一種產耐表面活性劑脂肪酶的菌株及耐表面活性劑脂肪酶的制備方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產耐表面活性劑脂肪酶的菌株WBRD1.11121501及利用所述菌株的耐表面活性劑脂肪酶的制備方法。利用本發(fā)明所提供菌株和制備方法制備所得的脂肪酶在陰離子表面活性劑SDS、非離子表面活性劑AEO-9、Triton?X-100以及陽離子表面活性劑CTAB中具有極強的穩(wěn)定性，并且其中大部分的表面活性劑對該酶的反應活性起到增強作用。另外，氧化劑雙氧水對本發(fā)明所提供的金黃桿菌脂肪酶的反應活性也起到一定的增強作用。【專利說明】一種產耐表面活性劑脂肪酶的菌株及耐表面活性劑脂肪酶的制備方法【
技術領域：
】[0001]本發(fā)明涉及產脂肪酶的菌株及脂肪酶的制備方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種產耐表面活性劑脂肪酶的菌株及利用所述菌株的耐表面活性劑脂肪酶的制備方法。【
背景技術：
】[0002]脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一類特殊的酯鍵水解酶，廣泛存在于動植物和微生物體中。脂肪酶可以催化酯類化合物的水解、醇解、酯化、酯交換以及化合物的合成等反應，其可應用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑、紡織、生物柴油、造紙、皮革、化妝品和環(huán)境保護等多個工業(yè)令頁域(HasanF,AliSA,HameedA.1ndustrialapplicationsofmicrobiallipases.EnzymeMicrob.Technol.2006,39:235-251.)。[0003]脂肪酶同其它工業(yè)酶制劑品種一樣，在不同的應用領域內其性質要求多種多樣。[0004]因為各個工業(yè)環(huán)節(jié)對脂肪酶的具體性質要求多種多樣，因而需要尋找和開發(fā)不同性質的脂肪酶產品。微生物具有培養(yǎng)簡單、周期短、產量大等特點，因而工業(yè)用途的酶制劑基本上都來源于微生物。目前已知大約有2%的微生物產脂肪酶，至少包括65個屬，其中細菌28個屬、放線菌4個屬、酵母菌10個屬、其它真菌23個屬(汪小鋒，王俊，楊江科等.微生物發(fā)酵生產脂肪酶的研究進展.生物技術通報.2008，(4):47-53.)。[0005]微生物來源的脂肪酶已經有許多進行了商品化開發(fā)，如應用于洗滌劑的脂肪酶Lumafast?、Lipomax?皆來自于假單胞菌屬微生物，Lipo丨ase?來源于嗜熱真菌屬的嗜熱棉毛菌(ThermomycesIanuginosus)。應用于食品工業(yè)的Palatase?來自于米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)，LipaseA“Amano”6來自于黑曲霉(Aspergillusniger)。應用于有機合成工業(yè)的LipaseAY“Amano”30來自于糟皺假絲酵母(Candidarugosa)，LipaseAK來自于焚光假單胞菌(PseudomonasfIuorescens)等(SinghA.K.，MukhopadhyayM.0verviewofFungalLipase:AReview.App1.BiochemBiotechnol.2012，166:486520.；GuptaR.，GuptaN..RathiP.Bacteriallipases:anoverviewofproduction，purificationandbiochemicalproperties.App1.Microbiol.Biotechno1.2004，64:763-781.)。[0006]盡管某些脂肪酶已經成功商品化開發(fā)，但是因其在某些性質上的內在不足而限制了其的應用。譬如來源于嗜熱真菌屬的嗜熱棉毛菌(ThermomycesIanuginosus)的脂肪酶存在對陰離子和部分非離子表面活性劑抗性差的問題，而這兩種表面活性劑是洗滌劑的主要成分，因而導致嗜熱棉毛菌脂肪酶在洗滌劑上的應用受到一定的限制(CherifS.,MnifS.,HadrichF.，etal.Anewlyhighalkalinelipase:anidealchoiceforapplicationindetergentformulations.LipidsinHealthandDisease.2011.10:221-228.；RathiP.，SaxenaR.K.，GuptaR.AnovelalkalinelipasefromBurkholderiacepaciafordetergentformulation.ProcessBiochemistry.2001,37:187-192.