明的獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的方法，是按照以下步驟進(jìn)行的將獲得的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因工程菌株，將上述工程菌株培養(yǎng)到OD6tltl為O. 8 I. 0，然后加入IPTG誘導(dǎo)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，最后分離和純化表達(dá)的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白；其中，所述的IPTG終濃度為O. Γ0. 5mM或O. 5 ImM。本發(fā)明所獲得的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白在制備用于預(yù)防或治療過敏癥的藥物中的用途。本發(fā)明包含以下有益效果與在其它大腸桿菌中表達(dá)的可溶性產(chǎn)物少(產(chǎn)量為5mg/L，KO JL etal.，1997)或大多為不溶性的包涵體，需要進(jìn)行變性復(fù)性過程(“孔祥輝等，2007”)相比，本發(fā)明的重組菌株選定為具有氯霉素抗性基因、含有6種稀有真核基因密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對(duì)應(yīng)的 tRNA 的高表達(dá)基因工程菌株 Transetta (DE3)。本發(fā)明的可溶性重組蛋白表達(dá)率為菌體總蛋白的40%以上，比以往的表達(dá)率僅為22%左右(張介馳等，2007)提高80%以上，產(chǎn)量為45mg/L以上，比2009年徐貴雪等用pET_28構(gòu)建的表達(dá)載體生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)量(30mg/L)提高了 50%以上。本發(fā)明使用溶菌酶(作用濃度O. lmg/mL)結(jié)合超聲波法(作用時(shí)間20min)使菌體破碎率達(dá)到98%以上，比單用溶菌酶(作用濃度O. lmg/mL，破碎率28%)和單用超聲波法(作用時(shí)間20min，破碎率40%)提高30%以上，并節(jié)約了成本；經(jīng)圓二色譜測(cè)定表達(dá)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，含15%的α-螺旋和38%的β折疊，比例接近天然蛋白，這是本發(fā)明的蛋白具有更好生物活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，更具有開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。并且，由于FIP-fve天然情況下是不含糖基，因此不需要糖基化修飾，通過原核表達(dá)可以得到與天然蛋白活性相當(dāng)?shù)闹亟M蛋白。因?yàn)榇竽c桿菌發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，具有抗生素抗性，發(fā)酵過程污染率極低。菌體離心后細(xì)胞破碎方法簡(jiǎn)便高效，不影響蛋白活性。純化工藝中，由于重組蛋白設(shè)計(jì)了 6個(gè)組氨酸純化標(biāo)簽，使得純化過程簡(jiǎn)單而快速。整個(gè)重組蛋白的生產(chǎn)過程只需要3 4天，適合用大型液體發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明為其作為抗過敏藥物及免疫調(diào)節(jié)藥物或保健食品的應(yīng)用提供了大規(guī)模生產(chǎn)與純化技術(shù)的具體工藝。本發(fā)明構(gòu)建了該蛋白的原核表達(dá)載體，并且轉(zhuǎn)入了含有多種真核基因密碼子的基因工程菌株中，所表達(dá)的重組蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折疊所構(gòu)成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，重組蛋白結(jié)構(gòu)更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)證明重組蛋白具有較高生物活性；另外通過設(shè)計(jì)附加序列作為純化標(biāo)簽，簡(jiǎn)化了分離純化環(huán)節(jié)，更適于規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)；為新型重組蛋白作為抗過敏藥物及保健品的臨床研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。


圖I為重組pET30a(+)-FIP-fve表達(dá)載體酶切后的電泳圖；I為重組pET30a(+)-FIP-fve表達(dá)載體酶切后得到的pET30a(+)和目的片段圖(箭頭所指為目的片段)；2 為重組 pET30a(+)-FIP-fve 表達(dá)載體；M 為 DNA Marker DL2000 ；M I 為 DNA Markerλ -HINDUI ；圖2為能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析圖(20%SDS-PAGE);其中，I 為 Marker 蛋白質(zhì) Mr 標(biāo)樣 Protein Ruler I (Lot#E10408TransGenBiotect), 12kD(2. O μ g/5 μ L), 20kD(O. 5 μ g/5 μ L), 30kD(O. 5 μ g/5 μ L), 40kD(I O μ g/5 μ L)，60kD (O. 5 μ g/5 μ L)，80kD (O. 5 μ g/5 μ L) ；2 為重組 pET30a (+) -FIP-fve 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)菌株未誘導(dǎo)電泳圖；3為pET30a_FIP-fve轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)菌株的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)I. 5h后的電泳圖；4為pET30a-FIP-fve轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)菌株的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)3. Oh后的電泳圖；5為pET30a-FIP_fve轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)菌株的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)4. 