專利名稱：一種香菇l952菌種的ssr標(biāo)記指紋圖譜與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于香菇菌種的檢測領(lǐng)域，特別涉及一種香菇L952菌種的SSR標(biāo)記指紋圖
譜與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國香菇產(chǎn)量已從1983年的I. 95萬噸迅速發(fā)展到2005年的242萬噸，占全球香菇總產(chǎn)量的70%以上，改寫了世界食用菌產(chǎn)量的排行榜，并不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產(chǎn)量差距，有專家預(yù)測，由于中國香菇產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，在近10年內(nèi)其將成為世界產(chǎn)量 最高的食用菌。中國香菇以其驚人的發(fā)展速度，優(yōu)質(zhì)的品質(zhì)及低廉的成本為世界菇業(yè)人士矚目，中國香菇已風(fēng)靡世界。優(yōu)質(zhì)菌種在香菇單產(chǎn)和質(zhì)量中的貢獻(xiàn)率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產(chǎn)業(yè)中的重要地位。1999年我國簽署了《國際植物新品種保護(hù)法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種知識產(chǎn)權(quán)，同時(shí)也要加強(qiáng)保護(hù)我們國家自己的品種知識產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品種登記制度來真正保護(hù)我國的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登記奠定基礎(chǔ)。尤其日本2004年4月I日開始實(shí)行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其是香菇的出口構(gòu)成了極大的威脅。就國內(nèi)而言，香菇栽培菌種“同種異名，異種同名”的現(xiàn)象，不僅給菇農(nóng)帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香菇的快速發(fā)展；而且，隨著大規(guī)模的工廠化栽培方式的出現(xiàn)，對香菇栽培菌株質(zhì)量的要求越來越高，需要發(fā)展更為簡便、快速、準(zhǔn)確的菌株鑒定技術(shù)，以保證每批次的用種都準(zhǔn)確無誤。面對這種局勢，就需要我們進(jìn)一步加快菌種鑒定技術(shù)的研究，在香菇的研究中引進(jìn)更為有效的菌種鑒定體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種香菇L952菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該指紋圖譜與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測時(shí)間短，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的一種香菇L952菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜，該指紋圖譜由7對SSR標(biāo)記組成，是基于香菇基因組簡單重復(fù)序列片段開發(fā)SSR引物，擴(kuò)增帶型好，重復(fù)性高的SSR引物，標(biāo)記詳細(xì)信息如表I。表ISSR標(biāo)記詳細(xì)信息列表
引物名稱擴(kuò)增的重復(fù)序列正/反_引物 Tm(°°)LefpOOO I (CT)7 ACGCGTATCCTCCCCTAAGT7 OU_A AGCG ATATGG ATTTGACGC_Le_fp0002 (CGAQ6GGGCGAAACAAITTCAGGTA/60
—ATGCCATCGTAAGGAACTCG
Le fp0()03 (CT)9ATTGTGACTCGACCACCTCC/GU
—TCATAATGCATCCCGTGAGAI.e_fp0004 (AGGT)5 CCCAAAAAGGATTTCAGCAA/60
~AACCGGAGTGGTGTAAGTGC
Le_fp0005 (TAC')7tatgiaga(GGAT)6 C ATCAACCAAA(.:CAAGATTC:AA/ 60TTCCAATTTCCTCCGAGTCALefpOOOC (TCA )6CATGGGAGAGATTCGGAAAA/OU
—CGAGACCGACGACTTTGACTLe_fp0007 (CTC)6 CATTGCTCGGATCCTTCATT/60
—_TACCTCGTGCGGACTTTGAT_本發(fā)明的一種香菇L952菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的應(yīng)用，是利用香菇基因組簡單重復(fù)序列片段開發(fā)的7對SSR引物，通過對收集的25份國審香菇栽培品種的SSR引物帶型擴(kuò)增，本發(fā)明確定了 7對SSR引物在香菇L952菌種中擴(kuò)增出的等位片段的數(shù)量并編號(表2)，通過不同SSR等位片段的編號組合可有效識別L952菌種(圖2_8)。通過對照50bpDNAladder可確定各SSR引物擴(kuò)增的等位片段的相對分子量，存在L952菌種特異SSR等位片段組合的菌種，即是香菇L952菌種，該菌種的編號組合為1 (1+4)12 (1+3)21。表2SSR引物擴(kuò)增的等位片段信息匯總表