；0mar1.C.,HayashiM.，NagaiS.PurifiacationandsomepropertiesofathermostablelipasefromHumicolalanuginoseN0.3.Agr1.Biolog.Chem.1987,51(I):37-45.)。[0007]洗滌劑領域是脂肪酶工業(yè)應用的一個十分重要的領域，通常的洗滌劑配方中都含有大量的陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑，有時也會添加一定量的陽離子表面活性劑和氧化劑等。因此洗滌劑領域應用的脂肪酶，最好能夠具有優(yōu)良的表面活性劑穩(wěn)定性且反應活性不受這些表面活性劑的影響。當前成功開發(fā)用于洗滌劑領域的脂肪酶除了嗜熱棉毛菌(ThermomycesIanuginosus)脂肪酶外，還有來源于產堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)的脂肪酶(商品名為Lipomax?)以及來源于門多薩假單胞菌(Pseudomonasmendocina)的脂肪酶(商品名為LuniilfilSt?)等(JaegerK.E.,RansacS.,DijkstraB.ff.,etal.Bacteriallipases.FEMSMicrob.Rew.1994,15:29-63.)。但是有報道稱產堿假單胞菌和門多薩假單胞菌這兩種來源的脂肪酶的抗表面活性劑性能也并不十分理想(LinS.F.,ChiouC.M.,YehC.M.,etal.PurificationandpartialcharacterizationofanalkalinelipasefromPseudomonaspseudoalcaligenesF-11.App1.Environ.Microbiol.1996,62(3):1093-1095.；DahiyaP.,AroraP.，ChaudhuryA.,etal.CharacterizationofanextracellularalkalinelipasefromPseudomonasmendocinaM-37.J.BasicMicrob.2010,50(5):420-426.)。[0008]其它假單胞菌微生物來源的脂肪酶中，也鮮有能夠滿足洗滌劑要求的能同時在陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑中具有高活性和高穩(wěn)定性的脂肪酶。[0009]除了假單胞菌來源的脂肪酶外,芽孢桿菌(Bacillus)、不動桿菌(Acinetobacter)等細菌的脂肪酶及肉色曲霉(Aspergilluscarneus)、擴展青霉(Penicilliumexpansum)等真菌的脂肪酶也幾乎沒有能夠同時具有陰離子和非離子表面活性劑的抗性(SinchaikulS.,SookkheoB.,PhutrakulS.,etal.0ptimizationofaThermostableLipasefromBacillusstearothermophilusPl:Overexpression,Purification,andCharacterization.ProteinExpressionandPurification.2001,22,388-398.；Park1.H,KimS.H.,LeeY.S.,etal.GeneCloning,Purification,andCharacterizationofaCoId-AdaptedLipaseProducedbyAcinetobacterbaumanniiBD5.J.Microbiol.Biotechnol.2009，19(2),128-135.;中國專利CN101210235;鄭毅，施巧琴，吳松剛.堿性脂肪酶與表面活性劑相互作用的研究.工業(yè)微生物.2000，30(2):4-7.)。[0010]綜上所述，雖然已有報道某些脂肪酶在含有如十二烷基硫酸鈉(SDS)等表面活性劑的體系中不受抑制，但是鮮有報道同時在多種陰離子和非離子表面活性劑的體系中不被抑制的脂肪酶，更少有報道能夠同時滿足在多種表面活性劑體系中高度穩(wěn)定且反應活性不被這些表面活性劑所抑制的脂肪酶。在另一方面，已有報道多種陰陽離子表面活性劑或非離子表面活性劑能夠抑制或增強多種微生物來源的脂肪酶的活性，但是鮮有報道脂肪酶活性能夠同時被陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑所增強的野生脂肪酶。[0011]本發(fā)明提供了一種金黃桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)WBRD1.11121501(CGMCC6261)菌株，利用該菌株能夠生產出一種能不被SDS等陰離子和吐溫80等非離子表面活性劑所抑制，且能在SDS、CTAB等多種表面活性劑體系中穩(wěn)定的脂肪酶。