專利名稱：桑黃菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵產(chǎn)桑黃多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具體涉及一種桑黃菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵產(chǎn)桑黃多糖的方法。
背景技術(shù)：
^MiPhellinus igfliariiAs),中藥名，由于通常生長在桑屬(Morus L.)植物上且子實(shí)體為黃褐色的緣故而得名，有“森林黃金”之美稱。桑黃是一種大型珍貴的多年生藥用真菌，以子實(shí)體入藥，在我國，應(yīng)用桑黃治病從明朝開始到至今已經(jīng)有2000多年的歷史了。在古代，民間就流傳有“桑樹生黃，幸得之，百病可醫(yī)”的說法及“如果得到附生于桑樹上的黃色疙瘩(桑黃)，死人也可復(fù)活”的傳說。中醫(yī)認(rèn)為桑黃性寒、味微苦、味辛，歸肝、膀胱經(jīng)。本品辛行甘和，人血分以化瘀，瘀血循經(jīng)而行出血止，有化瘀之功效，能利五臟、軟堅(jiān)、排毒、止血、活血和胃止瀉等。民間用于治痢疾、盜汗、血崩、血淋、臍腹?jié)?、瘡窟積聚、癖軟、脫肛瀉血、帶下、經(jīng)閉、脾虛泄瀉等。同時(shí)民間把它作為一種治療肝病、癌癥的絕藥。 近幾年來，隨著現(xiàn)代分析與檢測方法的不斷改進(jìn)及新方法的開發(fā)，對桑黃的研究也進(jìn)入了一個(gè)新的階段。其藥用價(jià)值也引起了各國科學(xué)家們的關(guān)注。隨著越來越多國家對桑黃的人工栽培、生物學(xué)特性、所含多糖、多糖分子結(jié)構(gòu)及其藥理作用等方面開展的廣泛而深入的研究，而且由于桑黃是目前國際公認(rèn)的生物治癌領(lǐng)域中有效率排在第一位的藥用菌，其在抗腫瘤、提高免疫功能以及治療疾病等方面都有明顯的作用，所以其具有廣闊的市場前景。但是由于桑黃對生長環(huán)境、溫度、濕度要求極高，加之生長周期長，極難發(fā)現(xiàn)，因而天然的桑黃數(shù)量非常稀少，貨源奇缺，價(jià)格昂貴。同時(shí)由于外商需求量大，經(jīng)濟(jì)效益高，致使各產(chǎn)地對桑黃進(jìn)行掠奪性開采，野生子實(shí)體孢子無法形成。在我國東北地區(qū)該資源已經(jīng)難以恢復(fù)，西北也即將枯竭。再加上我國天然的桑黃數(shù)量本來就非常稀少，子實(shí)體的人工栽培尚處于起步階段，所以要想形成穩(wěn)定的醫(yī)藥工業(yè)產(chǎn)品來源，就必須充分挖掘桑黃的自然資源，深入開展桑黃菌種的分離培養(yǎng)，以利于分離出生長周期短、抗污染能力強(qiáng)、多糖產(chǎn)量高及其藥理作用好的桑黃菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種桑黃菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵產(chǎn)桑黃多糖的方法，能顯著提高桑黃的菌絲體產(chǎn)量和胞內(nèi)、外多糖含量。首先提供了一種用于桑黃菌株液體發(fā)酵的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20-30 g/L，酵母粉 2-6 g/L, KH2PO4 1-3 g/L，MgSO4 · 7H20 O. 3-0. 7 g/L, Vbi 10 mg/L，水 1L，pH自然。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的配方為葡萄糖25 g/L，酵母粉6 g/L, KH2PO4 I g/L,MgSO4 · 7H20 O. 5 g/L, Vbi 10 mg/L，水 1L，pH 自然。利用上述的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)桑黃多糖的方法，其發(fā)酵條件溫度28-32 °C，搖速140-180 rpm，接種量20%-30 %，培養(yǎng)天數(shù)9_11 d ;離心，收集發(fā)酵液，用蒸餾水洗滌沉淀，獲得菌絲體；然后進(jìn)行胞內(nèi)、胞外多糖提取。所述胞內(nèi)多糖的提取將烘干后的菌絲體研磨粉碎，過40目篩后，稱取I g菌絲體粉，加入10-30 ml蒸餾水，80-100°C熱水浸提O. 5_3h，抽濾，濃縮至原體積的1/5，然后加3倍體積的無水乙醇，4°C靜置12 h，10000 rpm，4°C離心10 min，收集沉淀，干燥；得到的胞內(nèi)
粗多糖溶于水用苯酚硫酸法測多糖含量。所述胞外多糖的提取將發(fā)酵液濃縮至原體積的1/5，然后加3倍體積的無水乙醇，4°C靜置12 h, 10000 rpm，4°C離心10 min，收集沉淀，干燥；得到的胞外粗多糖溶于水用
