專利名稱：一種梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病病原體基因檢測(cè)技術(shù)，尤其涉及一種梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
梅毒螺旋體(Treponema pallidum, TP)屬于密螺旋體屬蒼白螺旋體的蒼白亞種(Treponema pallidum subsp. pallidum),是引起人類梅毒的病原體,因其透明，不易著色，故又稱蒼白螺旋體。一經(jīng)傳染，螺旋體很快播散到全身，幾乎可侵犯人體各器官，表現(xiàn)多種多樣的類似很多疾病的臨床表現(xiàn)，同時(shí)常時(shí)隱時(shí)現(xiàn)，病情變化難測(cè)，很容易造成誤診和漏 診。梅毒的傳染途徑有直接接觸、間接接觸和胎盤傳染三種，其中性直接接觸傳染是梅毒傳染的主要途徑。此外，由胎盤傳染導(dǎo)致的先天梅毒也正日益引起國家的關(guān)注。最早發(fā)現(xiàn)和論述梅毒病人的是在北美。1505年經(jīng)印度傳入我國廣東，至今已500多年。解放前是中國四大性病之首，60年代初基本被消滅，80年代再次發(fā)生和流行。90年代末以來，全國梅毒報(bào)告病例數(shù)明顯增加，流行呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)。據(jù)中國CDC性病控制中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，1999年報(bào)告病例80406例，年發(fā)病率為6. 50/10萬，2009年報(bào)告病例327433例，年發(fā)病率為24. 66/10萬，發(fā)病率年均增長14. 3%。1997年先天梅毒報(bào)告病例數(shù)為109例，報(bào)告發(fā)病率為O. 53/10萬活產(chǎn)數(shù)，2009年報(bào)告病例數(shù)為10757例，報(bào)告發(fā)病率為64. 41/10萬活產(chǎn)數(shù)，發(fā)病率年均增長49. 2%。2009年，梅毒報(bào)告病例數(shù)在我國甲乙類傳染病報(bào)告中居第三位。根據(jù)疾病的特點(diǎn)和經(jīng)過，一般分為一期、二期和三期(晚期)梅毒。一期與二期梅毒傳染性強(qiáng)，又稱為早期梅毒，一般多在感染梅毒2年內(nèi)。病期在2年以上者，臨床為三期梅毒，幾乎無傳染性，但破壞性強(qiáng)，亦稱晚期梅毒。一般梅毒的潛伏期為2 4周。梅毒螺旋體的基因是由113. 8萬個(gè)堿基對(duì)組成的環(huán)狀DNA，含有1041個(gè)開放讀碼框架(ORFs)，55%的ORFs有生物學(xué)功能。早期針對(duì)梅毒螺旋體的基因檢測(cè)，其靶基因主要集中在tmp基因、tpf-Ι基因、47KD外膜蛋白基因、bmp基因以及16S rRNA等。但是這些基因的大部分序列與其他微生物具有一定的同源性且功能不明，擴(kuò)增時(shí)常出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物，故運(yùn)用這些靶基因的特異性和敏感度較低。通過與其他微生物polA基因的同源性進(jìn)行比較分析，可以發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體的polA基因非常獨(dú)特，所編碼的半胱氨酸多達(dá)24個(gè)，占polA酶氨基酸總數(shù)的2. 4%，而絕大多數(shù)的微生物只有廣2個(gè)，只占O. 1%。且對(duì)梅毒螺旋體的polA基因的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中有4個(gè)特殊的插入點(diǎn)。因而，TP-polA基因具有較高的特異性和敏感性。臨床梅毒的初篩方法是血清學(xué)檢測(cè)。但是人體感染梅毒要4 10周才可產(chǎn)生一定數(shù)量的抗體，使得血清學(xué)檢測(cè)早期梅毒的檢出率偏低。由于PCR反應(yīng)的高靈敏度，使得采用基因診斷早期梅毒具有很大的優(yōu)勢(shì)，有報(bào)導(dǎo)感染后10天左右皮損剛一出現(xiàn)即可檢出陽性，目前PCR法診斷一期梅毒的靈敏度是數(shù)種臨床檢測(cè)方法中最高。PCR檢測(cè)梅毒螺旋體的DNA,其敏感性、特異性均優(yōu)于血清學(xué)方法，能夠很好地補(bǔ)充血清學(xué)方法的不足之處。