更有利的是，在多種表面活性劑如SDS、TritonX-100和AE09或者雙氧水中，該脂肪酶活性還可以被顯著增強。該脂肪酶無疑將在工業(yè)應用中特別是洗滌劑工業(yè)中具有重大的應用價值。[0012]另外，目前幾乎沒有金黃桿菌屬細菌產出脂肪酶的報道，也沒有任何表面活性劑影響金黃桿菌脂肪酶的酶學性質金黃桿菌脂肪酶在表面活性劑影響方面的性質報道，更沒有任何金黃桿菌來源的具有表面活性劑耐受性的脂肪酶制備方法方面的報道。因此本發(fā)明首次公開了一種具有能生產同時耐受陰離子和非離子表面活性劑脂肪酶的金黃桿菌并首次公開了該種耐表面活性劑脂肪酶的制備方法?！?br/>發(fā)明內容】[0013]本發(fā)明主要涉及一種產脂肪酶的金黃桿菌屬菌株WBRD1.11121501，該菌株填補了現(xiàn)有技術中尚無金黃桿菌屬菌株生產脂肪酶的空缺。利用本發(fā)明所提供菌株和制備方法制備所得的脂肪酶在陰離子表面活性劑SDS、非離子表面活性劑AE0-9、TritonX-100以及陽離子表面活性劑CTAB中具有極強的穩(wěn)定性，并且其中大部分的表面活性劑對該酶的反應活性起到增強作用。另外，氧化劑雙氧水對本發(fā)明所提供的金黃桿菌脂肪酶的反應活性也起到一定的增強作用。因此，本發(fā)明所提供的金黃桿菌菌株及其所產脂肪酶無疑將在洗滌劑工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)境保護以及有機合成等領域具有十分重要的應用價值。[0014]本發(fā)明提供了一種金黃桿菌屬菌株，該菌株能夠生產同時耐多種表面活性劑的脂肪酶。同時本發(fā)明還提供了利用該菌株制備的耐表面活性劑的脂肪酶及該脂肪酶的生產方法。[0015]本發(fā)明提供一種能產耐表面活性劑脂肪酶的細菌，該菌是分離自中國上海地區(qū)的土壤中的金黃桿菌屬細菌，其編號為WBRD1.11121501，其于2012年6月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCCN0.6261。[0016]本發(fā)明還提供了一種制備脂肪酶的方法，包括以下步驟:在適合生產的情況下，于250C-40°C培養(yǎng)上述的脂肪酶產生菌，從而使該菌株產生脂肪酶；從培養(yǎng)基中分離出脂肪酶。[0017]所述的脂肪酶，為一種耐表面活性劑脂肪酶。陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)，非離子表面活性劑聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(吐溫80)、脂肪醇聚氧乙烯醚(AE0-9)和以及聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)等對該脂肪酶的反應沒有抑制效應，而且這些表面活性劑對該酶的穩(wěn)定性也沒有抑制作用。實際上，該脂肪酶在SDS、Tritonx-100和AE0-9等表面活性劑存在時活性還可以被顯著增強，在5-20g/L的CTAB中活性也顯著高于對照。[0018]另外0_20mM的氧化劑如雙氧水(H2O2)還可以顯著增強所述脂肪酶的反應活性，并且該酶在5mM的H2O2中具有很好的穩(wěn)定性。[0019]在一個實施方案中，上述制備脂肪酶的方法包括以下步驟:[0020](I)在適合生產脂肪酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明菌株(CGMCC6261)；[0021](2)收集步驟(1)所得的發(fā)酵液，過濾濃縮，獲得濃縮液；[0022](3)對步驟(2)所得的濃縮液進行鹽析，收集鹽析沉淀物；[0023](4)將步驟(3)所得的鹽析沉淀物溶解，進行層析純化；[0024](5)收集步驟⑷所得的層析洗脫物中的脂肪酶，即可得到本發(fā)明的脂肪酶。[0025]在一個優(yōu)選實施方案中，上述步驟(1)為:[0026]在25-40°C、120-250rpm下將本發(fā)明菌株(CGMCC6261)于適合生產脂肪酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-72小時。[0027]在一個優(yōu)選實施方案中，上述步驟(2)為:[0028]收集步驟(1)所得的發(fā)酵液，通過離心或微濾的方法除去菌體，再將濾液用超濾膜進行超濾濃縮，獲得濃縮液。[0029]在一個優(yōu)選實施方案中，上述步驟(3)為:[0030]對步驟(2)所得的濃縮液進行硫酸銨鹽析，收集20-70%飽和度的鹽析沉淀物。