專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種結(jié)核/hiv抗原肽雙特異性tcr、其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核/HIV抗原肽雙特異性T細(xì)胞受體(TCR)，以及利用該TCR制備得到的一種用于結(jié)核/HIV共感染基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染得到的CD8+T細(xì)胞及其在制備抗結(jié)核/HIV共感染疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核(Tuberculosis,TB)是全球最致命的慢性感染疾病之一。近十年來(lái)，由于全球流動(dòng)人口增加，結(jié)核病防治工作受到忽視，多藥耐藥結(jié)核菌廣泛流行，免疫抑制劑大量使用，尤其是HIV與結(jié)核分枝桿菌并發(fā)感染，致使結(jié)核病重新蔓延，全球疫情再度惡化。結(jié)核潛伏感染者一旦感染HIV，機(jī)體免疫系統(tǒng)會(huì)被加速破壞，減弱甚至喪失對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抑制效應(yīng)，患者更容易發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核；同時(shí)，結(jié)核分枝桿菌通過(guò)刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量分泌單核細(xì)胞趨化蛋白-I(MCP-I)促進(jìn)HIV的轉(zhuǎn)錄，加速病毒增殖，促使病情惡化。2010年全球新增結(jié)核病人880萬(wàn)，其中110萬(wàn)共感染HIV;全球結(jié)核死亡人數(shù)140萬(wàn)，其中1/4為合并感染HIV致死。目前，TB/HIV雙重感染者的治療主要是抗TB與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的結(jié)合，其療程長(zhǎng)，多種藥物相互作用，藥物重疊的毒副作用大，易產(chǎn)生耐藥性，病人服藥依從性差，對(duì)這兩種疾病同時(shí)有效的藥物稀缺，整合抗TB與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療存在時(shí)間和藥物選擇的巨大挑戰(zhàn)，以及出現(xiàn)免疫重建炎癥綜合癥等問(wèn)題。因此，亟需開(kāi)發(fā)針對(duì)TB/HIV共感染行之有效的治療方法?？筎B與抗HIV感染的免疫機(jī)制都是以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫為主。已有大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，抗原特異性⑶8+T細(xì)胞在控制TB和HIV感染中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。效應(yīng)CD8+T細(xì)胞通過(guò)以下三種途徑來(lái)發(fā)揮作用1)發(fā)揮細(xì)胞毒作用，通過(guò)穿孔素和顆粒酶B(granzymeB)途徑直接殺傷感染靶細(xì)胞；2)釋放Thl型細(xì)胞因子，如干擾素-Y(interferon-Y,IFN-Y)、腫瘤壞死因子-a(tumornecrosisfactor-α,TNF-α),抑制病原體復(fù)制，促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)病原體；3)介導(dǎo)Fas/FasL殺傷機(jī)制，直接殺傷靶細(xì)胞。而在TB/HIV共感染者體內(nèi)，效應(yīng)⑶8+CTL數(shù)量和反應(yīng)水平均很低。因此，通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移大量效應(yīng)⑶8+T細(xì)胞至TB/HIV共感染者體內(nèi)，可增強(qiáng)其抗TB/HIV感染的能力。過(guò)繼細(xì)胞免疫治療已在抗TB和HIV感染中顯示了巨大潛力。利用滅活的結(jié)核菌體外致敏PBL，將其回輸給多藥耐藥肺結(jié)核患者，取得良好療效。將患者自體HIV特異性CD8+CTL過(guò)繼回輸治療6例HIV感染者，最初2周所有患者⑶4計(jì)數(shù)增加，5名患者血漿病毒血癥減少。24周后，2名患者的HIV病毒負(fù)載繼續(xù)減少，另I名患者⑶4計(jì)數(shù)增加超過(guò)2倍。盡管過(guò)繼細(xì)胞免疫治療展現(xiàn)出光明的前景，但這種方法的普遍應(yīng)用卻存在許多障礙。我們很難從處于疾病進(jìn)展期的患者體內(nèi)分離出效應(yīng)T細(xì)胞，因?yàn)榇藭r(shí)CTL反應(yīng)是不斷消耗的，接受長(zhǎng)期治療的個(gè)體也是如此，因?yàn)殡S著病原體負(fù)載減少，針對(duì)病原體的CTL反應(yīng)也減少。另夕卜，從患者體內(nèi)分離出的T細(xì)胞往往是已最終分化的，很難擴(kuò)增。即使可以擴(kuò)增，回輸患者體內(nèi)后其存活時(shí)間也很短。而通過(guò)抗原特異T細(xì)胞受體基因修飾初始T細(xì)胞，人為賦予普通T細(xì)胞識(shí)別特異抗原的能力，短期內(nèi)獲得大量效應(yīng)T細(xì)胞，則可有效解決這一問(wèn)題。T細(xì)胞抗原受體(Tcellreceptor,TCR)是所有T細(xì)胞表面的特征性標(biāo)志，在T細(xì)胞抗原識(shí)別中起關(guān)鍵作用。