梅毒的血清學(xué)診斷對(duì)確定感染及治療很有意義，但對(duì)早期梅毒診斷不敏感，對(duì)先天性及神經(jīng)性梅毒的診斷不夠特異。Burstain和Grimprel等人將PCR技術(shù)用于先天梅毒的診斷中，發(fā)現(xiàn)其敏感性和特異性均優(yōu)于血清學(xué)方法。高度敏感性使PCR方法尤其適用于微量梅毒螺旋體的檢測(cè)如先天梅毒、神經(jīng)梅毒；良好的特異性使PCR技術(shù)在梅毒和其它螺旋體感染的鑒別診斷、梅毒螺旋體的病原學(xué)研究方法具有重要作用；艾滋病患者感染梅毒后可出現(xiàn)多種異常的免疫學(xué)變化，對(duì)梅毒的血清學(xué)反應(yīng)延遲出現(xiàn)甚至完全消失，此時(shí)應(yīng)用PCR方法檢測(cè)組織中病原體將顯示出獨(dú)特價(jià)值。但PCR方法并不能取代梅毒的血清學(xué)反應(yīng)，若病人下疳愈合，血清學(xué)反應(yīng)陽性時(shí)無需再做PCR檢測(cè)。目前臨床上對(duì)梅毒螺旋體的檢測(cè)主要采用暗視野顯微鏡檢查、血清學(xué)方法(包括非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)和梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn))和基因診斷試驗(yàn)。(I)暗視野顯微鏡檢查法該方法可直接觀察到病灶分泌物中的梅毒螺旋體。對(duì)一期和二期梅毒的皮膚黏膜損害及淋巴結(jié)病變具有快速、簡便和可靠的診斷價(jià)值，是性病實(shí)驗(yàn)室常用的方法，但由于要求嚴(yán)格的技術(shù)和敏感性較低而限制其應(yīng)用。并非所有梅毒的病期中都能找到梅毒螺旋體，如果陰性，也不能完全排除梅毒。 (2)非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)由于操作簡便，該方法常作為臨床梅毒的初篩方法，其中以快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR)為代表。RPR是80年代問世的非特異性梅毒血清學(xué)試驗(yàn)，所用抗原為標(biāo)準(zhǔn)的牛心肌脂抗原，該方法操作簡便、迅速，適用于大量標(biāo)本檢測(cè)。該方法的缺點(diǎn)是當(dāng)抗體含量過高時(shí)，易出現(xiàn)假陰性，即前帶現(xiàn)象，還易出現(xiàn)生物學(xué)假陽性反應(yīng)。對(duì)潛伏期梅毒、神經(jīng)梅毒不敏感。(3)梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)由于非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)的局限性，臨床上常采用梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)作為確認(rèn)試驗(yàn)。該方法檢測(cè)血清中抗梅毒螺旋體IgG或IgM抗體，該抗體即使患者經(jīng)過足夠治療，仍能長期存在，甚至終身不消失，血清反應(yīng)持續(xù)存在陽性，因此，不能用于觀察療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，針對(duì)梅毒螺旋體基因組中的DNA聚合酶基因的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針，特異擴(kuò)增和檢測(cè)梅毒螺旋體基因片段，提供一種能快速準(zhǔn)確檢測(cè)出梅毒螺旋體，適用于臨床應(yīng)用的梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，主要包括PCR反應(yīng)試劑和DNA提取試劑，其要點(diǎn)在于所述PCR反應(yīng)試劑包括
O特異性擴(kuò)增梅毒螺旋體核酸的上游外引物，其堿基序列為5’ -GGTCGATGTGCAAATGAGTGTT -3’ ；
2)特異性擴(kuò)增梅毒螺旋體核酸的下游外引物，其堿基序列為5’-CCGACTTCAATACGGAGTTCAC -3’ ；
3)用于檢測(cè)梅毒螺旋體核酸的探針，其堿基序列為5’-ACTAGCCCTCCCTTCTACCTGAGATAAG -3’ ；
