專利名稱：一種蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化高活力菌株的制作方法
一種蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化高活力菌株技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物，尤其涉及一種蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化高活力菌株，該菌株為植物乳桿菌植物亞種 RF17 (Lactobacillus pi ant arum subsp. plantarum)。
背景技術(shù)：
果酒中高含量的蘋果酸會(huì)導(dǎo)致酒體酸澀、粗糙感強(qiáng)，蘋果酸-乳酸發(fā)酵是乳酸菌以雙羧基的L-蘋果酸為底物，在蘋果酸-乳酸酶催化下轉(zhuǎn)變成單羧基L-乳酸和CO2的過(guò)程，此過(guò)程可使酒體變?nèi)岷?，并起到風(fēng)味修飾作用，是釀造優(yōu)質(zhì)果酒的重要生物降酸工序之一。但是果酒中高含量的二氧化硫和酒精濃度、低PH值、及較低的發(fā)酵溫度等均抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，從而大大降低了乳酸菌的降酸效果。為了解決上述問(wèn)題，本申請(qǐng)人于2011年09月20日申請(qǐng)的公開號(hào)為CN102358888A、名稱為“一株植物乳桿菌R23”中國(guó)專利；《中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)(增刊)》，2010年8月，26 =204-208 ;及《福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》2009年12月，24 (6):570_574等文獻(xiàn)上均揭露了一株從枇杷酒醪中篩選出的菌株即植物乳桿菌R23，該植物乳桿菌R23具有較強(qiáng)的蘋果酸乳酸發(fā)酵能力和抗逆性，已在枇杷酒、刺葡萄酒、楊梅酒等果酒生物降酸，以及酸性果蔬汁的乳酸發(fā)酵飲料生產(chǎn)中得到良好應(yīng)用；其主要作用機(jī)制是，果酒中的蘋果酸在菌體合成的蘋果酸乳酸酶的催化下轉(zhuǎn)化為乳酸，從而使酒體酸度下降，口感柔和，此過(guò)程是生產(chǎn)高品質(zhì)果酒的關(guān)鍵技術(shù)；而在果蔬汁乳酸發(fā)酵中，該菌株能快速適應(yīng)PH3. O以上的酸性環(huán)境，并以有機(jī)酸為主要碳源進(jìn)行增殖，突破乳酸發(fā)酵的技術(shù)瓶頸，同時(shí)賦予果蔬汁愉快協(xié)調(diào)的發(fā)酵香；蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化活力的大小間接反映了蘋果酸乳酸酶活力的大小，并直接影響著蘋果酸乳酸發(fā)酵進(jìn)行的程度，是選擇優(yōu)良蘋果酸乳酸發(fā)酵(malolactic fementation,MLF)菌株的基本標(biāo)準(zhǔn)。雖然上述植物乳桿菌R23能夠?qū)破鸬搅己玫慕邓嵝Ч珡臉I(yè)人員希望獲得蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化活力更高的菌株，從而為果酒的生物降酸及乳酸發(fā)酵功能性飲料的研究等·提供新菌源。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化高活力菌株，該菌株為植物乳桿菌植物亞種 RF17(Lactobacillus plantarum subsp. plantarum RF17),且該植物乳桿菌植物亞種RF17于2012年03月16日保藏于位于武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2012085o本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題的本申請(qǐng)人對(duì)植物乳桿菌R23 (Lactobacillus plantarum)進(jìn)行紫外亞硝基胍復(fù)合誘變得到的菌株，通過(guò)對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，最終鑒定其為植物乳桿菌植物亞種的一個(gè)菌株。進(jìn)一步地，該菌株能在具有如下至少一個(gè)條件的酒體內(nèi)正常生長(zhǎng)
SO2 含量120±10mg/L;
酒精度(v/v)13 ±2%;
pH 值1.5±0_2;
總酸(以蘋果酸計(jì))1.0 + 0.2%; 培養(yǎng)溫度18±2 。本發(fā)明的有益效果在于提供一種植物乳桿菌植物亞種RF17 (Lactobacillusplantarum subsp. plantarum),該菌株不僅具有較強(qiáng)的蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化活力、益生特性,而且抗逆性高，可在蘋果酸乳酸酶的催化作用下進(jìn)行蘋果酸乳酸發(fā)酵，能更有效降低果酒、果
汁中的蘋果酸、增加乳酸及揮發(fā)酯等的含量，從而使果酒、果汁口感更加柔和、協(xié)調(diào)，氣味芳香濃郁，為提高果酒、果汁品質(zhì)奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為果酒的生物降酸及乳酸發(fā)酵功能性飲料的研究提供新的菌源。

下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。圖I是本發(fā)明中菌株RF17的革蘭氏染色示意圖。圖2是本發(fā)明中菌株RF17的掃描電鏡示意圖。圖3是本發(fā)明中菌株RF17的透射電鏡示意圖。圖4是本發(fā)明中菌株RF17與相關(guān)種的16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹示意圖。圖5是本發(fā)明中菌株RF17與相關(guān)種的pheS序列系統(tǒng)發(fā)育樹示意圖。圖6是本發(fā)明中菌株RF17與植物乳桿菌R23的凝集特性示意圖。圖7是本發(fā)明中菌株RF17與對(duì)照菌株的抗氧化能力示意圖。
