專利名稱：環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，以及該突變體酶在以淀粉為底物生產(chǎn)麥芽糖中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多功能淀粉酶是α淀粉酶家族(a-amylase family)的新一類成員，包括新普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶和環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，它們在結(jié)構(gòu)上具有α淀粉酶家族共有的4個高度保守的區(qū)域，但在功能上又兼有糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性，而不同的多功能淀粉酶雖然在結(jié)構(gòu)與功能上具有一定的相似性，但不同來源的酶在底物特 異性和水解、轉(zhuǎn)移糖苷鍵的特異性等方面存在著差異(Lee H S，Kim M S，Cho H S, et al.2002，Cyclomaltodextrinasejneopullulanase，and maltogenic amylase are nearlyindistinguishable from each other. J. Biol. Chem.，277(24):21891-21897)。環(huán)糊精葡糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase :EC2. 4. I. 19)是由芽孢類細(xì)菌產(chǎn)生的一類酶，主要出現(xiàn)在桿狀細(xì)菌中，最初在Bacillus macerans中分離出來，并在多種微生物發(fā)現(xiàn)(Cristiane Moriwakiaj Glauciane L. Costaaj Rubia Pazzettoaj et al. 2007, Productionand characterization of a new cyclodextrin glycosyItransferase from Bacillusfirmus isolated from Brazilian soil,Process Biochemistry. 42 (10) :1384-1390)。環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化糖基反應(yīng)通常包括以下四種作用方式(Qi Q S, ZimmermannW. 2005，Cyclodextrin glucanotransferase from gene to application.Appl.Microbiol. Biotechnol.，66，475-485. ) (I)環(huán)化作用α 一( I — 4)葡聚糖分子通過分子內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生成環(huán)糊精。(2)偶合作用是環(huán)化作用逆反應(yīng)，打開環(huán)糊精環(huán)，把它結(jié)合到葡萄糖和麥芽糖等受體上。(3)歧化反應(yīng)直鏈寡糖分子間進行糖基轉(zhuǎn)移作用，生成聚合度不同各種糖分子。(4)水解作用其水解速度一般為環(huán)化反應(yīng)速度萬分之十五左右。麥芽糖淀粉酶(Maltogenica -amylase, MAase)全稱 l，4_a-D_ 葡聚糖 a-麥芽糖基水解酶[1，4- a -D-glucan a -maltohydrolase, EC3. 2. I. 133]，是一類水解a-l，4_D-葡萄糖苷鍵的內(nèi)切淀粉酶，作用于淀粉及相關(guān)多聚糖、寡糖，產(chǎn)物為a-麥芽糖。麥芽糖單位從淀粉鏈的非還原末端按順時針方向被水解下來(Kim DY，Cha CHj OhWSj et al. 2004, Expression of the promoter for the maltogenic amylase gene inBacillus subtilis 168. J Microbiol，42:319 327)。麥芽糖淀粉酶基因主要來源于枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)、錯狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Geobacillus stearothermophilus)、棲熱菌屬(Thermus sp.)、嗜熱放線菌(Thermusvulgaris)等。麥芽糖淀粉酶主要應(yīng)用于焙烤工業(yè)。在面團中加入適量的麥芽糖淀粉酶，該酶在焙烤過程的前期分解面團中的淀粉分子產(chǎn)生麥芽糖等小分子糖類，這些小分子糖類能阻止面包中蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)與淀粉顆粒之間形成鉸鏈，從而延緩面包的老化(王學(xué)東，楊浩，姚娟，等.真菌α-淀粉酶和麥芽糖α-淀粉酶對饅頭粉品質(zhì)改良的比較研究.2006，食品科技，31(10) :48 — 52.)。另一方面，麥芽糖淀粉酶還可以直接催化淀粉轉(zhuǎn)化生成異麥芽寡糖(IMO) (Park K H, Kim T J, Cheong T K, et al. 2000, Structure, specificityand function of cyclomaltodextrinase, a multispecific enzyme of the a -amylasefamily. Biochim BiophyActa, 1478 (2) : 165-185)。異麥芽寡糖是有效的雙歧因子，對維持和增強人體健康、提高人體免疫力有重要的作用。麥芽糖淀粉酶的發(fā)掘和應(yīng)用勢必極大地促進將較廉價淀粉轉(zhuǎn)化為較昂貴的IMO的技術(shù)發(fā)展(Park K H. 2006, Function andtertiary-and quaternary-structure of eyelodextrin-hydrolyzing enzymes (CDase), agroup of multisubstrate specific enzymes belonging to the a -amylase family. JAppl Glycosci, 53(I):35-44)。于是，我們通過酶分子改造技術(shù)將環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Pcgt突變成了麥芽糖淀粉酶Mcgt，使得突變酶Mcgt的環(huán)化功能有較大的降低、水解活性獲得很大提高——麥芽糖的產(chǎn)量占總反應(yīng)產(chǎn)物的66. 39%。