專利名稱：一種木聚糖酶基因及表達(dá)蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種木聚糖酶基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
半纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分，是除纖維素之外自然界中最為豐富的可再生資源。半纖維素一般由木聚糖即以P-D-1，4木糖苷鍵連接起來的一種多聚五碳糖為主鏈，并帶有多種取代基，如阿拉伯糖基，a-葡萄糖醛酸基等。木聚糖徹底降解則得到木糖、阿魏糖、阿拉伯糖等，其中以木糖為主。木聚糖酶是木聚糖降解酶系中的最為關(guān)鍵的多糖水解酶，通過隨機(jī)切割木聚糖的P -I, 4-糖苷鍵，將木聚糖水解為木寡糖、低聚木糖及少量的木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶在造紙紙漿、釀造及飼料エ業(yè)等方面已體現(xiàn)顯著的應(yīng)用價(jià)值，因此可作為ー種高效的エ業(yè)酶制劑應(yīng)用于上述幾個(gè)方面。耐熱纖維水解酶包括木聚糖酶及葡聚糖酶的開發(fā)利用是當(dāng)今纖維類生物質(zhì)精煉技術(shù)領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供ー種木聚糖酶基因。本發(fā)明的另一目的是提供ー種上述木聚糖酶基因表達(dá)的適合中溫下半纖維素水解的木聚糖酶。本發(fā)明還有一目的是提供上述一種木聚糖酶的應(yīng)用。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
ー種木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ NO :1所示。ー種木聚糖酶基因的表達(dá)蛋白，為適合中溫下半纖維素水解的木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2所示。ー種木聚糖酶基因的表達(dá)蛋白，氨基酸序列為SEQ NO :2序列中的氨基酸經(jīng)過ー個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質(zhì)。ー種重組載體，在所述的重組載體上克隆有如SEQ NO I所示的DNA序列。ー種重組菌，在所述的重組菌內(nèi)克隆有如SEQ NO 1所示的DNA序列。一種用于擴(kuò)增木聚糖酶基因的引物，所使用的引物對(duì)為
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGGACCACAGCCCATGTCGTC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTGGAAACTGATTCTATTACACTC-3’。上述的木聚糖酶在酶解木聚糖中的應(yīng)用。酶解反應(yīng)溫度為60-80°C，PH5. 5-6. 5。所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括棒木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。
上述的重組載體或重組菌在酶解木聚糖中的應(yīng)用。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的木聚糖酶具有較好的的耐熱性能和略偏酸性PH條件下高活性的特性。在80°C、pH為6. 0的條件下酶活性最高，比酶活達(dá)到35 U/mg;該蛋白酶在溫度為60°C-80°C、pH為5. 5-65的范圍內(nèi)，均具有較高的酶活。該木聚糖酶的耐熱性能較高，在65°C，pH6.0的反應(yīng)體系中，保溫2h酶活性基本保持不變。上述特性使得本發(fā)明得到的木聚糖酶比現(xiàn)有木聚糖酶具有更大的優(yōu)越性，適用于65°C以上高溫、略偏酸性PH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。


圖I 是 Tth xynlOB 蛋白的 SDS-PAGE 圖2是Tth xynlOB蛋白的最適溫度結(jié)果 圖3是Tth xynlOB蛋白的最適pH結(jié)果 圖4是Tth xynlOB蛋白的熱穩(wěn)定性結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。以下實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例I嗜熱陸地?zé)崛邷厣衽劬蚪MDNA的提取
采用嗜熱陸地?zé)崛邷厣衽劬鶷hermo toga thermarum DSM5069 (購自德國微生物菌種保藏中心)新鮮菌體10g，懸于5mL 50mM Tris緩沖溶液中(pH8. O),混勻后在37°C放置20min，然后加入2mL 10%SDS, 55°C放置5min，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清液加入2倍體積的無水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000rpm離心20min，收集沉淀。沉淀溶于 0. 5mL TE 緩沖液(ρΗ8· O, IOmM Tris, ImM EDTA)，加入 10mg/mL RNase 3 μ L, 37°C保溫I h，用等體積的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清加入2倍體積的無水乙醇，于-20°C放置30min，4°C 13000rpm離心20min，收集沉淀，真空冷凍干燥，用0. 5mL超純水溶解。實(shí)施例2木聚糖酶基因Tth xynlOB的制備