苯酚硫酸法測多糖含量。更優(yōu)選地，發(fā)酵條件溫度28 0C，搖速160 rpm,接種量25 %，培養(yǎng)天數(shù)10 d。 最佳胞內(nèi)多糖提取工藝料水比w/v=l:30，浸提溫度90 °C，浸提時(shí)間O. 5 h，浸提次數(shù)3次。本發(fā)明用于優(yōu)化的桑黃菌株為裂蹄木層孔菌(/%e77i/W5· linteus')ph. I0003+1，于2012年7月12日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址武漢武漢大學(xué)，保藏編號CCTCC M 2012284)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)一是能顯著提高桑黃的菌絲體產(chǎn)量和胞內(nèi)、外多糖含量，經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)基配方，優(yōu)化發(fā)酵條件，優(yōu)化多糖提取工藝等步驟得到桑黃的菌絲產(chǎn)量比通用真菌培養(yǎng)基培養(yǎng)出的菌絲產(chǎn)量高275. 90 %，胞內(nèi)多糖含量高101. 18%，胞外多糖含量高23. 13% ；而桑黃多糖的得率比用一般熱水浸提法提取的多糖高6. 34 %。二是通過動(dòng)物試驗(yàn)證明提取的桑黃多糖具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等生物活性。


圖I為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖2為腹部明顯腫大的腹水小鼠。圖3為從小鼠腹腔中抽取的腹水。圖4為右前肢腋下腫瘤明顯長大的小鼠。圖5為剝離的腫瘤。圖6為桑黃菌種I 0003+1培養(yǎng)平板。
具體實(shí)施例方式桑黃菌種篩選
I實(shí)驗(yàn)材料
1.1供試菌株
三株桑黃菌種，編號分別為7 OOOLM I 0003,M I 0003+1，來源于福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心。I. 2培養(yǎng)基
PDA固體培養(yǎng)基馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，pH自然，加水定容到I
L0通用真菌培養(yǎng)基葡萄糖20 g，蛋白胨 4 g，KH2PO4 I. O g，MgSO4 · 7H20 O. 5 g，VB110 mg, pH自然，加水定容到I L。
I. 3受試動(dòng)物
KM小鼠，雌性，體重(20±2) g左右，SPF級；移植性小鼠腫瘤S-180腹水型；全價(jià)營養(yǎng)鼠飼料均購自福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。2試驗(yàn)方法
2.I活化菌種
用PDA固體斜面培養(yǎng)基活化三株桑黃菌種。在超凈工作臺中，從原試管中挑取O. Icm3左右的菌塊至新的PDA固體斜面培養(yǎng)基上，編號，放置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)至菌絲長滿管。2. 2測定生長速度
在超凈工作臺中，將活化后的三株菌種分別從試管中挑取O. Icm3左右的菌塊至新的 PDA固體平板培養(yǎng)基上，編號，每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)，放置于25°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)平板培養(yǎng)基上的菌絲長至半徑為Icm時(shí)開始測定三株菌種的生長速度，直至菌絲長滿平板培養(yǎng)基。菌種平均生長速度=Σ (每天測量的菌絲半徑一前一天測量的菌絲半徑)(cm) /測量天數(shù)(d)
2.3測定液體培養(yǎng)基中的菌絲體產(chǎn)量
在容量為5L的三角瓶中裝入IL的真菌通用液體培養(yǎng)基，在超凈工作臺中，將一根長滿菌絲的試管中的培養(yǎng)基搗碎接入一瓶真菌通用液體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌種設(shè)置4個(gè)重復(fù)，放置于25°C，120 rpm恒溫?fù)u床上培養(yǎng)10天。10天后，用紗布濾去培養(yǎng)液，收集不同菌種的菌絲體與培養(yǎng)皿中，編號，再將菌絲體置于60°C的烘箱中烘干至恒重，最后稱取不同菌種菌絲體的干重。2. 4測定胞內(nèi)、胞外多糖含量 2.4. I測定胞內(nèi)多糖含量
(I)提取粗多糖
