專利名稱：一種融合基因及其所表達的蛋白和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地說，涉及一種轉(zhuǎn)錄因子基因0sllg01480與VP64基因融合形成的融合基因及其用途。
背景技術：
水稻(Oryza sativa L.)是我國和全世界重要的糧食作物，是世界1/2以上人口的主食，也是一種重要的功能基因研究的模式植物，與其相關的遺傳學和分子生物學研究一直倍受研究者的重視，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達調(diào)控的重要方式。在植物界中，能形成種子的植物約占植物總數(shù)的三分之二以上，作為重要的繁殖器官，種子同時也為人們提供食物來源，水稻就是其中的重要代表，其種子來源于受精后的胚珠。從分子生物學的角度來說，種子的發(fā)育和萌發(fā)是一個有次序的、選擇性的基因表達過程，而轉(zhuǎn)錄因子在基因的精確調(diào)控中起到了關鍵性的作用。植物MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是功能多樣，數(shù)量眾多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與調(diào)控植物發(fā)育、代謝和生物與非生物脅迫反應等多種生理過程。擬南芥基因組測序后，全面對植物MYB基因家族進行了掃描和分類，目前隨著分子生物學和遺傳學的發(fā)展，已經(jīng)在大豆、玉米、水稻、葡萄、楊樹等多種植物物種中研究了 MYB蛋白家族成員的功能。在控制MYB蛋白活性的調(diào)控機制、基因表達規(guī)律和靶標基因的研究發(fā)面取得了一定的進展。有報道介紹了MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的分類、結構、生物功能以及調(diào)控機制。MYB結構域是一段約51-52個氨基酸的肽段，每隔18個氨基酸就規(guī)則性的間隔著色氨酸殘基，它們參與了空間結構中疏水核心的形成。有時色氨酸殘基會被某個芳香族氨基酸或疏水氨基酸所取代，尤其是在植物R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子中，R2R3-MYB結構域的第一個色氨酸經(jīng)常被亮氨酸、異亮氨酸或苯丙氨酸所取代。第一個色氨酸的C-末端通常是一族酸性氨基酸正是這些保守的氨基酸殘基使MYB結構域折疊成螺旋-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結構。然而MYB家族DNA結合位點結構域功能研究較少，同時該家族對水稻抽穗期的研究及認識也很少，因此該轉(zhuǎn)錄因子的研究在理論上為進一步理解水稻開花抽穗期發(fā)育調(diào)控的分子機理提供了新的線索；在實踐上也將為作物育種提供理論基礎。VP64是4個VP16功能域基序融合在一起組成的，是一類增強子。VP16最早在動物病毒基因中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在已被廣泛的應用到植物中，主要用于植物基因的轉(zhuǎn)錄控制的研究中，轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)的作用大體上可以分成兩種:一種為轉(zhuǎn)錄增強子，另一種為轉(zhuǎn)錄抑制子。當轉(zhuǎn)錄因子和VP16功能域基序融合之后，轉(zhuǎn)錄因子的功能就會被增強，在轉(zhuǎn)基因植株中就會出現(xiàn)更明顯的表型變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種融合基因，該融合基因由轉(zhuǎn)錄因子0sllg01480基因(SEQ ID N0.2)與VP64基因融合形成，并通過SEQ ID N0.3連接，該融合基因用于激活轉(zhuǎn)錄，延遲水稻開花 抽穗期和調(diào)控水稻種的生長發(fā)育。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的這一目的，本發(fā)明提供了一種融合基因，包含VP64和SEQ IDN0.2，其中SEQ ID N0.2位于VP64的下游，通過連接序列SEQ ID N0.3相連。本發(fā)明還提供了一種由上述融合基因表達得到的融合蛋白SEQ ID N0.4。上述融合基因在激活轉(zhuǎn)錄，延遲水稻開花抽穗期或調(diào)控水稻種生長發(fā)育中的應用。本發(fā)明還提供了一種載體，所述載體包含上述融合基因。本發(fā)明提供一種上述載體的構建方法，該方法為:(a)根據(jù)SEQ ID N0.2基因序列設計PCR擴增引物；(b)以水稻總cDNA為模板，進行PCR，獲得SEQ ID N0.2全序列；

(c)第一輪PCR:用加部分adaptor attB接頭的基因引物，進行PCR;(d)第二輪PCR:用第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，用完整的adaptor attB作為引物，進行PCR ；(e)將上一步PCR產(chǎn)物克隆連接到I3DONER克隆載體上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列；(f)通過LR反應將SEQ ID N0.2序列構建到其目地基因的N端融合了 VP64的植物表達載體上，獲得目的載體。本發(fā)明還提供了一種延遲水稻開花抽穗期的方法，該方法包括使用上述載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織細胞，使得融合基因在水稻愈傷組織細胞中表達。