專利名稱：編碼糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個編碼糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶的基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)可用于降解纖維二糖。
背景技術(shù)：
β -葡萄糖苷酶(beta-glucosidase, EC3. 2. I. 21)屬于水解酶,廣泛存在于自然界許多植物體中，還存在于一些酵母、曲霉菌、木霉菌和細(xì)菌等微生物中。它能夠水解結(jié)合于末端、非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)配基(潘利華，羅建平.2006，β-葡萄糖苷酶的研究及應(yīng)用進(jìn)展.食品科學(xué).27 (12) :803-807.)。其作用底物如纖維二糖(cellobiose)、纖維三糖(cellotriose)、纖維四糖(cellotetrose)、水楊苷(salicin)和對硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)等。β-葡萄糖苷酶可作為風(fēng)味酶，對改良果汁風(fēng)味，果酒增香和茶葉增香均有顯著作用(李遠(yuǎn)華.2002, β -葡萄糖 苷酶的研究進(jìn)展.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.29(4) :421-425.)。除了食品風(fēng)味物質(zhì)的釋放作用，葡萄糖苷酶在纖維素降解中具有重要作用(Sestelo Α. B. F. , Poza Μ. ,VillaT. C. 2004, β-Glucosidase activity in a Lactobacillusplantarum wine strain. WorldJournal of Microbiology&Biotechnology，20:633 637.)。纖維素作為植物光合作用的主要多糖類產(chǎn)物，是地球上含量最豐富的碳水化合物，也是數(shù)量最大的一種可再生資源。據(jù)報道，全球每年通過光合作用產(chǎn)生的纖維素高達(dá)I. 55X 109t，其中 85% 尚未被人類利用(DUNLAP C，CHIANG G C. Utilization and recycleof agriculture wastes and residues. Shuler M L. Boca Raton, Florida. USA:CRC PressInc，1980. 19)。當(dāng)今，能源短缺是人類面臨的重大問題之一。而對于纖維素的利用是解決能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染的重要途徑。β -葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成兩分子葡萄糖，是纖維素酶復(fù)合酶系發(fā)揮協(xié)同作的關(guān)鍵酶，對纖維素酶系的整體水解活性有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，可以通過提高纖維素酶系中β_葡萄糖苷酶的活性來改善整個纖維素酶系的功用(Bhat K. Μ. , BhatS. 1997, Cellulose degrading enzymes and their potentialindustrial applications. Biotechnol. Adv. ,15:583 620.),因此對 β -葡萄糖苷酶的深入研究受到人們越來越多的關(guān)注。目前已有上百個微生物、植物及動物來源的葡萄糖苷酶基因得到克隆并被測序，其中許多微生物來源的β -葡萄糖苷酶基因已獲得異源表達(dá)(韓笑，陳介南，王義強(qiáng)，等，2008，β-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達(dá)研究進(jìn)展。生物技術(shù)通報，3:8 13.)。相比之下，植物來源的葡萄糖苷酶活性遠(yuǎn)比微生物來源的葡萄糖苷酶要低，因此，目前研究主要集中在微生物來源上(李遠(yuǎn)華.2002，β-葡萄糖苷酶的研究進(jìn)展.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.29(4) :421-425.)。而微生物中研究得較多的是酵母和絲狀真菌如木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)等霉菌以及細(xì)菌中的芽孢桿菌屬等(孟憲文，宋小紅，陳歷俊，等，2009，β-葡萄糖苷酶的研究進(jìn)展.乳品加工，10:42-44.)。但木霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中存在多種真菌毒素以及得到的纖維素酶活力較低，尤其是β_葡萄糖苷酶活力很低，致使纖維二糖在反應(yīng)體系中積累而影響酶解效率，因而其應(yīng)用范圍受到限制。在產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物中有很多種都不止編碼一種β-葡萄糖苷酶，該酶分子量變化較大，微生物中從18kD 480kD均有報道，酶學(xué)性質(zhì)也可相差很遠(yuǎn)(韓笑，陳介南，王義強(qiáng)，2008，β-葡萄糖苷酶基因的克隆與表達(dá)研究進(jìn)展。生物技術(shù)通報，3:8 13.)。除了在降解纖維素方面有著重要作用外，葡萄糖苷酶在其他領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用，特別是在醫(yī)藥、食品、生物轉(zhuǎn)化中具有重要的應(yīng)用價值(Mi chae I Ε. H.