專利名稱：一種用于檢測對蝦五種病毒的引物、液相芯片及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及檢測芯片領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測對蝦病毒的引物、液相芯片及其用途。
背景技術(shù)：
隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，特別是在集約化養(yǎng)殖的情況下，養(yǎng)殖水體、環(huán)境的惡化，養(yǎng)殖密度的增大，水體富營養(yǎng)化和飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)?，再加上對蝦屬無脊椎動物，缺乏特異性免疫系統(tǒng)等，導(dǎo)致近年來養(yǎng)殖病害的擴(kuò)大和蔓延，甚至發(fā)展到愈演愈烈的趨勢。對蝦病毒尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，對蝦病毒病不僅無特效藥可治，而且造成大規(guī)模毀滅性的死亡。更令人擔(dān)憂的是各種病害防治還只是停留在化學(xué)治療水平，為防止繼發(fā)和混合感染，藥物濫用已造成病原菌廣泛耐藥，同時(shí)水產(chǎn)品的藥物殘留已成社會關(guān)注的問題，甚至導(dǎo)致對蝦出口受阻，影響國際名聲，危害消費(fèi)者的健康，嚴(yán)重妨礙對蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。為此，建立快速、靈敏、特異的對蝦病毒診斷技術(shù)不僅能快速確診病因，及時(shí)檢測病害發(fā)生及發(fā)展趨勢，而且也是今后加強(qiáng)科學(xué)養(yǎng)殖管理，建立進(jìn)出口對蝦種苗及其產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫體系，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化養(yǎng)殖所必需的。對蝦病害檢測技術(shù)的研究在國內(nèi)起步相對較晚，但近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，有力推動了對蝦病原檢測的發(fā)展。國內(nèi)在對蝦病毒的檢測方面分別建立了幾種主要病原的免疫學(xué)技術(shù)、核酸探針及PCR檢測技術(shù)的研究。但由于國內(nèi)養(yǎng)殖狀況主要是個體、分散和粗放等形式，對致病病原體的種苗檢測、早期監(jiān)控、定期檢測等病害檢測體系基本上沒有建立，往往是發(fā)病后才引起關(guān)注，這與國外大型養(yǎng)殖公司相比，還存在著相當(dāng)大的差距?；蛐酒欠肿由飳W(xué)和微細(xì)加工技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，目前基因芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因圖繪制、表達(dá)譜分析、多態(tài)性研究、序列測定，同時(shí)也在疾病研究和病毒感染診斷等方面得到了廣泛的應(yīng)用。鑒于我國對蝦病毒病發(fā)生流行時(shí)往往是幾種病毒病混合、交叉或繼發(fā)感染，僅憑疾病的流行特征、發(fā)病癥狀及組織學(xué)病理等方法是很難對其進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷，更何況有些表面健康的蝦，由于受到水質(zhì)環(huán)境、餌料和病毒本身特性的影響都或多或少的攜帶有一種或幾種病毒。目前人們最常采用的PCR技術(shù)以其高靈敏度雖然為病毒感染的診斷提供了一種有力的工具，但同時(shí)非特異性產(chǎn)物的增多也容易導(dǎo)致臨床診斷錯誤，故必須將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，否則檢查結(jié)果不可信。特別是需要大批量的同時(shí)檢測幾種病毒病時(shí)，采用單一 PCR方法逐一檢測時(shí)，則比較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力和費(fèi)錢，難于推廣。白斑綜合癥病毒(WSSV)、桃拉綜合征病毒(TSV)、黃頭病病毒(YHV)、傳染性皮下及造血組織壞死病病毒(IHHNV)和傳染性肌肉壞死病病毒(IMNV)是感染對蝦最重要的病毒之一。因此，目前急需一種成本低，方法簡單，準(zhǔn)確率高的檢測五種病毒的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡便快捷、準(zhǔn)確率高、特異性好、靈敏度高，高通量的檢測對蝦病毒的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供檢測對蝦一至五種病毒液相芯片檢測引物。其上游引物具有R1-R2-R3所表示的序列，，其中Rl與液相芯片的微球連接序列反向互補(bǔ)，R3與待檢測序列互補(bǔ)，R2為多聚dT，或寡聚四聚乙二醇，或(CH2)n間臂，η > 3 ;優(yōu)選R2為(CH2) η間臂，η為12或18 ;更優(yōu)選R2為(CH2) η間臂，η為18 ;下游引物標(biāo)記生物