5h后的電泳圖；圖3為不同濃度的IPTG在溫度為21°C的條件下誘導(dǎo)表達(dá)重組載體pET30a(+ ) -FIP-fve可溶性蛋白的蛋白電泳圖；其中，M為蛋白Marker Protein RulerI (Lot#E10408 TransGenBiotect), 12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(O. 5 μ g/5 μ L), 30kD(O. 5 μ g/5 μ L)，40kD (I. O μ g/5 μ L)，60kD (O. 5 μ g/5 μ L)，80kD (O. 5 μ g/5 μ L) ; I 為 O. 2mM 的 IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后的條帶；2為O. 5mM的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后的條帶；3為I. OmM的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后的條帶；圖4為不同濃度的IPTG在溫度為28°C的條件下誘導(dǎo)表達(dá)重組載體pET30a(+ )-FIP-fve 蛋白的蛋白電泳圖；其中，M 為蛋白 Marker Protein Ruler I (Lot#E10408TransGen Biotect)，12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(0. 5 μ g/5 μ L), 30kD(0. 5 μ g/5 μ L), 40kD (I. 0 μ g/5 μ L), 60kD (0. 5 μ g/5 μ L)，80kD (0. 5 μ g/5 μ L) ; I 為 0. 2mM 的 IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后的條帶，2為O. 5mM的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后的條帶，3為I. OmM的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后的條帶；圖5為不同濃度的IPTG在溫度為37°C的條件下誘導(dǎo)表達(dá)重組載體pET30a(+ )-FIP-fve 蛋白的蛋白電泳圖；其中，M 為蛋白 Marker Protein Ruler I (Lot#E10408TransGen Biotect)，12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(0. 5 μ g/5 μ L), 30kD(0. 5 μ g/5 μ L), 40kD (
I.0 μ g/5 μ L), 60kD (0. 5 μ g/5 μ L)，80kD (0. 5 μ g/5 μ L) ; I 為 0. 2mM 的 IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后的條帶，2為0. 5mM的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后的條帶，3為I. OmM的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后的條帶；圖6為重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)、菌體裂解方法比較及純化前后SDS-PAGE電泳結(jié)果圖；1為溶菌酶+超聲波裂解；2為未親合蛋白液；3為表達(dá)菌液；4為溶菌酶裂解；5為漂洗部分；6為前洗脫的目的蛋白；7為后洗脫的目的蛋白；MSProtein Marker ProteinRuler I(Lot#E10408 TransGen Biotect),12kD(2. 0 μ g/5 μ L), 20kD(0. 5 μ g/5 μ L), 30kD(0. 5 μ g/5 μ L)，40kD (I. 0 μ g/5 μ L)，60kD (0. 5 μ g/5 μ L)，80kD (0. 5 μ g/5 μ L)；圖7為重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)及柱層析純化前后SDS-PAGE電泳結(jié)果圖；其中，I為未未和蛋白；2為漂洗部分3為表達(dá)囷液裂解蛋白；4為洗脫目的蛋白；圖8為圓二色譜測(cè)定的重組蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖，其中，I為基線，2為計(jì)算值，3為測(cè)量值。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式的能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株包含有插入了編碼金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET30a( + )，使得獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化到Transetta (DE3)大腸桿菌中時(shí)能夠表達(dá)金針燕免疫調(diào)節(jié)蛋白。