，MarkF.R. , Charles E. ,1999,Cellulase for commodity products from cellulosic biomass.Curr. Opin. Biotechnol.，10 (4) : 358 364.)。在醫(yī)學(xué)中，β -葡萄糖苷酶應(yīng)用在某些癌癥的診斷和治療中，并獲得了許多成功(邵金輝，韓金祥，等，2005，β-葡萄糖苷酶在工農(nóng)醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用.生命的化學(xué)，5 (01) 22-24.)。在水果、蔬菜、茶葉等食料和中草藥中，許多風(fēng)味前體物質(zhì)和藥理活性成分主要以糖苷形式存在，需要葡萄糖苷酶這種風(fēng)味酶將其釋放出揮發(fā)性糖苷配基，起到增香作用(金鳳燮，莊子瑜，魚紅閃，等，2009，特異的中草藥配糖體苷酶微生物及其發(fā)酵與酶學(xué)特性.生物工程學(xué)報，25(12) : 1863-1870.)。除此 之外，β -葡萄糖苷酶普遍還具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移活性，可用于低聚龍膽糖的生產(chǎn)(劉玲玲，朱松，朱婷，等，2009，重組β-葡萄糖苷酶生產(chǎn)龍膽低聚糖的工藝條件優(yōu)化.微生物學(xué)報，49 (5) :597-602.)、紅景天苷的酶法合成(王夢亮，李萬麗.2009，固定化β -葡萄糖苷酶催化合成紅景天甙的研究.生物技術(shù)，19(1) :68-70.)以及非離子表面活性劑烷基糖苷的合成(朱云，2007，葡萄糖酶法生物合成烷基糖苷工藝.浙江化工，38(11) :3-6.)。以葡萄糖苷酶為關(guān)鍵詞查找中國國家知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索數(shù)據(jù)庫，共出現(xiàn)143項發(fā)明專利。其中有23項發(fā)明專利是描述編碼β_葡萄糖苷酶的基因及其應(yīng)用，而其他120項是與β_葡萄糖苷酶在各種領(lǐng)域上的應(yīng)用有關(guān)。在這23項與編碼β-葡萄糖苷酶的基因及其應(yīng)用相關(guān)的發(fā)明專利中的β-葡萄糖苷酶基因有5個是來自未培養(yǎng)微生物的、其它18個是來自15種不同生物一一嗜熱脫氨芽孢桿菌NG80-2、里氏木霉、根瘤土壤桿菌HCCB20052、瓶霉ΧΗ8、Pyrococcusfuriosus、嗜熱菌ΜΒ4、黑曲霉、端氏木霉QM9414、黑曲霉WX-07、黑翅土白蟻、Clostridium sp.WGC702、曲霉菌株CICC2193、嗜熱擬青霉、Dictyoglomusthermophilum DSM3960和極端嗜堿菌；1個來自白藜蘆醇。本發(fā)明獲得的β -葡萄糖苷酶是來自自行篩選到的新鞘氨醇菌M-9 (Novosphingobium sp.M_9),與基因數(shù)據(jù)庫中公開的β_葡萄糖苷酶的氨基酸的同源性較低，是一個新的β_葡萄糖苷酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從廣西南寧篩選到的新鞘氨醇菌M-9 (Novosphingobium sp.M_9)的基因組文庫中克隆到一個編碼葡萄糖苷酶的基因，在大腸桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因生產(chǎn)β -葡萄糖苷酶，并能以纖維二糖為原料降解生成葡萄糖。本發(fā)明涉及一種β -葡萄糖苷酶的基因Sbgl，如序列表SEQ ID NO :1所述的堿基序列，是從實驗室構(gòu)建的新鞘氨醇菌M-9的基因組文庫中亞克隆得到。該β-葡萄糖苷酶基因Sbgl的序列是由2235個堿基組成，含有完整的β -葡萄糖苷酶基因Sbgl的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF), Sbgl基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。葡萄糖苷酶的基因Sbgl編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，由744個氨基酸組成,和Sbgl催化功能域同源性最高的是NovosphingobiumaromaticivoransDSM12444 (溶芳經(jīng)鞘氨醇單胞菌)的 glycoside hydrolase family3 domain protein (糖基水解酶家族3的功能域蛋白質(zhì))，兩者的一致性=496/740 (67%)、相似性=592/740 (80%)。β -葡萄糖苷酶的基因Sbgl在大腸桿菌中表達(dá)的重組產(chǎn)物Sbgl能夠分解纖維二糖。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體，及用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明基因的宿主。本發(fā)明提供了一個編碼糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因，該基因所編碼糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶具有分解纖維寡糖的用途。


圖I是篩選含有β -葡萄糖苷酶基因Sbgl重組菌株的七葉苷選擇平板圖。
圖2是β -葡萄糖苷酶Sbgl部分純化物的SDS-PAGE圖。圖3是β -葡萄糖苷酶Sbgl水解纖維二糖的HPLC圖。從圖I 了解到，含有β -葡萄糖苷酶基因Sbgl的重組菌株能夠在七葉苷篩選平板上形成黑色圈。圖2 了解到，β -葡萄糖苷酶Sbgl部分純化物的分子量為77. 8kDa。圖3中的A和B分別是葡萄糖和纖維二糖的標(biāo)樣。從圖3的C 了解到，β -葡萄糖苷酶Sbgl能將纖維二糖水解成葡萄糖。