所述探針5’端用熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。本發(fā)明采用基因診斷試驗(yàn)檢測(cè)梅毒螺旋體DNA，特異性很強(qiáng)、敏感性很高，是目前診斷梅毒螺旋體的先進(jìn)方法。PCR法診斷一期梅毒的靈敏度最高，這是因?yàn)槿梭w感染梅毒要4 10周才可產(chǎn)生一定數(shù)量的抗體，而特異性抗體比非特異性抗體早I周出現(xiàn)。PCR檢測(cè)梅毒螺旋體的DNA，其敏感性、特異性均優(yōu)于血清學(xué)方法，能夠很好地補(bǔ)充血清學(xué)方法的不足之處。在本試劑盒中，采用一對(duì)TP特異性引物擴(kuò)增TP基因組部分片段，該片段為梅毒螺旋體基因組的保守區(qū)域，再在該保守區(qū)域內(nèi)，設(shè)計(jì)一條特異片段的探針，并進(jìn)行熒光素標(biāo)記。在含目 的基因的PCR反應(yīng)中，該探針會(huì)被Taq DNA聚合酶分解，釋放出熒光信號(hào)。利用熒光PCR對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)TP基因的檢測(cè)。本發(fā)明的梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，引入了一個(gè)人工構(gòu)建的用于避免檢測(cè)結(jié)果假陰性的內(nèi)參照系統(tǒng)，所述內(nèi)參照系統(tǒng)為擬南芥內(nèi)參照系統(tǒng)，包括
1)上游引物,其堿基序列為5'- CGTCGCTGGAGCTGGTTTA -3'；
2)下游引物，其堿基序列為5'- GGCGGTTTGTCAAGCTGAT -3'；
3)熒光探針，其堿基序列為5' - CTGCCGATATAGGTCACAGCATGG -3'。在試劑盒設(shè)置了內(nèi)參照，擬南芥基因即為SUC基因，SUC基因是一段與人及梅毒螺旋體無關(guān)的基因，因此可作為內(nèi)參照以檢測(cè)每次PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)中是否有PCR抑制物存在，從而確保PCR結(jié)果的可信性。當(dāng)內(nèi)參照結(jié)果為陽時(shí)，表示沒有PCR抑制物存在，PCR反應(yīng)體系以及操作正常，表示此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信，此時(shí)目的基因結(jié)果為陽時(shí)表示樣本含有梅毒螺旋體，目的基因結(jié)果為陰時(shí)表示樣本不存在梅毒螺旋體；當(dāng)內(nèi)參照結(jié)果為陰，目的基因結(jié)果為陽時(shí)，PCR反應(yīng)體系以及操作都是正常的，表示此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信，樣本含有梅毒螺旋體，而此時(shí)若目的基因?yàn)殛帲瑒t說明該次PCR反應(yīng)中存在PCR抑制物，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可信，該實(shí)驗(yàn)視為無效，需再重復(fù)。所述熒光染料為FAM、JOE或HEX，所述淬滅熒光染料為BHQl、BHQ2或TAMRA。所述的梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，探針為Taqman或MGB探針。 熒光PCR是在引物特異的基礎(chǔ)上采用模版序列特異的熒光探針進(jìn)一步提高PCR檢測(cè)的專一性，每擴(kuò)增一個(gè)特異產(chǎn)物只釋放一個(gè)分子的熒光染料，儀器檢測(cè)的是特異擴(kuò)增的結(jié)果，非特異產(chǎn)物對(duì)檢測(cè)信號(hào)沒有影響，有效提高檢測(cè)的專一性。同時(shí)利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，使得PCR的檢測(cè)靈敏度得極大的提高。梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒上游引物的濃度為5_20μΜ，下游引物的濃度為
5-20 μ Μ，探針的濃度為5-20 μ M0所述PCR反應(yīng)試劑還包括每人份25μ L純水、5μ L 10倍PCR緩沖液、7yL20-40mM 的 MgC12，lyL IOmM 的 dNTP、lyL 4-6U/μ L 的 Taq 酶和 IyL O. 5-1. 5U/μ L 的UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP,并且為 dATP:dCTP:dGTP:dUTP=l :1:1:2 K制。所述的10倍PCR緩沖液是指稱取18. 171-30. 285gTris和48. 425-70. 775gKCL，加入700-800mL去離子水并攪拌均，待所有固體溶解后，使用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8. 5-8. 9，去離子水定容至IOOOmL的混合液。所述的梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒DNA提取試劑包括提取液A和提取液B，其中 所述DNA提取試劑包括提取液A和提取液B，其中