本實(shí)施方式包含以下有益效果與在其它大腸桿菌中表達(dá)的可溶性產(chǎn)物少(產(chǎn)量為5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多為不溶性的包涵體，需要進(jìn)行變性復(fù)性過程(“孔祥輝等，2007”)相比，本實(shí)施方式的重組菌株選定為具有氯霉素抗性基因、含有6種稀有真核基因密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對(duì)應(yīng)的 tRNA 的高表達(dá)基因工程菌株 Transetta (DE3)。并且，由于FIP-fve天然情況下是不含糖基，因此不需要糖基化修飾，通過原核表達(dá)可以得到與天然蛋白活性相當(dāng)?shù)闹亟M蛋白。因?yàn)榇竽c桿菌發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，具有抗生素抗性，發(fā)酵過程污染率極低。菌體離心后細(xì)胞破碎方法簡(jiǎn)便高效，不影響蛋白活性。純化工藝中，由于重組蛋白設(shè)計(jì)了 6個(gè)組氨酸純化標(biāo)簽，使得純化過程簡(jiǎn)單而快速。整個(gè)重組蛋白的生產(chǎn)過程只需要3 4天，適合用大型液體發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。本實(shí)施方式為其作為抗過敏藥物及免疫調(diào)節(jié)藥物或保健食品的應(yīng)用提供了大規(guī)模生產(chǎn)與純化技術(shù)的具體工藝。本實(shí)施方式構(gòu)建了該蛋白的原核表達(dá)載體，并且轉(zhuǎn)入了含有多種真核基因密碼子的基因工程菌株中，所表達(dá)的重組蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折疊所構(gòu)成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，重組蛋白結(jié)構(gòu)更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)證明重組蛋白具有較高生物活性；另外通過設(shè)計(jì)附加序列作為純化標(biāo)簽，簡(jiǎn)化了分離純化環(huán)節(jié)，更適于規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)；為新型重組蛋白作為抗過敏藥物及保健品的臨床研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式的能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株的構(gòu)建方法，是按照以下步驟進(jìn)行的一、采用試劑盒提取金針菇總RNA ；二、以步驟一提取的金針菇總RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR，獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA ；三、將步驟二得到的編碼金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA插入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET30a ( + )中，得到重組載體pET30a ( + ) -FIP-fve連接產(chǎn)物；四、將步驟三獲得的重組載體pET30a( + )-FIP_fve連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Transetta (DE3)大腸桿菌中，獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株。本實(shí)施方式包含以下有益效果與在其它大腸桿菌中表達(dá)的可溶性產(chǎn)物少(產(chǎn)量為5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多為不溶性的包涵體，需要進(jìn)行變性復(fù)性過程(“孔祥輝等，2007”)相比，本實(shí)施方式的重組菌株選定為具有氯霉素抗性基因、含有6種稀有真核基因密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對(duì)應(yīng)的 tRNA 的高表達(dá)基因工程菌株 Transetta (DE3)。并且，由于FIP-fve天然情況下是不含糖基，因此不需要糖基化修飾，通過原核表達(dá)可以得到與天然蛋白活性相當(dāng)?shù)闹亟M蛋白。因?yàn)榇竽c桿菌發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，具有抗生素抗性，發(fā)酵過程污染率極低。菌體離心后細(xì)胞破碎方法簡(jiǎn)便高效，不影響蛋白活性。純化工藝中，由于重組蛋白設(shè)計(jì)了 6個(gè)組氨酸純化標(biāo)簽，使得純化過程簡(jiǎn)單而快速。整個(gè)重組蛋白的生產(chǎn)過程只需要3 4天，適合用大型液體發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。本實(shí)施方式為其作為抗過敏藥物及免疫調(diào)節(jié)藥物或保健食品的應(yīng)用提供了大規(guī)模生產(chǎn)與純化技術(shù)的具體工藝。