[0031]在一個優(yōu)選實施方案中，上述步驟(4)為:[0032]將步驟(3)所得的鹽析沉淀物用起始緩沖液溶解后，使用疏水層析柱進行層析純化，層析過程中先用洗脫緩沖液進行洗脫，再用蒸餾水洗脫，最后用10-70%v/v的乙醇水溶液進行洗脫。[0033]在一個優(yōu)選實施方案中，上述步驟(5)為:[0034]收集步驟(4)所得的層析洗脫物中的脂肪酶活性峰，并使用置換緩沖液將獲得的脂肪酶緩沖液體系置換為20-50mM、pH7.0-8.5的Tris.HCl緩沖液，從而得到本發(fā)明的脂肪酶。[0035]在一個更優(yōu)選的實施方案中，在上述步驟(2)中，收集發(fā)酵液后用濾紙進行過濾，收集的清液經過0.1-0.5μm的微孔濾膜過濾，再用5-30kDa的超濾膜進行超濾濃縮。[0036]在一個更優(yōu)選的實施方案中，上述步驟⑷中所述的起始緩沖液為含有0.1-2M(NH4)2S04的20_100mM濃度、pH6.0-8.5的Tris-HCl緩沖液；所述的洗脫緩沖液為20-100mM濃度、pH6.0-8.5的Tris-HCl緩沖液。[0037]在一個更優(yōu)選的實施方案中，上述步驟(5)中所述的置換緩沖液為20mM-100mM濃度的ρΗ6.0-8.5的Tris.HCl緩沖液。[0038]在一個優(yōu)選實施方案中，上述步驟(5)中所述的置換通過凝膠層析、透析或超濾的方式進行。[0039]在一個優(yōu)選實施方案中，上述制備脂肪酶方法中所用的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下:蔗糖0-5重量％、蛋白胨0.01-5重量％、酵母浸出粉0.01-5重量％、硫酸銨0-3重量％、KH2PO4O-1重量％、Na2HPO4.12H200.01-1重量％、吐溫800-3重量％、MgSO4.7Η200.01-0.5重量％、CaCl20.01-0.5重量％、橄欖油0-5重量％，ρΗ6.0-8.0，余量為水。[0040]本發(fā)明還提供本發(fā)明菌株(CGMCC6261)用于生產脂肪酶的用途。[0041]本發(fā)明還提供本發(fā)明菌株用于水解脂肪的用途。[0042]本發(fā)明還提供本發(fā)明菌株用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、環(huán)境保護、有機合成和日用化學品工業(yè)中需要脂肪酶的應用中的用途。[0043]在一些實施方案中，使用本發(fā)明菌株進行發(fā)酵生產后的發(fā)酵液用于上述用途。[0044]在一個實施方案中，上述發(fā)酵液為在適合生產脂肪酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述菌株獲得的發(fā)酵液。[0045]在一些實施方案中，上述用途用于存在表面活性劑和/或氧化劑的條件下。[0046]在一個實施方案中，上述表面活性劑為陰離子表面活性劑和/或非離子表面活性劑；優(yōu)選的陰離子表面活性劑為十二烷基硫酸鈉；優(yōu)選的非離子表面活性劑為TritonX-100和AE0-9;優(yōu)選的氧化劑為雙氧水。[0047]本發(fā)明還提供使用本發(fā)明菌株進行發(fā)酵生產后的發(fā)酵液。[0048]在一個實施方案中，上述發(fā)酵生產在適合生產脂肪酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行。[0049]本發(fā)明還提供使用本發(fā)明菌株生產的脂肪酶。[0050]在一個實施方案中，上述脂肪酶使用本發(fā)明所述的方法制備。[0051]本發(fā)明還提供上述發(fā)酵液或上述脂肪酶用于水解脂肪的用途。[0052]本發(fā)明還提供上述發(fā)酵液或上述脂肪酶用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、環(huán)境保護、有機合成和日用化學品工業(yè)中需要脂肪酶的應用中的用途。[0053]在一些實施方案中，上述用途用于存在表面活性劑和/或氧化劑的條件下。[0054]在一個實施方案中，上述表面活性劑為陰離子表面活性劑和/或非離子表面活性劑；優(yōu)選的陰離子表面活性劑為十二烷基硫酸鈉；優(yōu)選的非離子表面活性劑為TritonX-100和AE0-9;優(yōu)選的氧化劑為雙氧水。[0055]本發(fā)明還提供一種水解脂肪的方法，該方法使用本發(fā)明菌株或上述發(fā)酵液或上述脂肪酶來水解脂肪。[0056]在一個實施方案中，上述需要水解的脂肪處于存在表面活性劑和/或氧化劑的條件下；優(yōu)選的表面活性劑為陰離子表面活性劑和/或非離子表面活性劑；優(yōu)選的陰離子表面活性劑為十二烷基硫酸鈉；優(yōu)選的非離子表面活性劑為TritonX-100和AE0-9;優(yōu)選的氧化劑為雙氧水?！