這樣，高產(chǎn)麥芽糖的性質(zhì)使得突變酶Mcgt還可以用于以淀粉為底物生產(chǎn)高麥芽糖漿。 高麥芽糖漿是一種麥芽糖含量高，葡萄糖含量低的中等轉(zhuǎn)化糖漿。它的特點是清亮透明，熬煮溫度高，與葡萄糖漿相比，還具有甜味柔和，保濕性好，熱穩(wěn)定性高，抗結(jié)晶等優(yōu)良性能，因此在食品工業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景。高麥芽糖漿用于甜食中有保水，保香；用于棉花糖、奶油冰淇淋可降低其甜度；用于餡類甜食，有提味、保色以及防腐的效果；用于年糕、江米團等食品能保持其柔軟度，延長保存時間；用于魚肉凍等膠凍類食品能保持其鮮度，改進質(zhì)量。高麥芽糖漿不僅用于食品工業(yè)，而且在酶制劑及醫(yī)藥工業(yè)中也有廣泛的用途。以麥芽糖淀粉酶為關(guān)鍵詞查找國家知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索數(shù)據(jù)庫，共出現(xiàn)10項發(fā)明專利。只有I項是關(guān)于麥芽糖淀粉酶的，是通過HN02對天然生麥芽糖淀粉酶進行化學(xué)修飾，獲得了最適PH較低的麥芽糖淀粉酶；其它9項發(fā)明專利是描述麥芽糖淀粉酶在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。以環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為關(guān)鍵詞查找國家知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索數(shù)據(jù)庫，共出現(xiàn)16項發(fā)明專利。其中只有兩項是關(guān)于環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變的，這兩項發(fā)明專利都是對來自 Peanibacillus macerans JFB05-01 (CCTCC NO M208063)的 CGT 酶分別進行多個氨基酸位點的突變，分別獲得了高產(chǎn)α-環(huán)糊精和高產(chǎn)β-環(huán)糊精能力的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的突變體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的改造，使之獲得新的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，這個突變體酶可用于以淀粉為底物生產(chǎn)麥芽糖。本發(fā)明所述的新的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Mcgt (SEQ ID Ν0:1)，其是通過分子改造β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因Pcgt而得到的，基因Pcgt來自專利申請?zhí)枮?01110171181. 0，具體是通過在Pcgt分子上突變200位和201位的氨基酸，由亮氨酸Leu和酪氨酸Tyr突變成苯丙氨酸Phe和蘇氨酸Thr,同時加入了 5個氨基酸序列，改造得到一個新的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體。這個環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體和原酶相比，能夠以淀粉為原料高產(chǎn)麥芽糖。
SEQ ID NO :1的蛋白質(zhì)是環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Mcgt，由697個氨基酸組成。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的宿主。本發(fā)明所述的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體在以淀粉為原料生產(chǎn)麥芽糖中具有廣泛的用途。本發(fā)明所述的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的制備方法包括β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體基因的獲得、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體基因的表達和純化以及環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體水解淀粉產(chǎn)物的測定等步驟。


圖I是環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Mcgt部分純化物的SDS-PAGE圖。 圖2是突變前環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Pcgt的淀粉水解產(chǎn)物的HPLC圖。圖3是環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Mcgt的淀粉水解產(chǎn)物的HPLC圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步說明。材料準(zhǔn)備大腸桿菌(Escherichiacoli) XLIO-Gold、載體 pSE380 購自Invitrogen公司、Ni-NTA蛋白質(zhì)組氨酸純化介質(zhì)購自Novagen公司、聚合酶購自TaKaRa公司、修飾酶DpnI購自MBI公司。I)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因Pcgt的克隆使用上游引物5 ’ -TCGCCATGGTGCACCACCACCACCACCACATTACGCCAGCTTGCATGCTGCAG-3’ (包含一個Nco I酶切位點和一個6xHis標(biāo)簽在5’末端)和下游引物5’-CACAAGCTTTTAAGGCTGCCAGTTCACGTTAATG-3’ (包含一個Hind III酶切位點)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因Pcgt，用限制性內(nèi)切酶Nco I和Hind III酶切環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因Pcgt后，插入到經(jīng)Nco I和Hind III酶切的表達載體PSE380進行連接。獲得的重組質(zhì)粒命名為pSE-Pcgt。2)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體基因Mcgt的獲得Mcgt基因是根據(jù)Pcgt基因序列信息通過在正向引物中將編碼亮氨酸CTG和酪氨酸TAC人為地突變成苯丙氨酸TTC和蘇氨酸ACT和加入了 5個氨基酸的核苷酸序列(CAGCTGGCTTCTCGC)來進行改造。