本實(shí)施方式構(gòu)建了該蛋白的原核表達(dá)載體，并且轉(zhuǎn)入了含有多種真核基因密碼子的基因工程菌株中，所表達(dá)的重組蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折疊所構(gòu)成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，重組蛋白結(jié)構(gòu)更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)證明重組蛋白具有較高生物活性；另外通過設(shè)計(jì)附加序列作為純化標(biāo)簽，簡(jiǎn)化了分離純化環(huán)節(jié)，更適于規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)；為新型重組蛋白作為抗過敏藥物及保健品的臨床研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二不同的是步驟三中所述的編碼金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA插入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET30a ( + )中操作步驟為將步驟一獲得的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼cDNA以及表達(dá)載體pET30a(+)采用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，酶切后純化回收金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼cDNA與表達(dá)載體pET30a(+)，然后采用連接酶進(jìn)行連接，得到重組載體pET30a ( + )-FIP-fve連接產(chǎn)物。其它與具體實(shí)施方式
二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的方法，是按照以下步驟進(jìn)行的按照具體實(shí)施方式
二的方法獲得的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因工程菌株，將上述工程菌株培養(yǎng)到0D_為O. 8 I. 0，然后加入IPTG誘導(dǎo)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，最后分離和純化表達(dá)的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白；其中，所述的IPTG 終濃度為 O. Γ0. 5mM 或 O. 5 ImM。本實(shí)施方式包含以下有益效果與在其它大腸桿菌中表達(dá)的可溶性產(chǎn)物少(產(chǎn)量為5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多為不溶性的包涵體，需要進(jìn)行變性復(fù)性過程(“孔祥輝等，2007”)相比，本實(shí)施方式的重組菌株選定為具有氯霉素抗性基因、含有6種稀有真核基因密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對(duì)應(yīng)的 tRNA 的高表達(dá)基因工程菌株 Transetta (DE3)。本實(shí)施方式的可溶性重組蛋白表達(dá)率為菌體總蛋白的40%以上，比以往的表達(dá)率僅為22%左右(張介馳等，2007)提高80%以上，產(chǎn)量為45mg/L以上，比2009年徐貴雪等用pET-28+構(gòu)建的表達(dá)載體生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)量(30mg/L)提高了 50%以上。本發(fā)明使用溶菌酶(作用濃度O. lmg/mL)結(jié)合超聲波法(作用時(shí)間20min)使菌體破碎率達(dá)到98%以上，比單用溶菌酶(作用濃度O. lmg/mL，破碎率28%)和單用超聲波法(作用時(shí)間20min，破碎率40%)提高30%以上，并節(jié)約了成本；經(jīng)圓二色譜測(cè)定表達(dá)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，含15%的α -螺旋和38%的β折疊，比例接近天然蛋白，這是本實(shí)施方式的蛋白具有更好生物活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，更具有開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。并且，由于FIP-fve天然情況下是不含糖基，因此不需要糖基化修飾，通過原核表達(dá)可以得到與天然蛋白活性相當(dāng)?shù)闹亟M蛋白。因?yàn)榇竽c桿菌發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，具有抗生素抗性，發(fā)酵過程污染率極低。菌體離心后細(xì)胞破碎方法簡(jiǎn)便高效，不影響蛋白活性。純化工藝中，由于重組蛋白設(shè)計(jì)了 6個(gè)組氨酸純化標(biāo)簽，使得純化過程簡(jiǎn)單而快速。整個(gè)重組蛋白的生產(chǎn)過程只需要3 4天，適合用大型液體發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。本實(shí)施方式為其作為抗過敏藥物及免疫調(diào)節(jié)藥物或保健食品的應(yīng)用提供了大規(guī)模生產(chǎn)與純化技術(shù)的具體工藝。本實(shí)施方式構(gòu)建了該蛋白的原核表達(dá)載體，并且轉(zhuǎn)入了含有多種真核基因密碼子的基因工程菌株中，所表達(dá)的重組蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折疊所構(gòu)成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，重組蛋白結(jié)構(gòu)更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)證明重組蛋白具有較高生物活性；另外通過設(shè)計(jì)附加序列作為純化標(biāo)簽，簡(jiǎn)化了分離純化環(huán)節(jié)，更適于規(guī)CN 102925403 A
書