將烘干后不同菌種的菌絲體研磨粉碎，過40目篩后，分別稱取I g不同菌種菌絲體粉末，加入30 mL蒸餾水，100°C熱水浸提3h。再真空抽濾，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將體積濃縮為原來的1/5左右。然后加3倍體積的無水乙醇，4°C靜置12 h, 10000 rpm，4°C離心10 min，收集沉淀，_80°C放置24 h,再冷凍干燥12 h,收集干燥物,稱重并記錄。(2)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 A. 0.01 %葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制
精確稱取105 1干燥恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖50. 08 mg，定容于100 mL容量瓶中，配制成O. 05 %的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液母液；取上述母液10 mL定容于50 mL容量瓶中，配制成O. 01 %葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。B. 5 %苯酹溶液的配制
精確稱取5. 0012 g重蒸酚，定容于100 mL容量瓶中，配制成5. 0012 %的苯酚溶液。此溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。C.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.0，O. 1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4 mL，置于不同的具塞試管中，編號，分別加蒸餾水至2. O mL，另以2.0 mL蒸餾水作為空白對照，再分別加入5.0012 %的苯酚溶液I. O mL搖勻，迅速滴加濃硫酸5. O mL，振蕩混勻后，置于冰浴中20 min后取出置于室溫30 min，利用紫外分光光度計(jì)于490 nm處測定吸光值，記錄數(shù)據(jù)，以糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)測定多糖含量
分別稱取5.0 mg不同菌種的胞內(nèi)多糖樣品定容于25 mL容量瓶中，編號，每個(gè)菌種設(shè)置4個(gè)重復(fù)，然后再分別吸取不同菌種的多糖樣品液I. O mL，按上述方法操作，最后記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算多糖含量。2. 4. 2測定胞外多糖含量
(I)提取粗多糖
將過濾后的培養(yǎng)液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將體積濃縮為原來的1/5左右。然后加3倍體積的無水乙醇，4°C靜置12 h, 10000 rpm，4°C離心10 min，收集沉淀，_80°C放置24 h，再冷凍干燥12 h，收集干燥物，稱重并記錄。 (2)測定多糖含量
分別稱取5.0 mg不同菌種的胞外多糖樣品定容于25 mL容量瓶中，編號，每個(gè)菌種設(shè)置3個(gè)重復(fù)，然后再分別吸取不同菌種的多糖樣品液I. O mL，按上述方法操作，最后記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算多糖含量。2. 5測定抑瘤率
2.5. I小鼠S18tl荷瘤模型的建立
根據(jù)衛(wèi)生部編寫的保健食品功能學(xué)評價(jià)程序和檢驗(yàn)方法 建立模型。S18tl細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，在細(xì)胞的指數(shù)生長期收集細(xì)胞，1000 rpm離心5 min后，沉淀細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌，1000 rpm離心5 min，重復(fù)2次，收集沉淀細(xì)胞，用無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整到2_3 X IO6/mL。然后隨機(jī)選取5只健康的KM小鼠，每只用0.3 mL上述細(xì)胞懸液進(jìn)行腹腔注射。觀察接種小鼠的腹水生長情況。2. 5. 2試驗(yàn)動(dòng)物分組和灌胃
將18只健康的雌性KM小鼠隨機(jī)分成3組，分別為M I 0001組，ph. I 0003組，ph. I0003+1組，每組6只。從上述5只腹部腫大的小鼠中各抽取I mL腹水，用無菌生理鹽水按照1:1的比例稀釋上述腹水，每只小鼠用O. 2 mL的腹水稀釋液進(jìn)行右前肢腋下的皮下注射，在皮下注射后24 h內(nèi)每組小鼠用不同菌種的多糖溶液進(jìn)行灌胃，灌胃劑量為600 mg/Kg_d，每天I次，連續(xù)灌胃10 d。另設(shè)腫瘤對照組，每天以等體積的生理鹽水灌胃。每組小鼠自由進(jìn)食與飲水。2. 5. 3測定抑瘤率