素。 其引物序列為以下至少一對檢測WSSV的引物上游引物中Rl為SEQ ID NO: I,R3為SEQ ID Ν0:2，下游引物為SEQ ID Ν0:3，并5’端標(biāo)記生物素；檢測TSV的引物上游引物中Rl為SEQ ID N0:4，R3為SEQ ID N0:5，下游引物為SEQ ID N0:6，并5’端標(biāo)記生物素；檢測YHV的引物上游引物中Rl為SEQ ID N0:7, R3為SEQ ID N0:8，下游引物為SEQID N0:9，并5，端標(biāo)記生物素；檢測IHHNV的引物上游引物中Rl為SEQ ID NO: 10, R3為SEQ ID N0:11，下游引物為SEQ ID NO: 12，并5’端標(biāo)記生物素；檢測頂NV的引物上游引物中Rl為SEQ IDN0:13，R3為SEQ ID NO: 14，下游引物為SEQ ID NO: 15，并5’端標(biāo)記生物素。本發(fā)明還涉及一種用于檢測對蝦一至五種病毒的液相芯片，其特征是，包括I)所述引物；2)偶聯(lián)一定核苷酸序列的微球，所述序列選自SEQ ID NO: 16_20，并能相應(yīng)的與I)中引物序列互補(bǔ)配對。本發(fā)明還涉及一種用于檢測對蝦一至五種病毒的試劑盒，含有權(quán)利要求2的引物和權(quán)利要求3的液相芯片。本發(fā)明還保護(hù)所述引物，所述液相芯片，所述試劑盒用于檢測對蝦一至五種病毒的用途。本發(fā)明還保護(hù)所述引物，所述液相芯片，所述試劑盒用于檢測對蝦一至五種病毒的方法，其步驟為樣品DNA或RNA提取；PCR 擴(kuò)增；與微球雜交；儀器分析。所述樣品DNA或RNA提取中，需要對DNA和RNA進(jìn)行260nm和280nm的紫外光吸收率的測定，0D260值在O. 05 I的區(qū)間內(nèi)，且0D260/0D280比值在I. 5 2. O之間。所述PCR擴(kuò)增中，采用權(quán)利要求I所述的引物進(jìn)行擴(kuò)增；PCR的擴(kuò)增體系如下2XTaqManFast Universal PCR Master Mix 25 μ L ;上下游引物分別濃度為 O. 3 μ mol/L I. O μ mol/L ;從對奸中提取病毒RNA并合成的cDNA模板5 μ L或病毒DNA5 μ L ;補(bǔ)水至50 μ L ;反應(yīng)條件為95°C變性IOmin ；95°C 45s，60°C退火45s，72°C延伸45s，循環(huán)40次；72 0C 3min。所述與微球雜交為，取I μ L權(quán)利要求2的微球，加入22. 5 μ L的I. I X雜交緩沖液，混勻；加入2. 5μ LPCR產(chǎn)物，95°C變性2min，然后42°C孵育30min ;加入100 μ L的用IX雜交緩沖液稀釋 100 倍的 streptavidin-R-phycoerythrin, 37°C孵育 20min 所述 1.1X 的雜交緩沖液為 O. 11 MTri s -HC I ,0. 22 MN a C I 和 O. 088% TritonX-100 ;所述 IX 雜交緩沖液為 O. IMTri s-HC 1,0. 2 M N a C I 和 O. 08% T r it ο η X — IOO0所述儀器分析為在LumineXTM200儀器上讀取熒光中位數(shù)MF I值，根據(jù)讀數(shù)進(jìn)行結(jié)果判定；具體的，所述結(jié)果判定為當(dāng)樣品的MFI值與空白樣品的MFI值的比值> 3時(shí)結(jié)果判為陽性，如果其比值< 2時(shí)判為陰性，如果2 <比值< 3時(shí)結(jié)果判為可疑。本發(fā)明選擇GENBANK中WSSV的囊膜蛋白基因28、TSV的衣殼蛋白基因VP2、YHV衣殼蛋白基因GPl 16、IHHNV的衣殼蛋白基因和MNV的衣殼蛋白基因。根據(jù)上述五種對蝦病毒的基因進(jìn)行序列同源性比較，根據(jù)其保守區(qū)域，通過primer 5. O軟件設(shè)計(jì)，并經(jīng)過大量的反應(yīng)條件優(yōu)選，對比試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)才獲得的用于鑒別診斷的特異性引物。