緦＠綀D】【附圖說明】[0057]圖1示出了WBRD1.11121501(CGMCC6261)在羅丹明B平板上的熒光圖片。[0058]圖2示出了本發(fā)明金黃桿菌脂肪酶在部分0.5%濃度的表面活性劑中的穩(wěn)定性。[0059]圖3示出了本發(fā)明金黃桿菌脂肪酶在部分1.0%濃度的表面活性劑中的穩(wěn)定性。[0060]圖4示出了部分表面活性劑對本發(fā)明金黃桿菌脂肪酶反應活性的影響。[0061]圖5示出了氧化劑H2O2對本發(fā)明金黃桿菌脂肪酶反應活性的影響。[0062]序列說明[0063]SEQIDNO:1是WBRD1.11121501(CGMCC6261)的16SrRNA序列。【具體實施方式】[0064]以下具體說明本發(fā)明的耐表面活性劑脂肪酶的制備方法。[0065]取新鮮培養(yǎng)的金黃桿菌WBRD1.11121501(CGMCC6261)斜面(LB培養(yǎng)基25_40°C培養(yǎng)24-72h)，接種至種子搖瓶中，25-40°C、120-250rpm培養(yǎng)6-24h。而后以1_10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，25-400C、120-250rpm搖床培養(yǎng)8_72h。將培養(yǎng)液離心或微濾除去菌體，清液采用5-30kDa的膜進行超濾濃縮。而后對濃縮液進行硫酸銨鹽析，收集20-70%飽和度的鹽析沉淀物。將所述沉淀物用起始緩沖液(含有0.1-2M硫酸銨的20mM-100mM的Tris-HCl，pH6.0-8.5)溶解后，加至疏水層析色譜柱進行疏水層析純化，層析過程中先用洗脫緩沖液(20mM-100mM的Tris-HCl，pH6.0-8.5)進行洗脫，再用蒸餾水洗脫，最后用10-70%(v/v)的乙醇水溶液進行洗脫。收集洗脫物中活性組分(脂肪酶)并用置換緩沖液置換后即制備得到本發(fā)明所述的脂肪酶。[0066]上述金黃桿菌的種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其組成為(單位g.L—1，余量為水):胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，ρΗ7.0。[0067]上述金黃桿菌產脂肪酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(單位g.Ι^，余量為水):蔗糖0-5、蛋白胨0.01-5、酵母浸出粉0.01-5、硫酸銨0-3、KH2PO4O-UNa2HPO4.12H200.01-1、吐溫800-3、MgSO4.7Η200.01-0.5、CaCl20.01-0.5、橄欖油0-5,ρΗ6.0-8.0；[0068]上述脂肪酶的疏水層析純化過程所采用的起始緩沖液為含有0.1-2Μ硫酸銨的20mM-100mM的Tris-HCl緩沖液，pH6.0-8.5;洗脫緩沖液與起始緩沖液相比差別僅在于不含有硫酸銨。[0069]上述置換緩沖液為20mM-100mM濃度的pH6.0-8.5的Tris.HCl緩沖液。[0070]上述層析過程在室溫下進行，層析可采用常規(guī)的疏水層析柱進行，其層析介質的疏水配基，例如可以選擇為醚、異丙基、苯基、丁基、辛基等。層析柱類型可以選擇為自制或一些商品化的產品。疏水層析柱可以是自行填充的也可以是購買一些商品化的預裝柱。[0071]上述置換可通過例如凝膠過濾層析、透析、超濾等的方式進行。置換后最終制備所得的金黃桿菌脂肪酶的溶液體系為20-50mM濃度、pH7.0-8.5的Tris.HCl緩沖液。[0072]本發(fā)明采用對硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)法來測定脂肪酶的活力大小，該方法以對硝基苯棕櫚酸酯為反應底物，通過脂肪酶的催化產生有色產物對硝基苯酚(P-NP)，該產物在405-410nm波長下具有強烈吸收。酶活力單位定義為:1個單位即指在標準實驗條件下每分鐘催化釋放IμmoI的p-NP所需的酶量。該方法的更詳細描述參見MahadikN.D.,PuntambekarU.S.,BastawdeK.B.,etal.ProductionofacidiclipasebyAspergillusnigerinsolidstatefermentation.ProcessBiochem.2002,38:715-721.。該方法是國內外測定脂肪酶活力的常用方法，操作簡便，反應快且靈敏度高，是一種精確而高效的活力測定方法。[0073]以下通過實施例舉例說明本發(fā)明的技術方案，所述實施例僅為更清楚地說明本發(fā)明的技術方案，而不應被理解為對本發(fā)明的限制。[0074]實施例1、菌株篩選及鑒定[0075]本發(fā)明所提供的菌株金黃桿菌WBRD1.11121501分離自中國上海地區(qū)的土壤中。