序a—,等位片段編號及其相對于
號』丨物福正反向j丨物J 50bp DNA ladder的分子量
I~Le_fp0001 ACGCGTATCCTCCCCTAAGT/' HOObp;
AAGCGATATGGATTTGACGC
2Le_fp0002 GGGCGAAACAi-VTTTCAGGTA/l—290bp:
ATGCC ATCGTA AGG A ACTCG2
4^260bp；
3Le fp0003 ATTGTGACTCGACCACCTCC/1^900bp；
TCATAATGCATCCCGTGAGA
4Le_ip0004 CCCAAAAAGGATTTCAGCAA/2—390bp;
AACCGGAGTGGTGTAAGTGC
5Le_fp0005 CATCAACCAAACCAAGATTCAA/1^720bp；
~TTCCAATTTCCTCCGAGTCA2
3^540bp；
6Le_fp0006 C1Ai CiCiCiACiACiAI IXXiCiAAAA/2-^780bp
~CGAGACCGACGACTTTGACT
7Le_Q)0007 CATTGCTCGGATCCTTCATT/1^700bp；
_TACCTCGTGCGGACTTTGAT___
_3] 有益.效果本發(fā)明與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測時(shí)間短，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。檢測所需時(shí)間只需要3 4天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間，出菇試驗(yàn)則需要至少3個(gè)月的時(shí)間；該方法在所收集的我國25個(gè)通過國審的香菇主栽菌種中具有L952菌種的專一性，具有良好的應(yīng)用前景。


圖I為香菇L952菌種SSR標(biāo)記指紋圖譜，其中M是50bp DNA ladder，數(shù)字代表的是所用的7對SSR引物，NC是空白對照，箭頭所指的是香菇L952菌種的特異性SSR等位片段組合；圖2為引物L(fēng)e_fp0001在所選國審香菇栽培材料中的擴(kuò)增圖譜；圖3為引物L(fēng)e_fp0002在所選國審香菇栽培材料中的擴(kuò)增圖譜；圖4為引物L(fēng)e_fp0003在所選國審香菇栽培材料中的擴(kuò)增圖譜；圖5為引物L(fēng)e_fp0004在所選國審香菇栽培材料中的擴(kuò)增圖譜；圖6為引物L(fēng)e_fp0005在所選國審香菇栽培材料中的擴(kuò)增圖譜； 圖7為引物L(fēng)e_fp0006在所選國審香菇栽培材料中的擴(kuò)增圖譜；圖8為引物L(fēng)e_fp0007在所選國審香菇栽培材料中的擴(kuò)增圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例I(I)菌絲培養(yǎng)將香菇菌種轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，23°C 25°C下避光搖瓶培養(yǎng)，3cT4d后收集菌絲；(2)基因組DNA的提取用CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法檢測總基因組DNA濃度和純度，調(diào)整樣品DNA的濃度一致；CTAB法提取菌絲的基因組DNA工藝包括①將液氮冷凍干燥的香菇菌絲研磨成粉末，加入65°C預(yù)熱的2XCTAB抽提液，于65°C保溫45 60min，間或輕搖混勻；②12000rpm、4°C離心 20min,取上清液；③在上述上清液中加入體積比為25 24 1的酚、氯仿和異戊醇的混合液，輕輕混勻lOmin，12000rpm、4°C離心lOmin，取上清液移入離心管中；④在上述離心管中加入體積比為24 1的氯仿和異戊醇混合液，輕輕混勻lOmin，12000rpm、4°C離心lOmin，取上清液移入另一離心管中；⑤在上述離心管中加入2/3體積(相對于步驟(4)中的上清液)的_20°C預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖動(dòng)5min, 8000rpm、4°C離心lOmin,去上清；⑥將得到的沉淀用75vol%乙醇和10mmol/L醋酸鉀洗漆2 3次,每次8000rpm,室溫離心5min ；⑦加入預(yù)冷的95vol%乙醇,輕輕上下顛倒，8000rpm室溫離心IOmin,棄乙醇,真空抽干或自然晾干；⑧加入100 μ L IOXTE (Tris/EDTA)緩沖液，輕輕敲打使沉淀溶解；⑨加入I μ L 10mg/mL 的 RNaseA 于 37°C水浴 lh，去除 RNA ；⑩將得到的DNA提取物于_20°C冰箱貯藏備用；(3) SSR分子標(biāo)記的檢測對上述提取的DNA進(jìn)行基因SSR標(biāo)記的PCR擴(kuò)增；