所形成的引物組合包含的引物堿基數(shù)為18 24個，引物的熔解溫度Tm值為58°C 65°C，引物GC%為40% 60%。同時(shí)進(jìn)行篩選，保留不能形成引物二聚體的引物，所獲得的這對引物其擴(kuò)增的目標(biāo)片段長度為IOObp 150bp。合成或標(biāo)記的引物均可采用HPLC純化。本發(fā)明上游引物的5’端合成一段Luminex 生產(chǎn)的MagPlex-Tag微球上序列成反 向互補(bǔ)核酸序列，再加上十八個碳原子的間臂或間隔臂(spaCerl8)，5’端依據(jù)所檢測病毒基因序列設(shè)計(jì)；常見的間臂序列包括多聚dT，即poly (dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n間臂，η大于等于3，如(CH2)12, (CH2)18等。本發(fā)明間臂優(yōu)選(CH2)12 — (CH2)18，特別優(yōu)選(CH2)18，用spacerlS來表示。本發(fā)明下游引物的5’端標(biāo)記生物素。本發(fā)明的試劑盒應(yīng)還可以包括cDNA合成反應(yīng)液；RTPCR擴(kuò)增反應(yīng)液、對蝦五種病毒的基因質(zhì)粒DNA對照樣品、稀釋液和雜交液。本發(fā)明的目的在于克服國內(nèi)外現(xiàn)有鑒別診斷技術(shù)的缺陷，建立對蝦五種病毒病的液相基因芯片鑒別診斷方法，并提供這種檢測試劑的制備方法和技術(shù)應(yīng)用。使其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高通量、快速和操作方便等特點(diǎn)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)特異性引物并篩選和優(yōu)化這些引物。優(yōu)化了 PCR反應(yīng)條件及其擴(kuò)增產(chǎn)物與特異性的熒光編碼MagPlex-Tag微球的雜交條件，并提出了符合要求的樣品病毒DNA和RNA。采用Luminex 200儀器直接進(jìn)行結(jié)果讀取和判定，對得出的結(jié)果進(jìn)行分析同時(shí)建立嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的檢測方法。最后進(jìn)行方法驗(yàn)證，將其應(yīng)用于對蝦五種病毒病的快速檢疫和研究工作中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為I、對蝦五種病毒病的液相基因芯片鑒別診斷方法與現(xiàn)有的國內(nèi)外應(yīng)用的PCR等鑒別方法相比較，本方法只進(jìn)行一次試驗(yàn)就能同時(shí)快速檢測對蝦WSSV、TSV、YHV、IHHNV和IMNV,也可根據(jù)實(shí)際情況對這五種疾病進(jìn)行自由增減，不互相干擾。該方法操作簡便，耗時(shí)短，成本低，特異性強(qiáng)，重復(fù)性和穩(wěn)定性高，靈敏度高，為上述五種疾病的快速檢測提供了一個新的技術(shù)平臺。2、本方法的檢測試劑盒可對對蝦WSSV、TSV、YHV、IHHNV和IMNV進(jìn)行快速檢測，樣品適用范圍廣，試劑中均無感染性的和生物安全隱患的成分，使用安全。3、本發(fā)明的方法在PCR擴(kuò)增后，不需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，可直接與微球雜交，節(jié)省了步驟和時(shí)間，簡化了工藝。


圖I為應(yīng)用五對引物的PCR擴(kuò)增圖。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施方式
結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。I. IX 的雜交緩沖液0. 11 MT r i s -HC I ,0. 22 MN a C I 和 O. 088% Tr i t ο η X — 100 ；IX 雜交緩沖液0. IMTr i s-HC 1,0. 2 M N a C I 和 O. 08% T r i tο η X — IOOo實(shí)施例I、液相芯片制備一、設(shè)計(jì)并合成引物根據(jù)GENNANK 中 WSSV 的囊膜蛋白基因 28 (DQ979320. IGI: 115520913)、TSV的衣殼蛋白基因VP2 (NC_003005. IGI: 14780876)、YHV衣殼蛋白基因GP116(EF156405. IGI: 120564524)、IHHNV 的衣殼蛋白基因(AJ884914. IGI: 60219180)和 MNV 的衣殼蛋白基因(NC_007915. 1GI:90403545)。根據(jù)上述五種對蝦病毒的基因進(jìn)行序列同源性比較，根據(jù)其保守區(qū)域，通過primer 5. O軟件設(shè)計(jì)得到如下引物。下游引物的5’端標(biāo)記生物素。以下spacerl8 均表示(CH2) 18 間臂。WSSV 引物引物F 5’-TAACTTACACTTAACTATCATCTT-spacer 18- CTGTGACCAAGACCATCCiAAA -3'