將新采集的土壤樣品通過富集培養(yǎng)或稀釋涂布于羅丹明B平板上篩選得到一株可產胞外脂肪酶的細菌菌株。該菌株經過16SrRNA鑒定屬于金黃桿菌屬細菌，命名為金黃桿菌(Chryseobacteriumsp.)WBRD1.11121501。[0076]該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。該保藏單位的地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編是100101。該菌株的保藏日期是2012年6月21日，保藏號是CGMCCN0.6261，分類命名為:金黃桿菌Chryseobacteriumsp.。[0077]上述的脂肪酶的篩選方法為羅丹明B平板法，將待考察菌株或菌體懸浮液點種或稀釋涂布于羅丹明B平板上，按照菌株相適應的生長條件進行培養(yǎng)，本發(fā)明的菌株培養(yǎng)溫度在25-40°C。生長0.5-5天時在波長為365nm的紫外燈下觀察菌落是否具有橙色熒光(見圖1)，根據熒光的有無、強弱來判斷該菌產生脂肪酶的能力。[0078]該方法的篩選平板制備方法如下:[0079]將配方甲液(硫酸銨0.1-0.5wt%，酵母浸出汁0.l_2wt%，胰蛋白胨0.l-2wt%,K2HP040-lwt%,KClO-1wt%，七水合硫酸鎂0.01-0.5wt%，七水合硫酸亞鐵0-0.lwt%，&脂1.0-2.0wt%)于115°C滅菌30min后加入同樣方式滅菌的配方乙液(橄欖油與2_5%的聚乙烯醇以1:3比例混合，1000Orpm攪拌乳化)，充分混合后按照1%(v/v)的量加入過濾除菌的0.1%羅丹明B溶液。充分混勻后制備得到篩選平板。[0080]根據羅丹明B平板法篩選得到一株在365nm紫外燈下帶有顯著熒光的菌株即WBRD1.11121501菌株。[0081]經過對該菌的16SrRNA測序，其rRNA序列如SEQIDNO:1所示，進行比對后發(fā)現(xiàn)該序列與Chryseobacteriumindologenes(GENBANK號NR042507.1),Chryseobacteriumgleum(GENBANK號NR042506.1)及Chryseobacteriumureilyticum(GENBANK號NR042503.1)的16SrRNA序列的一致性很高，且都達到99%。[0082]該細菌WBRD1.11121501在LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨Iwt%，酵母提取物0.5wt%，氯化鈉lwt%，瓊脂l-2wt%)上生長呈圓形，粘性，表面光滑有凸起帶黃色光澤。該菌呈桿狀或橢圓狀，長度在1.0-3.0ym,寬度在0.5-1.0ym0該菌為革蘭氏陰性細菌，接觸酶陽性，能產蛋白酶，以上這些指標都符合金黃桿菌的特征(VandammeP.,BernardetJ.F.,SegersP.etal.NewPerspectivesintheClassificationoftheFlavobacteria!DescriptionofChryseobacteriumgen.nov.,Bergeyellagen.nov.,andEmpedobacternorn.rev.1nternationalJournalofSystematicBacteriology.1994,44(4):827-831.)。[0083]實施例2、耐表面活性劑脂肪酶的制備[0084]取一支新鮮培養(yǎng)的金黃桿菌WBRD1.11121501斜面(LB培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)48h，接一環(huán)至含有30ml種子培養(yǎng)基的種子搖瓶中，30°C、150rpm培養(yǎng)24h。而后以I%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，300C、150rpm搖床培養(yǎng)48h。培養(yǎng)液離心或微濾除去菌體，清液采用IOkDa的膜進行超濾濃縮。而后對濃縮液進行分段硫酸銨鹽析，收集20-70%飽和度的鹽析沉淀物。再用HitrapphenylHP色譜柱(GEHealthCare,貨號:17-5195-01)對該鹽析蛋白樣品進行疏水層析純化，先用起始緩沖液和洗脫緩沖液進行梯度洗脫，再用蒸餾水洗脫，最后用70%的乙醇水溶液進行洗脫。使用自動收集器(Frac-920，購自GEHealthcare)收集樣品，對洗脫過程的所有樣品進行酶活性大小的檢測，并將洗脫液中具有脂肪酶活性的組分合并收集，獲得活性組分。收集的活性組分(脂肪酶)經50mM的pH7.5的Tris-HCl緩沖液通過超濾置換后即制備得到本發(fā)明所述的脂肪酶。