本發(fā)明還提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞是用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。本發(fā)明還提供一種生產(chǎn)含有上述融合基因的轉(zhuǎn)基因作物的方法，該方法包括:(a)取作物成熟種子，脫殼，消毒，接種到誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)；(b)采用農(nóng)桿菌介導的方法將含有所述融合基因的載體轉(zhuǎn)入作物愈傷組織中；(c)用含誘導劑和農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進行轉(zhuǎn)化；(d)將轉(zhuǎn)化后的材料進行共培養(yǎng)，脫菌，篩選，分化，生根，轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽；(e)用潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因作物。上述步驟(a)中的脫殼方式為人工或者機械脫殼。上述步驟(e)通過在種子萌發(fā)前用100mg/L潮霉素浸泡兩天實現(xiàn)。本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)錄因子基因0sllg01480是首次報道從水稻中分離并獲得功能鑒定的MYB family protein家族基因，該基因編碼的蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，與VP64融合形成的融合基因具有以下優(yōu)點:(I)增強0sllg01480基因的功能，使相應的轉(zhuǎn)基因植株出現(xiàn)更明顯的表型變化，具有轉(zhuǎn)錄激活作用；(2)該融合基因可以延遲水稻抽穗期，調(diào)控水稻種的生長發(fā)育；(3)該融合基因可用于探究調(diào)控水稻開花抽穗期的重要因子，為理解調(diào)控水稻抽穗機理提供新線索，從而為尋找與抽穗相關的產(chǎn)量和品質(zhì)等重要的經(jīng)濟性狀奠定重要的理論價值，在生產(chǎn)中也具有重要意義。


圖1為本發(fā)明實施例1中nVP64-hyg_asRED載體圖譜；圖2為本發(fā)明實施例1中ub1:VP64-0sllg01480載體圖譜；圖3為本發(fā)明中檢測轉(zhuǎn)基因陽性水稻株系的PCR結果，其中，WT為野生型水稻“kitaake”，TF876 為 VP64_0sllg01480 轉(zhuǎn)基因水稻株系；圖4為本發(fā)明Western blot檢測轉(zhuǎn)基因陽性株系結果，其中WT為野生型水稻“kitaake”，TF876-1、TF876-2 為 VP64_0sllg01480 轉(zhuǎn)基因水稻株系；圖5為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因水稻株系和野生型水稻開花抽穗時間統(tǒng)計結果，其中WT為野生型水稻 “kitaake”，TF876-1、TF876-2 為 VP64_0sllg01480 轉(zhuǎn)基因水稻株系。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例10sllg01480基因的分離和植物表達載體構建(1)在植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫中找到0sllg01480基因，根據(jù)其序列設計PCR擴增引物，以水稻總cDNA為模板，進行PCR，獲得0sllg01480全序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；(2)按照PrimeSTAR聚合酶擴增體系和反應程序進行PCR。此過程中包含兩輪PCR，第一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的基因引物，而第二輪的模板用第一輪的PCR產(chǎn)物，并且引物 用完整的adaptor attB引物；(3)將PCR產(chǎn)物克隆連接到I3DONER克隆載體上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列；(4)通過LR反應將0sllg01480構建到其目地基因的N端融合了 VP64的植物表達載體 pCambial301 (nVP64_hyg-asRED，圖1)上，獲得載體 ubi:VP64-0sllg01480 (圖 2)。實施例2生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻植株的方法( 1)取水稻成熟種子，人工或者機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經(jīng)消毒之后接種到誘導培養(yǎng)基上；(2)選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導的方法將載體ub1:VP64-0sllg01480轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進行轉(zhuǎn)化；(3)轉(zhuǎn)化后的材料經(jīng)過共培養(yǎng)、脫菌、篩選、分化、生根、轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽；(4)用潮霉素(Hygromycin)篩選轉(zhuǎn)基因水稻,種子萌發(fā)前用100mg/L潮霉素浸泡兩天。實施例3轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定為了檢測0sllg01480基因是否整合進入水稻基因組DNA，提取了野生型和轉(zhuǎn)基因水稻葉子DNA，從基因兩端的植物表達載體上設計一段引物進行PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株。