(單下劃線表示Rl，為微球連接序列的反向互補(bǔ)核酸序列(SEQ ID NO: I);雙下劃線表示R3，為根據(jù)各病毒具體蛋白基因序列設(shè)計(jì)的序列(SEQ ID N0:2)。以下同)；引物R 5，-Biot in-TCGCTGTCAAAGGACACATCA-3’ (SEQ ID NO:3)(2) TSV 引物弓I物 F 5’-ACTACTTATTCTCAAACTCTAATA-spacerl8- 'TCATAACGACAGTTGGACATCT-3’ ;(單下劃線表示R1，序列為SEQ ID N0:4，雙下劃線表示R3，序列為SEQ ID N0:5)引物R 5，-Biotin-CGATTTACGTACAATGTCATCA — 3’ ; (SEQ ID N0:6)⑶YHV 引物引物F 5，-CACTACACATTTATCATAACAAAT-spacerl8-TTCTACTACACAATCCCTTCCG-3，;(單下劃線表示R1，序列為SEQ ID N0:7，雙下劃線表示R3，序列為SEQ ID N0:8)引物R5’-Biot in-TGGCTTGTGTACGTTTTGATTC-3’ ; (SEQ ID NO:9)(4) IHHNV 引物弓丨物F 5，-TTCTTCATTAACTTCTAATCTTAC-spacerl8-CGAACCGGTGACAGAAAAGC-3，；(單下劃線表示R1，序列為SEQ ID NO: 10，雙下劃線表示R3，序列為SEQ ID NO: 11)引物R5’-Biot in-CAAGGGATGGTTTGTCCCATTT-3’ ; (SEQ ID NO:12)(5)MNV 引物引物F 5，-ACTTACAATAACTACTAATACTCT-spacerl8-TGAACAATGCGGTGGATTAGC-3，;(單下劃線表示R1，序列為SEQ ID NO: 13，雙下劃線表示R3，序列為SEQ ID NO: 14)引物R5’-Biotin-ATGGCCATTCTGCAAACATTA-3’ ; (SEQ ID NO:15)上述引物送上海生工生物工程有限公司合成，引物均經(jīng)過HPLC純化，按各自的摩爾數(shù)計(jì)算，用雙蒸水溶解成ΙΟμΜ貯存液備用。采用上述五種病毒的五對引物以合成的病毒cDNA或純化的病毒DNA為模板分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)2%的瓊脂凝膠電泳，其結(jié)果見圖1，其中泳道M為Promega公司生產(chǎn)的Cat. #G753IDNAMarker ;泳道I 5分別為WSSV、TSV,YHV、IHHNV和IMNV樣本；6為陰性對照。從圖I可以看出，各對引物均能擴(kuò)增出清晰的目的性條帶，目的性條帶大小均為約100 — 150bp。二、熒光編碼 MagPlex-Tag 微球根據(jù)對蟲下五種病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的序列與Luminex 公司現(xiàn)有MagPlex-Tag微球編碼及其所偶聯(lián)的核苷酸序列進(jìn)行比對，挑選如下五種編碼MagPlex-Tag微球27、33、42、52和57。見表I :表I五種對蝦病毒病所使用的微球編碼及其所偶聯(lián)的核苷酸序列
權(quán)利要求
1.一種液相芯片檢測引物，其上游引物具有R1-R2-R3所表示的序列，，其中Rl與液相芯片的微球連接序列反向互補(bǔ)，R3與待檢測序列互補(bǔ)，R2為多聚dT，或寡聚四聚乙二醇，或(CH2) n間臂，n ^ 3 ;優(yōu)選R2為(CH2) η間臂，η為12或18 ;更優(yōu)選R2為(CH2) η間臂，η為18 ;下游引物標(biāo)記生物素。
2.權(quán)利要求I所述的液相芯片檢測引物，用于檢測對蝦一至五種病毒，其引物序列為以下至少一對檢測WSSV的引物上游引物中Rl為SEQ ID N0:1，R3為SEQ ID NO: 2，下游引物為SEQ ID N0:3，并5’端標(biāo)記生物素；檢測TSV的引物上游引物中Rl為SEQ ID NO:4,R3為SEQ ID N0:5，下游引物為SEQ ID NO:6，并5’端標(biāo)記生物素；檢測YHV的引物上游引物中Rl為SEQ ID N0:7，R3為SEQ ID NO:8，下游引物為SEQ ID N0:9，并5’端標(biāo)記生物素；檢測IHHNV的引物上游引物中Rl為SEQ ID NO: 10, R3為SEQ ID NO: 11，下游引物為SEQ ID NO: 12，并5’端標(biāo)記生物素;檢測IMNV的引物上游引物中Rl為SEQ ID NO:13,R3為SEQ ID NO: 14，下游引物為SEQ ID NO: 15，并5’端標(biāo)記生物素。