[0085]上述金黃桿菌的種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，其組成為(單位g.L-1):胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10，pH7.0。[0086]上述的金黃桿菌產脂肪酶的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(單位g.L-1,余量為水):蔗糖10、蛋白胨20、酵母浸出粉10、硫酸銨5、KH2P043、Na2HPO4.12H207、吐溫8010、MgSO4.7H202、CaCl22、橄欖油30，pH7.0。[0087]上述的起始緩沖液為含有1.0M硫酸銨的50mM的Tris-HCl緩沖液。與起始緩沖液相比洗脫緩沖液不含有硫酸銨。[0088]上述層析過程在室溫下進行，置換后最終制備所得的金黃桿菌脂肪酶的溶液體系為50mM濃度、ρΗ7.5的Tris.HCl緩沖液。[0089]實施例3、金黃桿菌WBRD1.11121501所產脂肪酶的部分酶學性質[0090]本發(fā)明所制備而得的脂肪酶具有如下性質，除特別說明外脂肪酶活力的檢測均采用PNPP法(參見“【具體實施方式】”部分)。[0091]對穩(wěn)定性的影響[0092]表面活性劑對金黃桿菌脂肪酶的穩(wěn)定性影響的檢測方法是取2ml的活力約為0.3單位/ml的待測酶液，向其中加入待檢測表面活性劑至表面活性劑濃度為0.5%或1.0%(v/v)，室溫下放置，分別于第20min、第45min和第70min取出部分樣品0.1ml樣品進行脂肪酶活力檢測，以不添加表面活性劑的樣品的檢測值作為對照，以相同時間對照酶活力為100%,計算實驗樣品的相對酶活力。[0093]表面活性劑對金黃桿菌脂肪酶的穩(wěn)定性影響結果見圖2和圖3。該脂肪酶在0.5%和1%的SDS、CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、吐溫80、TritonX-100、ΑΕ0-9中的穩(wěn)定性非常好，以不添加表面活性劑的樣品的檢測值為對照進行相對活力的計算，室溫孵育70min后的活力仍超過對照值。[0094]表面活性劑對金黃桿菌脂肪酶反應性能的影響結果見圖4。其具體檢測方法是首先配制含有1.3mg/mlρΝΡΡ,Ο.1%阿拉伯膠，0%-2.5wt%不同濃度的待考察表面活性劑的400ul體積的反應體系。該反應體系使用的緩沖系統(tǒng)為0.1MpH8.0的Tris_HCl。而后按照脂肪酶活力檢測的方法進行酶活力的檢測。檢測中脂肪酶的添加量為lOOul，以不添加表面活性劑的樣品的檢測值作為對照，并標記為100%，據此計算不同表面活性劑樣品的相對酶活力。[0095]發(fā)明所提供的脂肪酶的活性被0_20g/L的陰離子表面活性劑SDS、非離子表面活性劑TritonX-100和AE0-9所增強。本發(fā)明所提供的脂肪酶的活性可以被5_20g/L的陽離子表面活性劑CTAB所增強。[0096]氧化劑雙氧水在低于20mM濃度的范圍內均對本發(fā)明所提供的金黃桿菌脂肪酶具有活力增強作用，見圖5。另外，經過檢測本發(fā)明所提供的金黃桿菌脂肪酶在含有5mM雙氧水的體系中室溫孵育70min后的活力幾乎沒有任何變化?！緳嗬蟆?.一種金黃桿菌菌株，其保藏編號為CGMCCN0.6261。2.一種制備脂肪酶的方法，其特征在于，包括以下步驟:在適合生產脂肪酶的條件下培養(yǎng)權利要求1所述的菌株，使該菌株產生脂肪酶，從培養(yǎng)物中分離出脂肪酶。3.權利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)在適合生產脂肪酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求1所述的菌株；(2)收集步驟(1)所得的發(fā)酵液，過濾濃縮，獲得濃縮液；(3)對步驟(2)所得的濃縮液進行鹽析，收集鹽析沉淀物；(4)將步驟(3)所得的鹽析沉淀物溶解后，進行層析純化；(5)收集步驟(4)所得的層析洗脫物中的脂肪酶，即可得到本發(fā)明的脂肪酶。4.權利要求3所述的方法，其中步驟(1)為:在25-40°C、120-250rpm下將權利要求1所述的菌株于適合生產脂肪酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-72小時。5.權利要求3所述的方法，其中步驟(2)為:收集步驟(1)所得的發(fā)酵液，通過離心或微濾的方法除去菌體，再將濾液用超濾膜進行超濾濃縮，獲得濃縮液。6.權利要求3所述的方法，其中步驟(3)為:對步驟(2)所得的濃縮液進行硫酸銨鹽析，收集20-70%飽和度的鹽析沉淀物。7.權利要求3所述的方法，其中步驟(4)為:將步驟(3)所得的鹽析沉淀物用起始緩沖液溶解后，使用疏水層析柱進行層析純化，層析過程中先用洗脫緩沖液進行洗脫，再用蒸餾水洗脫，最后用10-70%v/v的乙醇水溶液進行洗脫。