明
說
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?；l(fā)酵生產(chǎn)；為新型重組蛋白作為抗過敏藥物及保健品的臨床研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四不同的是所述的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白序列如序列表Seq ID No:2所不。其它與具體實(shí)施方式
四相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四或五不同的是所述的分離和純化表達(dá)的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的操作步驟包括一、取按照具體實(shí)施方式
二的方法獲得的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因工程菌株，按體積比為1:1(Γ200的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為O. OflmM的IPTG，然后在溫度為8°C 37°C，轉(zhuǎn)速為8(T280rpm/min的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12 48h ；二、取步驟一誘導(dǎo)培養(yǎng)后的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因工程菌株菌液，在轉(zhuǎn)速為100(Tl5000rpm/min的條件下，離心O. 5 lOmin，收集沉淀，然后將收集的沉淀重懸于10^200倍重量的PBS緩沖液中，得菌懸液；三、向步驟二得到的菌懸液中加入終濃度為O. riOmg/mL的溶菌酶，在溫度為30 37°C條件下孵育5 30min，得菌液；四、將步驟三中得到的菌液置于冰浴中，在超聲功率為20W 200W，間隔時(shí)間f 30s的條件下，超聲處理l 50min ；五、將步驟四超聲處理的菌液在溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為500(Tl5000rpm/min的條件下，離心I 30min,收集上清液采用Ni-His Band柱層析,然后采用Sephadex G25凝膠層析柱方法進(jìn)行脫鹽，用O. 02M、pH為7. 8的PBS進(jìn)行洗脫，即獲得純化的表達(dá)蛋白溶液，完成分離和純化表達(dá)的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白。其它與具體實(shí)施方式
四或五相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四至六之一不同的是步驟二中所述的PBS緩沖液pH為8. O。其它與具體實(shí)施方式
四至六之一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四至七之一不同的是步驟五中所述的采用Ni-His · Band柱層析，所用的Wash緩沖液為含有濃度為50mM咪唑基的Wash緩沖液、所用的洗脫緩沖液成分為500mM的咪唑、O. 5M的NaCl，20mM的Tris-HCl ;其中，洗脫緩沖液PH為7. 9。其它與具體實(shí)施方式
四至七之一相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式所獲得的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白在制備用于預(yù)防或治療過敏癥的藥物中的用途。本實(shí)施方式包含以下有益效果與在其它大腸桿菌中表達(dá)的可溶性產(chǎn)物少(產(chǎn)量為5mg/L，KO JL et al.，1997)或大多為不溶性的包涵體，需要進(jìn)行變性復(fù)性過程(“孔祥輝等，2007”)相比，本實(shí)施方式的重組菌株選定為具有氯霉素抗性基因、含有6種稀有真核基因密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA)對(duì)應(yīng)的 tRNA 的高表達(dá)基因工程菌株 Transetta (DE3)。并且，由于FIP-fve天然情況下是不含糖基，因此不需要糖基化修飾，通過原核表達(dá)可以得到與天然蛋白活性相當(dāng)?shù)闹亟M蛋白。因?yàn)榇竽c桿菌發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，具有抗生素抗性，發(fā)酵過程污染率極低。菌體離心后細(xì)胞破碎方法簡(jiǎn)便高效，不影響蛋白活性。純化工藝中，由于重組蛋白設(shè)計(jì)了 6個(gè)組氨酸純化標(biāo)簽，使得純化過程簡(jiǎn)單而快速。整個(gè)重組蛋白的生產(chǎn)過程只需要3 4天，適合用大型液體發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。本實(shí)施方式為其作為抗過敏藥物及免疫調(diào)節(jié)藥物或保健食品的應(yīng)用提供了大規(guī)模生產(chǎn)與純化技術(shù)的具體工藝。
9
本實(shí)施方式構(gòu)建了該蛋白的原核表達(dá)載體，并且轉(zhuǎn)入了含有多種真核基因密碼子的基因工程菌株中，所表達(dá)的重組蛋白具有天然蛋白的α-螺旋和β折疊所構(gòu)成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，重組蛋白結(jié)構(gòu)更接近于天然蛋白，而且特性比天然蛋白更加穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)證明重組蛋白具有較高生物活性；另外通過設(shè)計(jì)附加序列作為純化標(biāo)簽，簡(jiǎn)化了分離純化環(huán)節(jié)，更適于規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)；為新型重組蛋白作為抗過敏藥物及保健品的臨床研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