TCR是由α、β兩條肽鏈構(gòu)成的異二聚體，每條肽鏈又可分為可變區(qū)(V區(qū))，恒定區(qū)(C區(qū))，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)等幾部分；其胞質(zhì)區(qū)很短，信號(hào)傳遞主要通過(guò)與其以非共價(jià)鍵結(jié)合的CD3分子進(jìn)行。TCR分子屬于免疫球蛋白超家族，其抗原特異性存在于V區(qū)；V區(qū)(Va、νβ)又各有三個(gè)高變區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3，其中以⑶R3變異最大，直接決定了TCR的抗原結(jié)合特異性。在TCR識(shí)別MHC-抗原肽復(fù)合體時(shí)，⑶R1XDR2識(shí)別和結(jié)合MHC分子抗原結(jié)合槽的側(cè)壁，而CDR3直接與抗原肽相結(jié)合。根據(jù)TCRνα、νβ基因的同源性，可將80多個(gè)TCRVa基因分為32個(gè)家族、60多個(gè)TCRνβ基因分為24個(gè)家族。利用每個(gè)T細(xì)胞克隆均有其獨(dú)特CDR3序列的特點(diǎn)，采用CDR3譜型分析技術(shù)，可測(cè)定各TCR家族各CDR3出現(xiàn)的頻率，由此反映T細(xì)胞的克隆性。未接受抗原刺激的T細(xì)胞中，針對(duì)各種抗原的T細(xì)胞克隆分布均勻，表現(xiàn)為多家族和多克隆性，具體地，表現(xiàn)為各家族均出現(xiàn)呈高斯分布的約8個(gè)CDR3峰；抗原刺激則引起識(shí)別該抗原的某一個(gè)或幾個(gè)特異TCR家族T細(xì)胞反應(yīng)性增生，表現(xiàn)為該家族CDR3成員出現(xiàn)少于4個(gè)峰的寡克隆或單克隆分布，其中具有單克隆CDR3分布(表現(xiàn)為單峰)的TCR家族即是抗原特異單克隆增生的TCR家族。對(duì)該家族PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，可獲得抗原特異TCRCDR3序列。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于篩選出結(jié)核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Eiw12ch128(KLTPLCVTL)雙特異的TCR，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將其轉(zhuǎn)染到CD8+T細(xì)胞中，獲得表達(dá)結(jié)核肽Ag85B199_207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120^128(KLTPLCVTL)雙特異TCR的CD8+T細(xì)胞，以及該經(jīng)過(guò)TCR基因修飾的CD8+T細(xì)胞在制備抗結(jié)核/HIV共感染疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種結(jié)核/HIV抗原肽雙特異性T細(xì)胞受體(TCR)，包括α鏈和β鏈，其中，α鏈的⑶R3區(qū)含有SEQIDNO:3所述的序列；β鏈的⑶R3區(qū)含有SEQIDNO:4所示的序列。所述TCR的α鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:10所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:6所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。優(yōu)選的，所述TCR的α鏈氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β鏈氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。編碼上述結(jié)核/HIV抗原肽雙特異性TCR的基因。一種結(jié)核/HIV抗原肽雙特異性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有編碼結(jié)核/HIV抗原肽雙特異性TCR的基因。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的出發(fā)載體為pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。上述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)包裝后得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒。上述逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞。結(jié)核/HIV抗原肽雙特異性TCR、編碼該TCR的基因，含有該基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、該逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞在制備抗結(jié)核病、艾滋、艾滋/結(jié)核共感染疾病藥物中的應(yīng)用。具體步驟流程如下I、篩選出結(jié)核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)雙特異的TCR①淋巴細(xì)胞分離液分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)；②貼壁法獲取樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)，IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)DC成熟；③磁珠分選出⑶8+T細(xì)胞；④結(jié)核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)分別負(fù)載DCs對(duì)⑶8+T細(xì)胞進(jìn)行三輪刺激，誘導(dǎo)抗原特異⑶8+T細(xì)胞發(fā)生克隆擴(kuò)增；⑤提?