具體實施例方式下述實施方法是為了更好的解釋本發(fā)明，而不應(yīng)該被解釋為限制本發(fā)明的目的。在本發(fā)明的實施例中所用到的材料包括大腸桿菌(Escherichia coli)株系EPI300,購自Epicentre公司，載體pUC19,購自大連TaKaRa公司；表達(dá)載體pQE30和表達(dá)宿主M15，購自Qiagen公司，以及購自TaKaRa、MBI的限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑。下面將通過實施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述I)新鞘氨醇菌M-9 (Novosphingobium sp. M-9)基因組文庫的構(gòu)建新鞘氨醇菌M-9的基因組DNA是按照BioFlux公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit (目錄號 BSC12S1)的使用說明來提取的。新鞘氨醇菌M-9的基因組文庫構(gòu)建是按照Epicentre公司的文庫制備試劑盒CopyControl Fosmid Library Production Kit (目錄號 CCFOSl 10)的使用說明書來進(jìn)行的。構(gòu)建好的新鞘氨醇菌M-9的基因組文庫涂布到在含12. 5 μ g/mL氯霉素的LA平板(每IOOmL LA培養(yǎng)基含蛋白胨lg，酵母粉0. 5g，NaCl :0. 5g，瓊脂粉1. 5g)上。結(jié)果共獲得約I. 2萬個轉(zhuǎn)化子。2)編碼糖基水解酶家族3的β -葡萄糖苷酶基因Sbgl序列的測定將在12. 5 μ g/mL含氯霉素的LA平板上得到的轉(zhuǎn)化子菌落分別轉(zhuǎn)點到含有12. 5 μ g/mL氯霉素、七葉苷、檸檬酸鐵銨、酵母粉、硝酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂的初篩培養(yǎng)基(每IOOmL初篩培養(yǎng)基含:七葉苷0. 2g，檸檬酸鐵銨0. 5g，酵母粉0. lg，硝酸銨0. 2g,磷酸氫二鉀0. 2g，硫酸鎂0. 04g，瓊脂粉1. 5g)的平板上，將平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時。結(jié)果篩選到四個能產(chǎn)黑色透明圈的克隆，本發(fā)明只涉及其中一個克隆。進(jìn)一步提取該克隆的質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切后，將獲得的DNA片段與經(jīng)EcoR I酶切的去磷酸化的PUC19質(zhì)粒進(jìn)行連接。再將連接產(chǎn)物用CaC12法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EPI300中，在含100 μ g/mL氨芐青霉素的初篩培養(yǎng)基平板上篩選亞克隆轉(zhuǎn)化子。結(jié)果共獲得約50個產(chǎn)生黑色圈的亞克隆轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步提取其中6個亞克隆轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶EcoR I完全酶切后，進(jìn)行O. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果這6個亞克隆轉(zhuǎn)化子除了都含有一個2. 7kb的載體片段外，還含有另外一條大小約為9. 5kb的外源DNA片段。挑取其中一個亞克隆子進(jìn)行測序，并命名為pUC-bgll，并送交華大基因公司測定DNA序列。3)編碼糖基水解酶家族3的β -葡萄糖苷酶基因Sbgl的核苷酸序列分析用 NCBI (National Center for Biotechnologylnformation, http://www.ncbi.nlm. nih. gov)上的軟件 ORF finder (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/orfig. cgi)和Blast (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)對 DNA 序列進(jìn)行分析?；?Sbgl 的開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)由2235個核苷酸組成,序列如SEQ ID NO :1。其中，Sbgl基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。4)編碼糖基水解酶家族3的β -葡萄糖苷酶基因Sbgl編碼的產(chǎn)物Sbgl的氨基酸序列分析·β -葡萄糖苷酶基因Sbgl編碼一個含744個氨基酸的蛋白質(zhì)，用DNAStar軟件預(yù)測該蛋白質(zhì)的理論分子量大小為77854. 42道爾頓。用簡單組件結(jié)構(gòu)研究工具(SimpleModular Architecture ResearchTool, SMART, http://smart, embl-heidelberg. de)分析 β -葡萄糖苷酶 Sbgl 的組件結(jié)構(gòu)，結(jié)果是自N端的第84-301位和369-631位氨基酸為家族3糖基水解酶(glycosylhydroIase)功倉泛域。5)編碼糖基水解酶家族3的β -葡萄糖苷酶基因Sbgl的克隆和表達(dá)使用上游引物5 ’ -AATAGATCTCAGGAAGCCGGTGCCCCGCCGGTA-3’ 和下游引物 5’ -ATCAAGCTTTCAATCCTTCCAGCTACGCGCCGG-3’，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增β -葡萄糖苷酶基因Sbgl，用限制性內(nèi)切酶BlII和Hind III酶切β-葡萄糖苷酶基因Sbgl后，與經(jīng)BamH I和Hind III酶切的表達(dá)載體PQE30進(jìn)行連接。