十本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
九不同的是制備用于預(yù)防或治療過敏癥的藥物的方法，包括將具體實(shí)施方式
四得到的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白與可藥用載體混合，即制得用于預(yù)防或治療過敏癥的凍干粉針?biāo)幬铮黄渲?，可藥用載體為甘露醇或右旋糖酐，添加量為39Γ6%。其它與具體實(shí)施方式
九相同。通過以下試驗(yàn)驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果試驗(yàn)I本試驗(yàn)的能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株的構(gòu)建及其蛋白表達(dá)純化一、能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的提取采用TaKaRa公司的RNAisoforPolysaccharide-rich Plant Tissue試劑盒提取白B品種(由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所提供)的金針菇總RNA ；二、能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的PCR擴(kuò)增以步驟一提取的金針菇總RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(購(gòu)買自TaKaRa公司)進(jìn)行RT-PCR，得擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后采用Agarose Gel DNA Purification Kit(購(gòu)買自TaKaRa公司)進(jìn)行純化回收，獲得了金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因；將金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因進(jìn)行測(cè)序，序列提交GenBank獲得序列號(hào)為⑶388420. I，該序列與報(bào)道的FIP-fve基因的序列同源
100%(K0 JL et al.，1997)，重組蛋白His-FIP-fve的開放讀碼框?yàn)?10bp(如序列表SeqID No 1所示)，其編碼170個(gè)氨基酸(如序列表Seq ID No 2所示)，分子量為18780kDa ；三、重組表達(dá)載體pET30a ( + ) -FIP-fve的構(gòu)建a、表達(dá)載體pET30a ( + )的DNA提取取I. 5mL活化培養(yǎng)表達(dá)載體pET30a ( + )的菌液，離心收集菌體，懸浮于O. 35mL的STET裂解液中，加入25 μ L新配制的溶菌酶，振蕩混合3s，將反應(yīng)管置于沸水浴40s，立即取出然后離心lOmin，用牙簽從管中取出沉淀，向上清液中加入40 μ L濃度為2. 5mol/L的醋酸鈉溶液和420 μ L的異丙醇，快速混合后，在_70°C溫度下靜置15min后，取出置于4°C，以12000r/min轉(zhuǎn)速離心lOmin，棄上清液，收集沉淀加入ImL質(zhì)量百分含量為70%的乙醇，然后在4°C溫度下，以12000r/min轉(zhuǎn)速離心2min，收集沉淀進(jìn)行干燥，將干燥后的沉淀溶于50 μ L的TE中，貯存于-20°C，待用；b > BamH I 和 EcoR I 雙酶切將步驟二得到的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因，以及步驟a得到的表達(dá)載體pET30a(+)分別進(jìn)行BamH I和EcoR I雙酶切；其中，金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因酶切反應(yīng)條件先加入BamH I在30°C溫度下，酶切I. Oh后，再加入EcoR I在37°C溫度下，酶切I. 0h，然后將酶切的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因在65°C水浴進(jìn)行酶滅活lOmin，然后采用飽和酚試劑抽提，取上層液體，加入3倍體積預(yù)冷的(T4°C無水乙醇，在4°C溫度下放置Ih后，在轉(zhuǎn)速為12000r/min的條件下離心15min，收集沉淀，沉淀用質(zhì)量百分含量為75%預(yù)冷乙醇洗滌一次，然后離心，再用滅無菌水溶解，得到酶切后的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因，將其連接到同樣酶切并純化的pET30a( + )質(zhì)粒(購(gòu)買自 Amersham Pharmacia Biotech 公司)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET30a ( + )-FIP-fve。其中，pET30a ( + )質(zhì)粒的酶切純化反應(yīng)為將表達(dá)載體pET30a(+)先加入BamH I在30°C溫度下，酶切I. Oh后，再加入EcoR I在37°C，酶切I. Oh，向反應(yīng)液中加入3倍體積的DB Buffer (購(gòu)買自TaKaRa公司)均勻混合,轉(zhuǎn)移至Spin Column (購(gòu)買自TaKaRa公司)中，在轉(zhuǎn)速為12000r/min的條件下，離心lmin，收集濾液，然后加入Spin Column中重復(fù)離心I次，棄濾液，收集沉淀；分別用500 μ L的Rinse A (購(gòu)買自TaKaRa公司)和700 μ L的RinseB(購(gòu)買自TaKaRa公司)清洗,然后在轉(zhuǎn)速為12000r/min的條件下離心30s,棄濾液，收集沉淀；在3 111 Column膜的中央處加入25 μ L溫度為60°C的滅菌蒸餾水，室溫靜置lmin，然后在轉(zhuǎn)速為12000r/min的條件下離心lmin，洗脫酶切后的pET30a ( + )質(zhì)粒。