、?+T細(xì)胞mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；⑥利用基因掃描(GeneScan)監(jiān)測(cè)刺激前后CDR3譜型變化，找出刺激后單克隆擴(kuò)增的抗原特異的⑶8+T細(xì)胞TCR基因家族。2、構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體①根據(jù)GeneBank報(bào)道的人α、β基因家族可變區(qū)(variableregion,V)和恒定區(qū)(constantregion,C)基因序列，設(shè)計(jì)α、β鏈基因全長(zhǎng)序列引物,擴(kuò)增特異性TCRα、β全長(zhǎng)基因；②采用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的最小鼠源化C區(qū)(minimummurinizedCregion,簡(jiǎn)稱(chēng)為mC。包括mCa和mCβ，其中共9個(gè)氨基酸被鼠C區(qū)相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸替換)分別替換α、β全長(zhǎng)基因C區(qū)(參照文獻(xiàn)Luoff,ZhangXB,HuangYT,HaoPP,JiangZM,WenQjZhouMQjJinQjMaLDevelopmentofgeneticallyengineeredCD4+andCD8+T-cellsexpressingTCRsspecificfora38kDaM.tuberculosisantigen.JMolMed.2011,89(9):903-13)。鼠源化突變的目的在于減少內(nèi)外源性TCRα、β基因的錯(cuò)配，因?yàn)棰?+T細(xì)胞存在內(nèi)源性TCRα、β基因的表達(dá)，通過(guò)突變可以促使外源性α與β基因表達(dá)的蛋白正確裝配成TCR蛋白分子并穩(wěn)定表達(dá)在CD8+T細(xì)胞表面，同時(shí)利于其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合CD8+T細(xì)胞表面的CD3分子，增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)功能，提高修飾后CD8+T細(xì)胞的抗結(jié)核活性。當(dāng)然，此處還可以釆取其他策略來(lái)減少內(nèi)外源性TCRα、β基因的錯(cuò)配，如以CD3(鏈替換α、β全長(zhǎng)基因部分C區(qū)(Sebestyen，Z.etaL(2008)HumanTCRthatincorporateCD3{zeta}inducehighlypreferredpairingbetweenTCR{alpha}and{beta}chainsfollowinggenetransfer.J.Immunol.180，7736-7746);在外源性α、β基因C區(qū)引入二硫鍵(Boulter，J.M.etaL(2003)Stable,solubleT-cellreceptormoleculesforcrystallizationandtherapeutics.ProteinEng.16，707-711);突變夕卜源性α、β基因C區(qū)關(guān)鍵氨基酸以改變?chǔ)?、β鏈之間的靜電荷(Voss，R.H.etaL(2008)MoleculardesignoftheCabinterfacefavorsspecificpairingofintroducedTCRabinhumanTcells.J.Immunol.180，391-401);將外源性ct、β基因V區(qū)合并為一條單鏈TCR并與CD3ζ鏈融合(Willemsen，R.A.etaL(2000)GraftingprimaryhumanTlymphocyteswithcancer-specificchimericsinglechainandtwochainTCR.GeneThen7，1369-1377);利用2A連接外源性α、β基因?qū)崿F(xiàn)平衡表達(dá)(LeisegangMjEngelsB，MeyerhuberP，KiebackEjSommermeyerDjXueSAjReussS，StaussH，UckertW.EnhancedfunctionalityofTcellreceptor-redirectedTcellsisdefinedbythetransgenecassette.JMolMed.2008，86:573-583.)等。③利用重組PCR技術(shù)，將已經(jīng)最小突變TCRα、β基因通過(guò)自剪切多肽2Α連接，并克隆至pGEM-T載體測(cè)序鑒定。④將測(cè)序正確的α、β全長(zhǎng)基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-IRES-GFP，酶切鑒定；⑤采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒，低溫差速離心法濃縮病毒；⑥重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染NIH-3T3細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定病毒感染NIH3T3細(xì)胞GFP的表達(dá)量，計(jì)算重組逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度。計(jì)算公式病毒感染滴度(IU/ml)=NIH3T3細(xì)胞總數(shù)XGFP陽(yáng)性率/病毒濃縮液量(ml)。