8.權利要求3所述的方法，其中步驟(5)為:收集步驟(4)所得的層析洗脫物中的脂肪酶活性峰，并使用置換緩沖液將獲得的脂肪酶緩沖液體系置換為20-50mM、pH7.0-8.5的Tris.HCl緩沖液，從而得到本發(fā)明的脂肪酶。9.權利要求5所述的方法，其中在步驟(2)中，收集發(fā)酵液后用濾紙進行過濾，收集的清液經過0.1-0.5μm的微孔濾膜過濾，再用5-30kDa的超濾膜進行超濾濃縮。10.權利要求7所述的方法，其中步驟(4)中所述的起始緩沖液為含有0.1-2M(NH4)2SO4的20-100mM濃度、pH6.0-8.5的Tris-HCl緩沖液；所述的洗脫緩沖液為20_100mM濃度、ρΗ6.0-8.5的Tris-HCl緩沖液。11.權利要求8所述的方法，其中步驟(5)中所述的置換緩沖液為20mM-100mM濃度的ρΗ6.0-8.5的Tris.HCl緩沖液。12.權利要求8所述的方法，其中步驟(5)中所述的置換通過凝膠層析、透析或超濾的方式進行。13.權利要求3-12任一項所述的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方如下:蔗糖0-5重量％、蛋白胨0.01-5重量％、酵母浸出粉0.01-5重量％、硫酸銨0-3重量％、KH2PO4O-1重量％、Na2HPO4.12H200.01-1重量％、吐溫800-3重量％、MgSO4.7Η200.01-0.5重量％、CaCl20.01-0.5重量％、橄欖油0-5重量％，ρΗ6.0-8.0，余量為水。14.權利要求1所述的菌株用于生產脂肪酶的用途。15.權利要求1所述的菌株用于水解脂肪的用途。16.權利要求1所述的菌株用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、環(huán)境保護、有機合成和日用化學品工業(yè)中需要脂肪酶的應用中的用途。17.權利要求15或16所述的用途，其特征在于，使用所述菌株進行發(fā)酵生產后的發(fā)酵液用于所述用途。18.權利要求17所述的用途，其特征在于，所述發(fā)酵液為在適合生產脂肪酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述菌株獲得的發(fā)酵液。19.權利要求15或16所述的用途，其特征在于，在存在表面活性劑和/或氧化劑的條件下使用所述發(fā)酵液。20.權利要求19所述的用途，其特征在于，所述表面活性劑為陰離子表面活性劑和/或非離子表面活性劑；優(yōu)選的陰離子表面活性劑為十二烷基硫酸鈉；優(yōu)選的非離子表面活性劑為TritonX-100和AE0-9;優(yōu)選的氧化劑為雙氧水。21.使用權利要求1所述的菌株進行發(fā)酵生產后的發(fā)酵液。22.權利要求21所述的發(fā)酵液，所述發(fā)酵生產在適合生產脂肪酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行。23.權利要求1所述的菌株生產的脂肪酶。24.權利要求23的脂肪酶，其特征在于，使用權利要求2-13任一項所述的方法制備。25.權利要求21所述的發(fā)酵液或權利要求23所述的脂肪酶用于水解脂肪的用途。26.權利要求21所述的發(fā)酵液或權利要求23所述的脂肪酶用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、環(huán)境保護、有機合成和日用化學品工業(yè)中需要脂肪酶的應用中的用途。27.權利要求25或26所述的用途，其特征在于，在存在表面活性劑和/或氧化劑的條件下使用所述脂肪酶。28.權利要求27所述的用途，其特征在于，所述表面活性劑為陰離子表面活性劑和/或非離子表面活性劑；優(yōu)選的陰離子表面活性劑為十二烷基硫酸鈉；優(yōu)選的非離子表面活性劑為TritonX-100和AE0-9;優(yōu)選的氧化劑為雙氧水。29.—種水解脂肪的方法，其特征在于，使用權利要求1所述的菌株或權利要求21所述的發(fā)酵液或權利要求23所述的脂肪酶水解脂肪。30.權利要求29所述的方法，其特征在于，所述脂肪處于存在表面活性劑和/或氧化劑的條件下；優(yōu)選的表面活性劑為陰離子表面活性劑和/或非離子表面活性劑；優(yōu)選的陰離子表面活性劑為十二烷基硫酸鈉；優(yōu)選的非離子表面活性劑為TritonX-100和AE0-9;優(yōu)選的氧化劑為雙氧水。【文檔編號】C12N1/20GK103805526SQ201210436966【公開日】2014年5月21日申請日期:2012年11月5日優(yōu)先權日:2012年11月5日【發(fā)明者】徐正軍,周美鳳,許駿,柴丹申請人:豐益(上海)生物技術研發(fā)中心有限公司