再將連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ΕΡΙ300中，涂布到含100 μ g/mL氨芐青霉素的LA平板上。轉(zhuǎn)化得到的單菌落點板至含有100 μ g/mL氨芐青霉素、七葉苷、檸檬酸鐵銨的LA復(fù)篩培養(yǎng)基(每IOOmL復(fù)篩培養(yǎng)基含七葉苷0. 2g，檸檬酸鐵銨0. 5g，蛋白胨lg，酵母粉0. 5g，NaCl :0. 5g，瓊脂粉1. 5g)平板上，將平板置于370Cfl溫箱培養(yǎng)12小時，對每個轉(zhuǎn)點菌落逐個滴加I μ L用LB培養(yǎng)基稀釋成1%的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，然后，將平板置于37°C恒溫箱繼續(xù)培養(yǎng)12小時。時間到后，進(jìn)行氯仿熏蒸破胞，再把平板置于37°C恒溫箱使表達(dá)的Sbgl酶與七葉苷和檸檬酸鐵銨反應(yīng)12小時。觀察復(fù)篩平板。然后進(jìn)一步提取在復(fù)篩平板能形成黑色圈的克隆子的質(zhì)粒DNA，并將其命名為PQE-Sbgl，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind 111完全酶切pQE_Sbgl后，進(jìn)行0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果PQE-Sbgl除有一個約3. 8kb的DNA片段外，還有一條大小約為I. 7kb的DNA片段。將質(zhì)粒pQE-Sbgl用CaCl2法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)宿主Ml5 [pREP4]，涂布到含100μ g/mL氨芐青霉素和25μ g/mL卡那霉素的LA平板上。挑取轉(zhuǎn)化得到的單菌落接種到含100 μ g/mL氨芐青霉素和25 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，待OD6tltl為0. 4時，加入IPTG使其終濃度為O. 5mmol/L，20°C、180轉(zhuǎn)誘導(dǎo)24小時。IlOOOrpm離心3min,收集菌體，用4mLpH7. OI OOmmo I/L的磷酸緩沖液重懸菌體，超聲波破胞9分鐘。12000rpm離心20min,取上清進(jìn)行后面的蛋白質(zhì)純化。按每4mL上清液加入lmL50%的鎳親和層析膠體，在4°C用200轉(zhuǎn)搖60分鐘，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加ImL沖洗緩沖液(50mmol/LNaH2PO4, 300mmol/L NaCl, 20mmol/L咪唑，pH8. O)到柱子里，緩慢攪拌，收集流出物。重復(fù)沖洗步驟 4 次。加入洗脫緩沖液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH8. O)洗脫蛋白質(zhì)。收集洗脫的蛋白質(zhì)溶液，用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證，發(fā)現(xiàn)有目的大小的蛋白質(zhì)條帶。6)編碼糖基水解酶家族3的β -葡萄糖苷酶Sbgl水解纖維二糖的測定β -葡萄糖苷酶Sbgl以纖維二糖為底物、在ρΗ7. O的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和50°C下作用30分鐘。反應(yīng)時間到后，在100°C加熱10分鐘終止反應(yīng)。Sbgl水解纖維二糖的產(chǎn)物用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測。
HPLC檢測的結(jié)果顯示Sbgl能夠?qū)⒗w維二糖水解葡萄糖。以纖維二糖為底物的Sbgl 的酶活是 156. 87U/mg。HPLC條件儀器=AgilentllOO色譜儀；色譜柱氨基柱;流動相乙腈:水(70 30);流速1. OmL/min;檢測器RID (折光檢測器)。
權(quán)利要求
1.一個β-葡萄糖苷酶的基因Sbgl，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO :1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的基因所編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO2所示。
3.—種表達(dá)載體,其特征在于,它含有權(quán)利要求I所述的基因。
4.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
5.權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)在降解纖維二糖中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個編碼糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶的基因及其應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，所述基因編碼的β-葡萄糖苷酶Sbgl，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，所述基因編碼的β-葡萄糖苷酶Sbgl在分解纖維二糖中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/56GK102888416SQ20121038727
公開日2013年1月23日 申請日期2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月12日
發(fā)明者杜麗琴, 王子龍, 黃日波, 韋宇拓, 閉海, 黃金群 申請人:廣西大學(xué)