3、鑒定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的⑶8+T細(xì)胞的抗結(jié)核和抗HIV活性①采用Ficoll密度梯度離心法，分離HLA-A*0201型健康志愿者外周血PBMC；②磁珠分選CD8+T細(xì)胞；③IL-2和抗-⑶3單抗活化分選出的⑶8+T細(xì)胞；④按感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection,MOI)=13將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒ρΜΧ-β15-2Α-a17-IRES-GFP感染CD8+T細(xì)胞；⑤使用IL-2和抗⑶3單抗刺激感染后的⑶8+T細(xì)胞；⑥流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病毒感染后陽(yáng)性細(xì)胞的百分比；⑦測(cè)定病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞的抗TB活性實(shí)驗(yàn)設(shè)置以下8組①TCR基因修飾⑶8+T細(xì)胞+不負(fù)載抗原肽的DC;②未轉(zhuǎn)染CD8.T細(xì)胞+負(fù)載Ag85B199_207的DC;③未轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Eiw12ch128的DC;④空載體轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Ag85B199_2Q7的DC;⑤空載體轉(zhuǎn)染CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Eiw12ch128的DC;⑥TCR基因修飾⑶8+T細(xì)胞+負(fù)載CMVpp65495_503的DC;⑦TCR基因修飾⑶8+T細(xì)胞+負(fù)載Ag85B199_207的DC;⑧TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞+負(fù)載Eiw12ch128的DC。用酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-1inkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測(cè)上述各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-Y、TNF-α的分泌水平；用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(time-resolvedfluoroimmuno-assay,TRFIA)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞對(duì)分別負(fù)載結(jié)核妝Ag85B199_207(KLVANNTRL)和HIV肽Env12Q_128(KLTPLCVTL)的DC的殺傷活性。其中，CD8+T細(xì)胞是人體內(nèi)的一種細(xì)胞亞群，可由人外周血中分離獲得，并進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，分離和培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，技術(shù)成熟。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是由某種逆轉(zhuǎn)錄病毒序列構(gòu)建的基因運(yùn)載工具，能夠攜帶外源基因或DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，并整合到染色體基因組上，目前已成為商業(yè)化產(chǎn)品，容易購(gòu)買(mǎi)和獲得。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建方法為本領(lǐng)域常用的分子克隆技術(shù)，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染方法是目前常用的生物技術(shù)手段，除本發(fā)明中使用的磷酸鈣法外，還可以使用其它化學(xué)轉(zhuǎn)染法，包括=DEAE-葡聚糖法、人工脂質(zhì)體法；以及物理方法，包括顯微注射、電穿孔、基因槍等。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明成功篩選出結(jié)核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)雙特異的TCR，攜帶該TCR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞可成功表達(dá)外源性TCR基因，特異性識(shí)別結(jié)核肽Ag85B199_2(l7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)并介導(dǎo)IFN-Y,TNF-α細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒活性，這種雙特異性使得即使其中一種病原體發(fā)生突變產(chǎn)生免疫逃逸時(shí)，仍可對(duì)另一種病原體產(chǎn)生反應(yīng)。該方法制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有結(jié)核/HIV共感染疾病基因治療的應(yīng)用價(jià)值，可為結(jié)核/HIV共感染的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療開(kāi)辟新徑。圖I結(jié)核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)刺激前后⑶8+T細(xì)胞TCRα和β鏈⑶R3譜型分析；圖2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVα17mCα-IRES-GFP構(gòu)建示意圖；圖3pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVa17mCa-IRES-GFP的酶切鑒定(M.DL15000marker；1.