可采用如下方法制備Tth 似基因，也可以采用人工合成的方式得到。認(rèn)Thermotoga thermarum DSM5069的總DNA (實(shí)施例I制備)為模版，用下述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增
Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGGACCACAGCCCATGTCGTC-3’ ；
Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTGGAAACTGATTCTATTACACTC-3’ ；
引物合成時(shí)，Tth-I引入Nde I酶切位點(diǎn)，Tth-2引入Xho I酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系如下1 μ L T. iAerfflara 基因組DNA, I μ L Tth-I, I μ L Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超純水。PCR 反應(yīng)條件94°C變性 5min ;94°C變性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 3min，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保溫。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)量和特異，并用PCR產(chǎn)物回收試劑盒進(jìn)行純化(BI0MIGA，上海)。實(shí)施例3重組克隆、表達(dá)載體pET-20b-7iA xynlOB的構(gòu)建與驗(yàn)證
將純化過的PCR產(chǎn)物(實(shí)施例2制備)、pET-20b (Novagen)用分別Nde I和Xho I雙酶切，瓊脂糖電泳回收酶切酶切PCR及載體大片段。割膠回收后的目的片段與載體，經(jīng)濃縮加入8yL無菌水重懸，加入8yL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C連接過夜。用連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨芐青霉素)的培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng) 10-12 ho
從轉(zhuǎn)化平板上挑取多個(gè)單菌落，采用BI0MIGA的質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒。對(duì)獲得的質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證并對(duì)獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，pET-20b載體中插入了克隆的目的片段(表達(dá)木聚糖酶Tth xynlOB的目的片段，1032bp)，進(jìn)而得到重組克隆、表達(dá)載體pET-20b-7從xynlOB, Tth xynlOB的核苷酸如SEQ NO 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ NO 2所示，將該蛋白命名為Tth xynlOB。實(shí)施例4重組木聚糖酶Tth xynlOB的表達(dá)與純化
將重組克隆、表達(dá)載體pET-20b-7從xynlOB (實(shí)施例3制備)電轉(zhuǎn)至宿主菌^: coliBL21(DE3) (Novagen)，獲得含有重組質(zhì)粒的重組菌。將單菌落的重組菌接種于5 mL含有100 ii g/ml氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培養(yǎng)基,在37°C溫度下,200 rpm震蕩培養(yǎng)8-12 h。將上述4mL菌液接種于含400mL培養(yǎng)基的IOOOmL搖瓶中，37°C溫度下，200rpm震蕩培養(yǎng)，當(dāng)吸光度達(dá)到0. 6-0. 8時(shí)，加人200 ii L的IM IPTG，并在30°C溫度下，120rpm誘導(dǎo)表達(dá)10-12h。用高速冷凍離心機(jī)將培養(yǎng)液在4°C下以13000rpm離心15min，收集菌體。用50mL超純水洗漆并在4°C下以13000rpm離心15min,回收菌體,接著用20mL I XBindingBuffer 重懸(0.5M NaCl, 20mM Tris_HCl，5mM imidazole，pH7. 9)，在冰水浴中，用超聲波 破碎機(jī)破碎細(xì)菌細(xì)胞，并在4°C下13000rpm離心15min，得到含木聚糖酶Tth xynlOB的粗提液。粗提液先經(jīng)60°C加熱處理30min的熱處理，除去不耐熱的雜蛋白，再用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化(方法見His-Bind Kits,Novagen)。純化酶純度的鑒定和分子量的測定采用SDS-PAGE方法進(jìn)行，結(jié)果見圖1，I即表示純化過后的Tth xynlOB蛋白，分子量約為40kDa,與理論值相近。實(shí)施例5重組木聚糖酶Tth xynlOB的酶學(xué)性質(zhì)分析
酶活定義為lmin內(nèi)催化櫸木木聚糖(sigma)產(chǎn)生Iiimol木糖所需的酶量。( I)最適溫度