具體實(shí)施方式本發(fā)明植物乳桿菌植物亞種RFlKLactobacillus plantarum subsp. plantarum)是對(duì)植物乳桿菌R23 (Lactobacillus plantarum)進(jìn)行紫外亞硝基胍復(fù)合誘變得到的。一、該菌株RF17的獲得將2mL濃度為2. O 3. O X 107cfu/mL植物乳桿菌R23的菌懸液進(jìn)行離心收集菌體，并往收集到的菌體中添加亞硝基胍以形成亞硝基胍溶液，且該亞硝基胍溶液中亞硝基胍的濃度為2mg/mL,之后置28°C搖床150r/min振蕩處理60min,振蕩結(jié)束后按2. 5倍亞硝基胍溶液體積加入25%硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng),接著于12000rpm下離心IOmin,棄去上清液，用5mLPBS溶液洗滌菌體三次；然后于洗滌后的菌體中加2mLPBS溶液以混勻菌體得菌液，取該菌液O. ImL涂布于計(jì)數(shù)平板上，再將計(jì)數(shù)平板置于距離15w紫外燈20cm下照射20s，照射完畢后用黑布包好計(jì)數(shù)平板并置于28°C下培養(yǎng)3d;將形態(tài)特征相同的菌株進(jìn)行剔除，用接種環(huán)挑取剩余菌株于改良TJA斜面培養(yǎng)基中，并編號(hào)，28 °C培養(yǎng)3d ;之后將改良TJA斜面培養(yǎng)基中的菌株等量接種于測(cè)試培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)18h后，分別測(cè)定接種不同菌株的測(cè)試培養(yǎng)基中的總酸，且以植物乳桿菌R23為對(duì)照菌，篩選出降酸能力最強(qiáng)的菌株，并命名該菌株為菌株RF17。
其中，植物乳桿菌R23的菌懸液制備方法為將植物乳桿菌R23接種于LH18培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液5mL于IOmL無(wú)菌離心管中，并將該無(wú)菌離心管置于12000r/min下離心IOmin,棄去上清液,用無(wú)菌PBS溶液5mL洗漆兩次,再加5mL無(wú)菌PBS溶液混勻，最后將此菌液稀釋100倍，所得的菌體懸浮液即為濃度為2. O 3. OX 107cfu/mL的菌懸液，待用；PBS溶液的配制按照O. 2mol/L磷酸氫二鈉26. 5mL 0. 2mol/L磷酸二氫鈉73. 5mL的比例混合，并調(diào)節(jié)溶液的pH至6. 4即得所需的PBS溶液；計(jì)數(shù)平板與改良TJA斜面培養(yǎng)基的組分均為番茄汁50mL，酵母抽提液5g，牛肉膏10,乳糖20g,葡萄糖2g,磷酸氫二鉀2g,吐溫80. Ig,乙酸鈉5g,加蒸懼水至1L,ρΗ6· 8±0· 2，121°C下滅菌 20min ；測(cè)試培養(yǎng)基的組分為番茄汁10%，酵母膏O. 2%，牛肉膏O. 4 %，MgSO4O. 02%,乙酸鈉 O. 5%, Tween-800. 1%，檸檬酸銨 O. 2%, MnSO4 O. 005%,胰蛋白胨 1%，蘋果酸 O. 5%, ρΗ4· 8±0· 2，I X IO5Pa 下滅菌 20min ；LH18培養(yǎng)基(下同)的組分為番茄汁IOOmL,酵母膏7.4g，牛肉膏10g，葡萄糖30g，MgSO4 O. 36g，蘋果酸鈉20g，吐溫lg，胰蛋白胨15g，檸檬酸銨2g，MnS04 O. 05g，加水補(bǔ)足1L。二、該菌株RF17的鑒定I.初步鑒定一形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定將篩選所得的菌株RF17進(jìn)行形態(tài)及理化特性等研究，得到該菌株RF17的主要形態(tài)及培養(yǎng)特征如下菌落直徑1.0 I. 8mm，菌落乳白色，圓形，表面光滑、凸起、濕潤(rùn)，不透明，邊緣整齊；對(duì)菌株RF17進(jìn)行革蘭氏染色(示意圖如圖I所示)、并將菌株RF17置于掃描電鏡及透射電鏡分別進(jìn)行觀察(其中掃描電鏡示意圖如圖2所示、透射電鏡示意圖如圖3所示)得知，菌體桿狀，O. 5 μ mX I. 33 I. 67 μ m，單個(gè)、成對(duì)或呈短鏈狀排列，不生孢，革蘭氏陽(yáng)性；液體培養(yǎng)無(wú)菌膜、無(wú)氣泡、菌液渾濁、分層明顯、菌體不易離心且底部有白色沉淀。以下表I中是其具體生理生化鑒定指標(biāo)表I菌株RF17的生理生化鑒定指標(biāo)
權(quán)利要求
1.一種蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化高活力菌株，其特征在于所述菌株為植物乳桿菌植物亞種RF17 (Lactobacillus pi ant arum subsp. plantarum)，于 2012 年 03 月 16 日保藏于位于武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M 2012085。
全文摘要
本發(fā)明提供一種蘋果酸乳酸轉(zhuǎn)化高活力菌株，該菌株為植物乳桿菌植物亞種RF17(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)，于2012年03月16日保藏于位于武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2012085。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用該菌株即植物乳桿菌植物亞種RF17能夠更有效降低果酒、果汁中的蘋果酸、增加乳酸及揮發(fā)酯等的含量，從而使果酒、果汁口感更加柔和、協(xié)調(diào)，氣味芳香濃郁，為提高果酒、果汁品質(zhì)奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為果酒的生物降酸及乳酸發(fā)酵功能性飲料的研究提供新的菌源。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102925384SQ20121038560
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日 公開號(hào)201210385606.發(fā)明者何志剛, 任香蕓, 梁璋成, 李維新, 林曉姿, 魏巍 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所