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVa17mCa-IRES-GFP；2.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVa17mCa-IRES-GFP的BamHI酶切產(chǎn)物；3.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVα17mCa-IRES-GFP的BamHI+XhoI雙酶切產(chǎn)物);圖4熒光顯微鏡觀察重組病毒轉(zhuǎn)染后ΝΙΗ3Τ3細(xì)胞GFP的表達(dá)(X10。a.明場(chǎng)；b.熒光；c.置加圖)；圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組病毒轉(zhuǎn)染后NIH3T3細(xì)胞GFP的表達(dá)(a.未轉(zhuǎn)染；b.pMX-IRES-GFP；c.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVα17mCα-IRES-GFP)；圖6熒光顯微鏡觀察重組病毒轉(zhuǎn)染后⑶8+T細(xì)胞GFP的表達(dá)(Χ20α.pMX-IRES-GFP；b.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVα17mCα-IRES-GFP)；圖7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)⑶8+T細(xì)胞的GFP表達(dá)陽(yáng)性率(a.未轉(zhuǎn)染；b.pMX-IRES-GFP；c.pMX-hVβ15mCβ_P2A_hVα17mCα-IRES-GFP)；圖8ELISA檢測(cè)⑶8+T細(xì)胞IFN-Y的分泌水平；圖9ELISA檢測(cè)⑶8+T細(xì)胞TNF-α的分泌水平；圖10ELISA檢測(cè)⑶8+T細(xì)胞GrB的分泌水平；圖11TRFIA檢測(cè)CD8+T細(xì)胞的殺傷活性。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件操作，例如Sambrook等編著的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(SambrookJ,RussellDW,JanssenK,ArgentineJ.黃培堂等譯，2002，北京科學(xué)出版社)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。以下實(shí)施例中，所有計(jì)量資料結(jié)果用土s表示，采用單因素方差分析(One-Way八勵(lì)￥4)比較各組間細(xì)胞因子正^￥、了即-0分泌水平的差異，方差不齊時(shí)用Welch校正，采用LSD法進(jìn)行各組間兩兩比較，方差不齊時(shí)采用Dunnett’sT3法校正。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。采用SPSS17.Oforwindows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)施例I.篩選結(jié)核肽Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)雙特異的TCRI.I密度梯度離心法分離純化PBMC(1)在15ml刻度無(wú)菌離心管加入適量Ficoll淋巴細(xì)胞分離液；(2)取肝素抗凝的外周靜脈血與等量RPMI1640液充分混勻稀釋?zhuān)冒退沟碌喂芪?倍體積的抗凝血沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液上，注意保持界面完整。If20°C，1800"2000rpm/min水平離心2030min；(3)離心后管內(nèi)液體分為四層，上層為血漿和稀釋液，管底主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞層。中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的灰白色云霧層；(4)用吸管插到灰白色層，吸取單個(gè)核細(xì)胞，置于另一離心管內(nèi)，加入5倍以上體積的RPMI1640液，1820°C，1500rpm/min離心lOmin，洗滌細(xì)胞兩次去除大部分混雜的血小板后為PBMC；(5)細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活力檢測(cè)PBMC懸液與1/10體積的O.4%臺(tái)酚藍(lán)染液混合，于血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)板上角上四個(gè)大方格總細(xì)胞數(shù)，總細(xì)胞數(shù)的四分之一數(shù)乘以IO4即為每毫升濃度；死細(xì)胞可著色臺(tái)盼藍(lán)，活的不著色，計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞百分率[活細(xì)胞率％=(活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))X100%]。1.2制備Ag85B199_2Q7(KLVANNTRL)和HIV肽Env12(l_128(KLTPLCVTL)雙特異T細(xì)胞克隆(1)計(jì)數(shù)PBMC,調(diào)整PBMC數(shù)目為IXIO6/孔，分別加入含結(jié)核肽Ag85B199_207(KLVANNTRL)、HIV肽Env12(l_12850ng/ml的10%FBS-1640培養(yǎng)基2ml；(2)37。