PCR 擴(kuò)增體系為總體積 20 μ L，包括10 X PCR buffer 2μ L,25mmol/LMgCl22y L, lOmmol/LdNTP 0. 4μ L,5U/y L Taq DNA 酶 0. 2 μ L，10 μ mol/L SSR 標(biāo)記正向引物和反向引物總體積各I. 5 μ L，濃度20ng 30ng/ μ L提取的模板DNA2 μ L，ddH20 10. 4 μ L ;PCR 反應(yīng)條件94°C 5min ；94°C 30second, 55°C 30second, 72°C 30second, 30 個(gè)循環(huán)；72°C 5min(4)電泳檢測將上述PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物與2 μ L加樣緩沖液混勻，于95°C變性5min,結(jié)束后置于冰水混合物中冷卻3min，點(diǎn)樣3 μ L于變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為6%，電泳緩沖液為1ΧΤΒΕ，電壓ΙΟΟΟν，電流200mA，功率200W，電泳45min，銀染，顯色，拍照，分析結(jié)果。銀染的具體工藝為電泳完成后卸下并拆開玻璃板，膠板卸下后，用去離子水水洗5-8秒，浙干水分后，在銀染液(I. 5克硝酸銀和1500ml水)中避光銀染8分鐘，銀染后，用去離子水水洗5-8秒,浙干水分,放入顯影液(16克氫氧化鈉、1000ml水和8ml甲醒)中，至顯影后取出水洗后即可讀數(shù)。 采用7對SSR引物對香菇菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過對照50bp DNAladder可確定各SSR引物擴(kuò)增的等位片段的數(shù)量和相對分子量，找到符合編號組合為1 (1+4)12 (1+3)21的菌種，即可確定該菌種為香菇L952菌種，如圖I中箭頭標(biāo)注所示。為保證鑒定的準(zhǔn)確性，建議進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
權(quán)利要求
1.一種香菇L952菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜，其特征在于該指紋圖譜由7對基于香菇基因組序列開發(fā)的SSR標(biāo)記的特異等位片段組合而成，7對SSR標(biāo)記在香菇L952菌種上擴(kuò)增的等位片段信息具體為 Le_fp0001的等位片段的數(shù)量為1，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為600bp ； Le_fp0002的等位片段的數(shù)量為2，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為290bp，等位片段4相對于50bp DNA ladder的分子量為260bp ； Le_fp0003的等位片段的數(shù)量為1，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為900bp ； Le_fp0004的等位片段的數(shù)量為1，等位片段2相對于50bp DNA ladder的分子量為390bp ； Le_fp0005的等位片段的數(shù)量為2，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為720bp，等位片段3相對于50bp DNA ladder的分子量為540bp ； Le_fp0006的等位片段的數(shù)量為1，等位片段2相對于50bp DNA ladder的分子量為780bp ； Le_fp0007的等位片段的數(shù)量為1，等位片段I相對于50bp DNA ladder的分子量為700bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種香菇L952菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜，其特征在于所述7對SSR標(biāo)記等位片段的特異編號組合為1 (1+4)12 (1+3)21。
3.—種如權(quán)利要求I所述的香菇L952菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于鑒定香菇L952菌種的特異等位變異組合以及鑒定香菇L952菌種相對于其他國審香菇品種的特異性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種香菇L952菌種的SSR標(biāo)記指紋圖譜與應(yīng)用，該指紋圖譜由7對基于香菇基因組序列開發(fā)的SSR標(biāo)記的特異等位片段組合而成。應(yīng)用包括對香菇菌種進(jìn)行SSR標(biāo)記擴(kuò)增，將得到的帶型與指紋圖譜對照，與該指紋圖譜一致即為香菇L952菌種。本發(fā)明與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測時(shí)間短、準(zhǔn)確性高、可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，在收集的我國25個(gè)國審的香菇主栽菌種中具有香菇L952菌種的專一性。
文檔編號C12Q1/68GK102876780SQ201210333258
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者尚曉冬, 譚琦, 宋春艷, 鮑大鵬, 章爐軍, 張丹, 楊慧, 巫萍 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院