用PH值為6. 0的0. IM咪唑-鄰笨ニ甲酸氫鉀緩沖液稀釋實(shí)施4中的純酶液，用稀釋后的酶液進(jìn)行酶活測定。酶活測定反應(yīng)體系為200 ii L，由1%櫸木木聚糖100 uL,90uL 0. IM咪唑-鄰笨ニ甲酸氫鉀緩沖液和10 y L稀釋酶液組成；反應(yīng)體系的pH為6. O。將反應(yīng)體系在60-95°C溫育IOmin后，加入300 u L DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5min后測定550nm的吸光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值作圖，結(jié)果如圖2所示，研究結(jié)果表明在80°C時(shí)，木聚糖具有最高的酶活性，為35U/mg ;將此溫度下的酶活反應(yīng)體系的吸光值最為相對(duì)活性100%，其它溫度下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值作為相對(duì)活性。其中，在溫度60-80°C的反應(yīng)體系中酶活性較高。(2)最適 pH
酶活性測定體系為200 ii L，由1%櫸木木聚糖IOOii L，pH4. 0-8. 5的90 y L 0. IM咪唑-鄰笨ニ甲酸氫鉀緩沖液和IOyL稀釋酶液組成。將反應(yīng)體系在95°C溫育IOmin后，カロA 300 u L DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴5min后測定550nm的吸光值.實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值，結(jié)果如圖3所示，研究結(jié)果表明，在pH為6. 0時(shí)，木聚糖酶具有最高的酶活性，為35U/mg ;將此pH值下的酶活反應(yīng)體系的作為相對(duì)活性100%，其它pH值下酶活反應(yīng)體系的吸光值與此最高酶活性體系的吸光值的比值作為相對(duì)活性。在PH5. 5-6. 5的條件下，酶活較聞。
(3)重組酶熱穩(wěn)定性
用PH值為6. O的O. IM咪唑-鄰笨二甲酸氫鉀緩沖液稀釋實(shí)施例4中的純酶液，用稀釋后的酶液進(jìn)行酶活測定。將稀釋酶液在60°C、65°C、7(TC、75°C和80°C和85°C水浴30 min、60 min,90 min和120 min，測定酶的殘存酶活。酶活測定反應(yīng)體系中pH為6. 0，測定溫度為80°C。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。結(jié)果如圖4所示，研究結(jié)果顯示， 65°C處理2 h，酶活保持80%以上，可見該木聚糖酶在65°C條件下熱穩(wěn)定非常好，適宜中溫降解木聚糖。
權(quán)利要求
1.一種木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ NO :1所示。
2.—種權(quán)利要求I所述木聚糖酶基因的表達(dá)蛋白，為適合中溫下半纖維素水解的木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ NO 2所示。
3.—種權(quán)利要求I所述木聚糖酶基因的表達(dá)蛋白，其特征在于氨基酸序列為權(quán)利要求2所述的SEQ NO :2序列中的氨基酸經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質(zhì)。
4.一種重組載體，其特征在于在所述的重組載體上克隆有如SEQ NO :1所示的DNA序列。
5.一種重組菌，其特征在于在所述的重組菌內(nèi)克隆有如SEQ NO 1所示的DNA序列。
6.一種用于擴(kuò)增權(quán)利要求I所述的木聚糖酶基因的引物，其特征在于所使用的引物對(duì)為Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGGACCACAGCCCATGTCGTC-3’ ；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGCTTGGAAACTGATTCTATTACACTC-3’。
7.權(quán)利要求2所述的木聚糖酶在酶解木聚糖中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于酶解反應(yīng)溫度為60-80°C，pH5.5-6. 5。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。
10.權(quán)利要求4所述的重組載體在酶解木聚糖中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種木聚糖酶基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用，木聚糖酶基因的氨基酸序列如SEQNO1所示，所表達(dá)的適合中溫下半纖維素水解的木聚糖酶，氨基酸序列如SEQNO2所示。該木聚糖酶具有較好的耐熱性能和略偏酸性pH條件下高活性的特性。在80℃、pH為6.0的條件下酶活性最高，比酶活達(dá)到35U/mg；該蛋白酶在溫度為60-80℃、pH為5.5-65的范圍內(nèi)，均具有較高的酶活。該木聚糖酶的耐熱性能較高，在65℃，pH6.0的反應(yīng)體系中，保溫2h酶活性基本保持不變。上述特性使得本發(fā)明得到的木聚糖酶比現(xiàn)有木聚糖酶具有更大的優(yōu)越性，適用于65℃以上高溫、略偏酸性pH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102864160SQ20121033374
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者王飛, 時(shí)號(hào), 李迅, 仲惠 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)