以I)中構(gòu)建的pSE-Pcgt為模板，使用正向引物5’ -TACAAAAACCTGTACGATCCAGCTGGCTTCTCGCTCGCCGACCTGAACCAT-3’和反向引物 5’-ATGGTTCAGGTCGGCGAGCGAGAAGCCAGCTGGATCGTACAGGITITTGTA-3’ 進行 PCR，PCR 反應(yīng)程序第一步 95°C 2 分鐘；第二步進行30個循環(huán)，循環(huán)為98°C 10秒，68°C 6. 5分鐘；第三步72°C 10分鐘。PCR產(chǎn)物使用IuL Dpn I在37°C酶切一個小時，然后用CaCl2化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLlO-Gold感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物克隆送交華大生物公司進行DNA測序分析確定正確的轉(zhuǎn)化子。3)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體基因Mcgt的表達和表達產(chǎn)物的部分純化將含有質(zhì)粒pSE-Mcgt的重組大腸桿菌XLlO-Gold菌株接種到20mL含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)，待OD6tltl為O. 6時，加入IPTG(終濃度為O. 5mmol/L)、L-三梨醇(終濃度為100mmol/L)和甜菜堿(終濃度為2. 5mmol/L)，20°C誘導(dǎo)20小時。11000 轉(zhuǎn)離心 3min,收集菌體，用 4mL 裂解緩沖液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl,IOmmoI/L咪唑，pH8. O)重懸菌體，超聲波破胞9分鐘。12000轉(zhuǎn)離心lOmin，取上清進行后面的蛋白質(zhì)純化。按每4ml上清液加入lmL50%的鎳親和層析膠體，在4°C用200轉(zhuǎn)搖60分鐘，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加Iml沖洗緩沖液(50mmOl/LNaH2P04，300mmOl/LNaCl, 20mmol/L咪唑，pH8. O)到柱子里，緩慢攪拌，收集流出物。重復(fù)沖洗步驟4次。加入洗脫緩沖液(50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH8. O)洗脫蛋白質(zhì)。收集洗脫的蛋白質(zhì)溶液，用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證，發(fā)現(xiàn)有目的大小的蛋白質(zhì)條帶。4)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Mcgt水解淀粉的產(chǎn)物測定環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Mcgt水解淀粉的反應(yīng)取3 μ I環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Mcgt的部分純化物，與l%(w/v)淀粉溶液(用50mmol/L pH7. O磷酸緩沖液溶解)
在500 μ I的反應(yīng)體系中37°C作用3個小時。反應(yīng)時間到后，在100°C加熱10分鐘終止反應(yīng)。Mcgt的產(chǎn)物用高效液相色譜法(HPLC)進行檢測。HPLC檢測的結(jié)果顯示Mcgt的產(chǎn)物中有葡萄糖、麥芽糖、α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精存在，其中水解產(chǎn)物中麥芽糖的產(chǎn)量占總的水解產(chǎn)物的66. 39%。HPLC條件儀器=AgilentllOO色譜儀；色譜柱氨基柱;流動相乙腈:水(70 30);流速1. OmL/min;檢測器折光檢測器RID。從圖I 了解到，環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Mcgt部分純化物的分子量為
75.7kDa。圖2中的A、B和C分別是葡萄糖、α -環(huán)糊精和β -環(huán)糊精的標(biāo)樣，D是Pcgt轉(zhuǎn)化淀粉的產(chǎn)物。從圖2的D中了解到，β -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶Pcgt能將淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖、α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和Y-環(huán)糊精。圖3中的Α、B、C和D分別是葡萄糖、麥芽糖、α -環(huán)糊精和β -環(huán)糊精的標(biāo)樣，E是Mcgt轉(zhuǎn)化淀粉的產(chǎn)物。從圖3的E中了解到，環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體Mcgt能將淀粉轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖、α -環(huán)糊精和β -環(huán)糊精。其中水解產(chǎn)物中麥芽糖的產(chǎn)量占總水解產(chǎn)物的66. 39%，見表I所示。表I
權(quán)利要求
1.一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所/Jn ο
2.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求I所述的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
3.權(quán)利要求I所述的突變體蛋白質(zhì)在以淀粉為原料生產(chǎn)麥芽糖中的應(yīng)用。
全文摘要
一種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。該突變體酶相對于突變前的酶具有高產(chǎn)麥芽糖的功能。該突變體酶能夠在以淀粉為原料生產(chǎn)麥芽糖中應(yīng)用。
文檔編號C12P19/18GK102876640SQ20121038724
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月12日
發(fā)明者龐浩, 黃日波, 韋廷宗, 李濤, 裴建新 申請人:廣西科學(xué)院