C、連接將步驟b酶切后的pET30a ( + )質(zhì)粒和金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因，按目的片段載體=5:1摩爾比混合，在T4DNA連接酶的作用下，在16°C連接反應(yīng)24h，得到重組載體pET30a(+ )-FIP-fve連接產(chǎn)物；四、金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因工程重組菌株的構(gòu)建通過熱激轉(zhuǎn)化法將pET30a_FIP-fve 轉(zhuǎn)入 Transetta (DE3)大腸桿菌(購(gòu)買自 TransGen Biotech 公司，商品編號(hào)⑶801)中，取0. OOflmL的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物涂于含50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37°C溫箱中培養(yǎng)過夜，同時(shí)取另外兩管不含重組子的培養(yǎng)物分別涂于含50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板和不含卡那霉素的LB瓊脂平板上作對(duì)照，次日觀察各平板中菌落的生長(zhǎng)情況，若對(duì)照平板中含50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板未長(zhǎng)菌落，不含卡那霉素的LB瓊脂平板上長(zhǎng)有菌落，則取涂轉(zhuǎn)化菌的含50 μ g/mL卡那霉素的LB瓊脂平板長(zhǎng)出的單菌落接種于5mL的LB培養(yǎng)基中，置于37°C空氣浴搖床振蕩培養(yǎng)過夜，即得金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因工程重組菌株；五、陽性重組子的篩選、鑒定及表達(dá)鑒定d、重組載體 pET30a ( + ) -FIP-fve 的 PCR 鑒定取IyL步驟四得到的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因工程重組菌株，用滅菌去離子水稀釋500 1000倍后，取I μ L做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株，其特征在于能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株包含有插入了編碼金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET30a( + )，使得獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒在轉(zhuǎn)化到Transetta (DE3)大腸桿菌中時(shí)能夠表達(dá)金針燕免疫調(diào)節(jié)蛋白。
2.構(gòu)建如權(quán)利要求I所述的能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株的方法，其特征在于所述的能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株的構(gòu)建方法是按照以下步驟進(jìn)行的一、采用試劑盒提取金針菇總RNA；二、以步驟一提取的金針菇總RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR，獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA ；三、將步驟二得到的編碼金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA插入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET30a(+ )中，得到重組載體pET30a ( + ) -FIP-fve連接產(chǎn)物；四、將步驟三獲得的重組載體pET30a( + ) -FIP-fve連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Transetta (DE3)大腸桿菌中，獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟三中所述的編碼金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA插入大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET30a ( + )中操作步驟為將步驟一獲得的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼cDNA以及表達(dá)載體pET30a(+)采用BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，酶切后純化回收金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼cDNA與表達(dá)載體pET30a(+)，然后采用連接酶進(jìn)行連接，得到重組載體pET30a( + )-FIP_fVe連接產(chǎn)物。