接種腫瘤后每天定時(shí)灌胃，觀察小鼠的生長情況，10 d后，停止灌胃24 h后脫椎處死小鼠，稱量每組小鼠的體重，用解剖器械小心切開腫瘤表面皮膚，充分暴露瘤塊組織，沿腫瘤包膜小心剝離腫瘤組織，將剝下的瘤塊置于無菌濾紙上吸盡瘤塊周圍殘留血跡，稱取并記錄瘤重，計(jì)算腫瘤生長抑制率。抑瘤率=(對照組平均瘤重-灌胃組平均瘤重)/對照組平均瘤重X 100 %
3結(jié)果與分析
3.I三株桑黃菌種的生長速度
通過每天測量三株桑黃菌種的半徑，記錄并計(jì)算它們的平均生長速度(如表I)。根據(jù)平均生長速度公式算出三株桑黃菌種的平均生長速度(如表1)，從數(shù)據(jù)中可以看出PA 7OOOl和/ 0003+1這兩株桑黃菌種的平均生長速度比/ 0003快，而0001和ph. I 0003+1的平均生長速度相差不多。表I三株桑黃菌種的生長速度
權(quán)利要求
1.一種用于桑黃菌株液體發(fā)酵的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20-30 g/L，酵母粉 2-6 g/L, KH2PO4 1-3 g/L，MgSO4 · 7H20 O. 3-0. 7 g/L, Vbi 10 mg/L，水 1L，pH自然。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于桑黃菌株液體發(fā)酵的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的配方為葡萄糖 25 g/L，酵母粉 6 g/L, KH2PO4 I g/L, MgSO4 · 7H20 O. 5 g/L, Vbi 10 mg/L,水lL，pH自然。
3.利用權(quán)利要求I或2所述的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)桑黃多糖的方法，其特征在于發(fā)酵條件溫度28-32 °C，搖速140-180 rpm，接種量20%_30 %，培養(yǎng)天數(shù)9-11 d;離心，收集發(fā)酵液，用蒸餾水洗滌沉淀，獲得菌絲體；然后進(jìn)行胞內(nèi)、胞外多糖提取。
4.根據(jù)權(quán)利要3所述的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)桑黃多糖的方法，其特征在于所述胞內(nèi)多糖的提取將烘干后的菌絲體研磨粉碎，過40目篩后，稱取I g菌絲體粉，加入10-30 ml蒸餾水，80-100°C熱水浸提O. 5-3h，抽濾，濃縮至原體積的1/5，然后加3倍體積的無水乙醇，4°C靜置12 h，10000 rpm，4°C離心10 min，收集沉淀，干燥；得到的胞內(nèi)粗多糖溶于水用苯酚硫酸法測多糖含量。
5.根據(jù)權(quán)利要3所述的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)桑黃多糖的方法，其特征在于所述胞外多糖的提取將發(fā)酵液濃縮至原體積的1/5，然后加3倍體積的無水乙醇，4°C靜置12 h，10000rpm,4°C離心10 min,收集沉淀,干燥；得到的胞外粗多糖溶于水用苯酹硫酸法測多糖含量。
6.根據(jù)權(quán)利要3所述的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)桑黃多糖的方法，其特征在于發(fā)酵條件溫度 28 °C，搖速160 rpm，接種量25 %，培養(yǎng)天數(shù)10 d。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株桑黃菌株及液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵產(chǎn)桑黃多糖的方法。所述培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20-30g/L，酵母粉2-6g/L，KH2PO41-3g/L，MgSO4·7H2O0.3-0.7g/L，VB110mg/L，水1L，pH自然。發(fā)酵條件溫度28-32℃，搖速140-180rpm，接種量20%-30%，培養(yǎng)天數(shù)9-11d；離心，收集發(fā)酵液，用蒸餾水洗滌沉淀，獲得菌絲體；然后進(jìn)行胞內(nèi)、胞外多糖提取。能顯著提高桑黃的菌絲體產(chǎn)量和胞內(nèi)、外多糖含量，而桑黃多糖的得率比用一般熱水浸提法提取的多糖高6.34%。通過動(dòng)物試驗(yàn)證明提取的桑黃多糖具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等生物活性。
文檔編號C12R1/645GK102875225SQ20121035097
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者鄭金貴, 黃緣緣, 黃志偉, 謝寶貴 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)