C、5%CO2條件下培養(yǎng)2h后，加入IL-225U/ml；(3)第3天補(bǔ)加IL-2至50U/ml，第5天加入IL-2100U/ml，之后以此濃度繼續(xù)培養(yǎng)11天。I.3免疫磁珠(德國(guó)美天旎生物公司)分選⑶8+T細(xì)胞。I.4總RNA提取試劑盒(OMEGA)提取上述收集到的細(xì)胞沉淀的總RNA。I.5逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒(Fermentas)合成cDNA。I.6PCR擴(kuò)增34個(gè)TCRVa基因家族CDR3片段利用34個(gè)TCRVa家族特異性上游引物和共用下游Cα外、內(nèi)側(cè)引物(參照文獻(xiàn)XIN-SHENG等，2006,AnalysisoftheCDR3regionofalpha/betaT-cellreceptors(TCRs)andTCRBDgenedouble-strandedrecombinationsignalsequencebreaksendinperipheralbloodmononuclearcellsofT-Iineageacutelymphoblasticleukemia.Clinical&LaboratoryHaematology.Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.doi:10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x)做半巢式PCR:第一輪PCR:每樣本做34個(gè)PCR反應(yīng)管，第I34管分別加入TCRVαI至Vα34家族上游引物，每管加下游共用Ca外側(cè)引物IμI,各引物濃度均為10μΜ。每PCR反應(yīng)管體積為25μ1，含cDNA模板I.0μ1，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性3min;95°C30s,60°C30s，72。Clmin，35個(gè)循環(huán)；72。C延伸lOmin。第二輪PCR:反應(yīng)總體積為25μ1，含第一輪PCR產(chǎn)物2μl，10mmol/LdNTPO.5μI,10XBuffer2·5μI，25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U,TCRVα34個(gè)家族上游引物1μ1，下游FAM標(biāo)記內(nèi)側(cè)Ca引物Iμ1，各引物濃度均為10μM。PCR反應(yīng)條件95。C2min；60°C2min，72。C10min，4個(gè)循環(huán)。I.7PCR擴(kuò)增24個(gè)TCRνβ基因家族CDR3片段(參照文獻(xiàn)XIN_SHENG等，2006，Clinical&LaboratoryHaematology,28:405-415.doi:10.1111/j.1365-2257.2006.00827.x)每樣本做24個(gè)PCR反應(yīng)管，每管加入TCRCβ-FAM下游引物0.8μ1，第I至第24管分別加入TCRVM至TCRVβ24上游引物0.8μ1，各引物濃度均為10μM。PCR反應(yīng)體積為25μ1，含cDNA模板Iμ1，10mmol/LdNTP0.5μI,IOXBuffer2.5μl,25mmol/LMgCl2I.5μI,TaqDNA聚合酶O.625U1CR反應(yīng)條件94°C變性3min;94°Clmin，55°Clmin,72。Clmin，35個(gè)循環(huán)；72。C延伸lOmin。1.8瓊脂糖凝膠電泳取34個(gè)TCRVa和24個(gè)TCRνβ基因家族PCR產(chǎn)物各8μ1，2%瓊脂糖凝膠電泳，100V，20min,采用凝膠成像系統(tǒng)照相。剩余PCR產(chǎn)物-20°C保存?zhèn)溆?。I.9CDR3譜型分析取34個(gè)Va、24個(gè)νβ基因家族FAM熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物2μ1，在373DNA序列分析儀(ABI,PerkinElmer)上進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,收集電泳過(guò)程中不同時(shí)間出現(xiàn)的不同強(qiáng)度的熒光信號(hào)，GeneScan672軟件自動(dòng)分析收集的數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)換為不同位置、高度和形態(tài)的峰，代表各TCR家族CDR3成員出現(xiàn)的頻率，由此反映各TCR家族的克隆性。其中，具有單峰分布的TCR家族即是抗原特異性單克隆增生的TCR家族。CDR3譜型分析結(jié)果顯示，結(jié)核肽Ag85B199_2(l7(KLVANNTRL)或HIV肽Eiw12ch128(KLTPLCVTL)刺激CD8+T細(xì)胞后，部分TCR基因家族譜型發(fā)生改變，由原來(lái)的8個(gè)或多于8個(gè)峰型的高斯分布變?yōu)樯儆?個(gè)峰的單寡峰分布，表明這些家族是由于Ag85B199_2(l7或Env120^128持續(xù)刺激引起的寡克隆或單克隆增生。比較刺激前后CDR3譜型的變化，找出兩種肽刺激前為多克隆，刺激后均呈單克隆擴(kuò)增的Va17、Vβ15基因家族(見(jiàn)圖I)。測(cè)序結(jié)果顯示，TCRα17、β15基因⑶R3區(qū)的核苷酸序列分別如SEQIDNO:I和SEQIDNO:2所示，這兩條CDR3序列編碼的氨基酸序列分別如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。2.