4.獲得如權(quán)利要求I所述的能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株的方法是按照以下步驟進(jìn)行的按照權(quán)利要求2的方法獲得的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因工程菌株，將上述工程菌株培養(yǎng)到OD6tltl為O. 8 I. 0，然后加入IPTG誘導(dǎo)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，最后分離和純化表達(dá)的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白；其中，所述的IPTG終濃度為O. Γ0. 5mM或O.5 ImM。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于所述的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白序列如序列表Seq ID No :2所/Jn ο
6.根據(jù)權(quán)利要求4獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于所述的分離和純化表達(dá)的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的操作步驟包括一、取按照權(quán)利要求2的方法獲得的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因工程菌株，按體積比為1:10^200的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為O. OflmM的IPTG，然后在溫度為80C 37°C，轉(zhuǎn)速為8(T280rpm/min的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12 48h ；二、取步驟一誘導(dǎo)培養(yǎng)后的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因工程菌株菌液，在轉(zhuǎn)速為100(Tl5000rpm/min的條件下，離心O. 5 lOmin，收集沉淀，然后將收集的沉淀重懸于10^200倍重量的PBS緩沖液中，得菌懸液；三、向步驟二得到的菌懸液中加入終濃度為O.riOmg/mL的溶菌酶，在溫度為3(T37°C條件下孵育5 30min，得菌液；2四、將步驟三中得到的菌液置于冰浴中，在超聲功率為20W 200W，間隔時(shí)間l 30s的條件下，超聲處理l 50min ；五、將步驟四超聲處理的菌液在溫度為4°C，轉(zhuǎn)速為500(Tl5000rpm/min的條件下，離心I 30min,收集上清液采用Ni-His · Band柱層析,然后采用Sephadex G25凝膠層析柱方法進(jìn)行脫鹽，用O. 02M、pH為7. 8的PBS進(jìn)行洗脫，即獲得純化的表達(dá)蛋白溶液，完成分離和純化表達(dá)的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于步驟二中所述的PBS緩沖液pH為8. O。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于步驟五中所述的采用Ni-His Band柱層析,所用的Wash緩沖液為含有濃度為50mM咪唑基的Wash緩沖液、所用的洗脫緩沖液成分為500mM的咪唑、O. 5M的NaCl, 20mM的Tris-HCl ;其中，洗脫緩沖液pH為7. 9。
9.如權(quán)利要求4所述的獲得能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的方法，其特征在于所獲得的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白在制備用于預(yù)防或治療過敏癥的藥物中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的獲得的能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白在制備用于預(yù)防或治療過敏癥的藥物中的用途，其特征在于制備用于預(yù)防或治療過敏癥的藥物的方法，包括將權(quán)利要求4得到的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白與可藥用載體混合，即制得用于預(yù)防或治療過敏癥的凍干粉針?biāo)幬铮黄渲?，可藥用載體為甘露醇或右旋糖酐，添加量為3%飛％。
全文摘要
一種能夠表達(dá)金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的重組菌株及其構(gòu)建方法、蛋白表達(dá)純化方法和蛋白應(yīng)用，它涉及一種重組菌株的構(gòu)建、表達(dá)純化及其應(yīng)用。本發(fā)明要解決現(xiàn)有金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白工程菌株表達(dá)率低，表達(dá)產(chǎn)物多為不溶性的包涵體，結(jié)構(gòu)不確定以及菌體破碎、純化工藝復(fù)雜不適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的問題。本發(fā)明將金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因，以Transetta(DE3)作為宿主菌，構(gòu)建重組菌株；再用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過溶菌酶法結(jié)合超聲法處理后采用Ni-His·Band柱層析，Sephadex G25凝膠層析柱方法脫鹽，即完成重組菌株的構(gòu)建及表達(dá)純化。其用于制備預(yù)防或治療過敏癥的藥物。其純化過程簡(jiǎn)單而快速，適于規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102925403SQ201210475139
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者孔祥輝, 張介馳, 張丕奇, 戴肖東, 韓增華, 馬慶芳, 劉佳寧, 黨阿麗 申請(qǐng)人:黑龍江省科學(xué)院微生物研究所