通過PCR結果發(fā)現(xiàn)(圖3)，轉(zhuǎn)基因水稻均擴增出目的條帶，而野生型水稻中無此目的條帶，初步確定0sllg01480基因已通過農(nóng)桿菌介導的方法插入到水稻基因組中，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序結果分析是目的基因序列。利用VP64抗體可以鑒定目的基因是否在轉(zhuǎn)基因水稻中表達，隨機取野生型和兩株不同的轉(zhuǎn)基因水稻葉子(命名為TF876-1和TF876-2)作為材料，用Western blot技術在蛋白質(zhì)水平上鑒定，經(jīng)過SDS-PAGE蛋白電泳，免疫印記之后，免疫熒光反應，Western blot鑒定結果(圖4)表明轉(zhuǎn)基因植株雜交出目的蛋白，而野生型植株未雜交出目的蛋白。實施例4轉(zhuǎn)基因水稻表型分析將轉(zhuǎn)基因水稻和野生型親本水稻于夏季種植于北京當?shù)?，隨機選取野生型和兩株不同的轉(zhuǎn)基因水稻作為觀察對象，從播種至抽穗統(tǒng)計開花時間，轉(zhuǎn)基因VP64-0sllg01480水稻株系抽穗期比野生型水稻抽穗期顯著延長2周時間(圖5)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神 的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種融合基因，包含VP64和SEQ ID N0.2，其中SEQ ID N0.2位于VP64基因的下游，通過連接序列SEQ ID N0.3相連。
2.一種由權利要求1所述的融合基因表達得到的融合蛋白SEQ ID N0.4。
3.權利要求1所述的融合基因在激活轉(zhuǎn)錄，延遲水稻開花抽穗期或調(diào)控水稻種生長發(fā)育中的應用。
4.一種載體，所述載體包含權利要求1所述的融合基因。
5.—種權利 要求4所述載體的構建方法,該方法為: (a)根據(jù)SEQID N0.2基因序列設計PCR擴增引物； (b)以水稻總cDNA為模板，進行PCR，獲得SEQID N0.2全序列； (c)第一輪PCR:用加部分adaptor attB接頭的基因引物，進行PCR; Cd)第二輪PCR:用第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，用完整的adaptor attB作為引物，進行PCR ； Ce)將上一步PCR產(chǎn)物克隆連接到I3DONER克隆載體上，經(jīng)測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列； Cf)通過LR反應將SEQ ID N0.2序列構建到其目地基因的N端融合了 VP64的植物表達載體上，獲得目的載體。
6.一種延遲水稻開花抽穗期的方法，該方法包括使用權利要求4所述載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織細胞，使得所述融合基因在水稻細胞中表達。
7.—種宿主細胞，所述宿主細胞是用權利要求4的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
8.—種生產(chǎn)含有權利要求1所述融合基因的轉(zhuǎn)基因作物的方法，該方法包括: (a)取作物成熟種子，脫殼，消毒，接種到誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)； (b)采用農(nóng)桿菌介導的方法將含有所述融合基因的載體轉(zhuǎn)入作物愈傷組織中； (c)用含誘導劑和農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進行轉(zhuǎn)化； Cd)將轉(zhuǎn)化后的材料進行共培養(yǎng)，脫菌，篩選，分化，生根，轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽； Ce)用潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因作物。
9.根據(jù)權利要求8所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(a)中的脫殼方式為人工或者機械脫殼。
10.根據(jù)權利要求8所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(e)通過在種子萌發(fā)前用100mg/L潮霉素浸泡兩天實現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種融合基因，具體的說，提供了一種轉(zhuǎn)錄因子基因SEQ ID NO.2與VP64基因融合形成的融合基因，融合基因中SEQ ID NO.2位于VP64基因的下游，通過SEQ ID NO.3連接，還提供了該融合基因所表達的融合蛋白SEQ ID NO.4，含該融合基因的載體及其構建方法，以及含該融合基因的轉(zhuǎn)基因作物的生產(chǎn)方法。該融合基因具有明顯的轉(zhuǎn)錄激活作用，可以增強轉(zhuǎn)錄因子的功能，延遲水稻開花抽穗時間，調(diào)控水稻種的生長發(fā)育，在生產(chǎn)中具有重要意義。
文檔編號C12N15/63GK103243114SQ201310106639
公開日2013年8月14日 申請日期2013年3月29日 優(yōu)先權日2013年3月29日
發(fā)明者李宏宇, 鄒小花, 趙濤, 劉斌, 劉軍, 林辰濤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所