構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖2)2.I合成引物依據(jù)GeneBank報(bào)道的Va17、Vβ15基因家族V區(qū)序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)基因上、下游引物，依據(jù)9個(gè)關(guān)鍵氨基酸突變后的C區(qū)序列(即mCa與mCi3)分別設(shè)計(jì)上、下游引物，依據(jù)P2A肽連接序列設(shè)計(jì)引物,全部引物由Invitrogen上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物名稱(chēng)和序列(5，to3’)如下權(quán)利要求1.一種結(jié)核/Hiv抗原肽雙特異性T細(xì)胞受體(TCR)，包括α鏈和β鏈，其中，α鏈的⑶R3區(qū)含有SEQIDNO:3所述的序列；β鏈的⑶R3區(qū)含有SEQIDNO:4所示的序列。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的結(jié)核/HIV抗原肽雙特異性TCR，其特征在于，所述TCR的α鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:10所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性β鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列；β鏈?zhǔn)怯蒘EQIDNO:6所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或末端修飾后所得到的能特異與外源性α鏈裝配成TCR蛋白分子的氨基酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)核/HIV抗原肽雙特異性TCR，其特征在于，所述α鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:12所示，β鏈的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。4.編碼權(quán)利要求f3任一項(xiàng)所述TCR的基因。5.一種結(jié)核/HIV抗原肽雙特異性TCR的融合基因，其序列如SEQIDNO:13所示。6.一種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有權(quán)利要求4或5所述的基因。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其特征在于，出發(fā)載體包括pMX-IRES-GFP、pMCs-IRES-GFP或pMYx-IRES-GFP。8.權(quán)利要求6或7所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)包裝后得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒。9.權(quán)利要求8或9所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞。10.權(quán)利要求Γ3任一項(xiàng)所述的結(jié)核/HIV抗原肽雙特異性TCR、權(quán)利要求4或5所述的基因，權(quán)利要求6或7所述的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、權(quán)利要求8或9所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒、權(quán)利要求10所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的CD8+T細(xì)胞在制備抗結(jié)核病、艾滋、艾滋/結(jié)核共感染疾病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種結(jié)核/HIV抗原肽雙特異性TCR、其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與應(yīng)用。本發(fā)明篩選出結(jié)核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)雙特異的TCR，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將其轉(zhuǎn)染到CD8+T細(xì)胞中，獲得表達(dá)結(jié)核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)雙特異TCR的CD8+T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞可成功表達(dá)外源性TCR基因，特異性識(shí)別結(jié)核肽Ag85B199-207(KLVANNTRL)和HIV肽Env120-128(KLTPLCVTL)并介導(dǎo)IFN-γ、TNF-α、GrB細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒活性，這種雙特異性使得即使其中一種病原體發(fā)生突變產(chǎn)生免疫逃逸時(shí)，仍可對(duì)另一種病原體產(chǎn)生反應(yīng)。該方法制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有結(jié)核/HIV共感染疾病基因治療的應(yīng)用價(jià)值，可為結(jié)核/HIV共感染的過(guò)繼細(xì)胞免疫治療開(kāi)辟新徑。文檔編號(hào)C12N5/10GK102911267SQ20121035067公開(kāi)日2013年2月6日申請(qǐng)日期2012年9月19日優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日發(fā)明者馬驪,周超穎,溫茜,羅微申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)