3.一種用于檢測對蝦一至五種病毒的液相芯片，其特征是，包括 1)權(quán)利要求2的引物； 2)偶聯(lián)一定核苷酸序列的微球，所述序列選自SEQID NO: 16-20，并能相應(yīng)的與I)中引物序列互補(bǔ)配對。
4.一種用于檢測對奸一至五種病毒的試劑盒，含有權(quán)利要求2的引物和權(quán)利要求3的液相芯片。
5.權(quán)利要求2的引物，權(quán)利要求3的液相芯片，權(quán)利要求4的試劑盒用于檢測對蝦一至五種病毒的用途。
6.權(quán)利要求2的引物，權(quán)利要求3的液相芯片，權(quán)利要求4的試劑盒用于檢測對蝦一至五種病毒的方法，其步驟為 樣品DNA或RNA提??； PCR擴(kuò)增； 與微球雜交； 儀器分析。
7.權(quán)利要求6的方法，其步驟為所述樣品DNA或RNA提取中，需要對DNA和RNA進(jìn)行260nm和280nm的紫外光吸收率的測定，0D260值在O. 05 I的區(qū)間內(nèi)，且0D260/0D280比值在I. 5 2. O之間。
8.權(quán)利要求6的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增中，采用權(quán)利要求I所述的引物進(jìn)行擴(kuò)增；PCR 的擴(kuò)增體系如下2 X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 25 μ L ;上下游引物分別濃度為O. 3 μ mo I/L I. O μ mol/L ;從對蝦中提取病毒RNA并合成的cDNA模板5 μ L或病毒DNA5 μ L ;補(bǔ)水至50 μ L ;反應(yīng)條件為95°C變性IOmin ；95°C 45s，60°C退火45s，72°C延伸 45s，循環(huán) 40 次；72°C 3min。
9.權(quán)利要求6的方法,其特征在于所述與微球雜交為，取Iμ L權(quán)利要求2的微球,力口入22. 5μ L的I. IX雜交緩沖液，混勻；加入2. 5 μ LPCR產(chǎn)物，95 °C變性2min，然后42°C孵育 30min ;加入 100 μ L 的用 I X 雜交緩沖液稀釋 100 倍的 streptavidin-R-phycoerythrin,37°C 孵育 20min 所述 I. IX 的雜交緩沖液為 O. 11 M Tri S-HCl ,0. 22 MN a CI和 O. 088% T r i t ο n X - 100 ;所述 I X 雜交緩沖液為 O. IMTr i s -HC I ,0.
10.權(quán)利要求4的方法，其特征在于，所述儀器分析為在LumineXTM200儀器上讀取熒光中位數(shù)MF I值，根據(jù)讀數(shù)進(jìn)行結(jié)果判定；具體的，所述結(jié)果判定為當(dāng)樣品的MFI值與空白樣品的MFI值的比值> 3時(shí)結(jié)果判為陽性，如果其比值< 2時(shí)判為陰性，如果2彡比值< 3時(shí)結(jié)果判為可疑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測對蝦病毒的引物和液相芯片及其用途。其中上游引物具有R1-R2-R3所表示的序列，R1與液相芯片的微球連接序列反向互補(bǔ)，R3與待檢測序列互補(bǔ)，R2為間臂，優(yōu)選(CH2)18間臂；下游引物標(biāo)記生物素。具體涉及用于檢測對蝦一至五種病毒(WSSV、TSV、YHV、IHHNV和/或IMNV)的至少一對液相芯片引物，還涉及包含所述引物序列的液相芯片、試劑盒，及其用途和檢測方法。采用本發(fā)明方法，只進(jìn)行一次試驗(yàn)就能同時(shí)快速檢測對蝦一至多種病毒，不互相干擾。操作簡便，耗時(shí)短，成本低，特異性強(qiáng)，重復(fù)性和穩(wěn)定性高，靈敏度高，樣品適用范圍廣，試劑中均無感染性的和生物安全隱患的成分，使用安全。
文檔編號C12Q1/68GK102912041SQ20121043998
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者謝明星, 彭小莉, 劉棠, 王群力, 陳偉玲, 王偉, 陳雙雅, 劉葒, 鄭曉聰, 王景明 申請人:廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心