所述提取液A的制備方法為取684-1368g蔗糖，7. 874-10. 297g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，250-350mL聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-IOO)，混合均勻，鹽酸調(diào)pH值為7. 5-8. O,純水定容至3000mL，取每人份3mL ；所述提取液B的制備方法為取O. 05-0. 15g聚苯乙烯基體離子交換樹脂(ChelexlOO)，O. 25-0. 75mL TritonX-100,0. 04-0. 08g Tris,鹽酸調(diào) pH 值為 7. 8-8. 3，純水定容至50mL,取每人份O. 05mL。所述試劑盒還包括梅毒螺旋體核酸檢測(cè)的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。所述陽性質(zhì)控品的制備方法為a)收集測(cè)序檢測(cè)為TP陽性的樣本，b)經(jīng)PCR擴(kuò)增和T載體克隆獲得質(zhì)粒，c)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，d)菌株培養(yǎng)，e)離心收集大腸桿菌細(xì)胞，f)用含30%甘油的TE溶液稀釋重懸細(xì)胞至質(zhì)粒濃度為I. OX 107COpieS/ml作為試驗(yàn)用陽性質(zhì)控品。所述陰性質(zhì)控品的制備方法為a)將空白T載體轉(zhuǎn)化入大腸桿 菌中，b)菌株培養(yǎng)，c)離心收集大腸桿菌細(xì)胞。d)用含30%甘油的TE溶液稀釋重懸細(xì)胞至質(zhì)粒濃度為I. OX 107copies/ml,作為試驗(yàn)用陰性質(zhì)控品。本發(fā)明的有益效果為利用梅毒螺旋體核酸中高保守特異性核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，從而判斷梅毒螺旋體的存在。本試劑盒具有設(shè)計(jì)合理，技術(shù)可行；質(zhì)量控制體系穩(wěn)定可靠；產(chǎn)品穩(wěn)定性能良好，檢測(cè)所需模板量少，檢測(cè)結(jié)果可靠準(zhǔn)確，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。靈敏度和特異性高。最低檢出限為5.0X102COpieS/mL。使用了擬南芥內(nèi)參照系統(tǒng)它在梅毒螺旋體基因組和人類基因組中均無同源基因，因此可作為內(nèi)參照以檢測(cè)每次PCR反應(yīng)中是否有PCR抑制物存在，從而確保PCR結(jié)果的可信性。


圖I為最低檢測(cè)量參考品TS1-TS6的PCR擴(kuò)增曲線 圖2為精密度參考品TPl的PCR擴(kuò)增曲線
圖3為精密度參考品TP3的PCR擴(kuò)增曲線 圖4為強(qiáng)陽性參考品TP1-TP2的PCR擴(kuò)增曲線 圖5為弱陽性參考品TP3-TP4的PCR擴(kuò)增曲線 圖6為陰性參考品TN1-TN4的PCR擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，以使本行業(yè)技術(shù)人員更理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。本產(chǎn)品的主要技術(shù)原理是將熒光PCR技術(shù)和dUTP-UNG防污染技術(shù)相結(jié)合的基因檢測(cè)技術(shù)，該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定等特點(diǎn)。熒光PCR是在引物特異的基礎(chǔ)上采用模版序列特異的熒光探針進(jìn)一步提高PCR檢測(cè)的專一性，每擴(kuò)增一個(gè)特異產(chǎn)物只釋放一個(gè)分子的熒光染料，儀器檢測(cè)的是特異擴(kuò)增的結(jié)果，非特異產(chǎn)物對(duì)檢測(cè)信號(hào)沒有影響，有效提高檢測(cè)的專一性。同時(shí)利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理，使得PCR的檢測(cè)靈敏度得極大的提高。檢測(cè)探針一般是Taqman或MGB探針。一種梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，主要包括PCR反應(yīng)試劑和DNA提取試劑，所述PCR反應(yīng)試劑包括
I)特異性擴(kuò)增梅毒螺旋體核酸的上游外引物，其堿基序列為
5’ - GGTCGATGTGCAAATGAGTGTT -3’ ；2)特異性擴(kuò)增梅毒螺旋體核酸的下游外引物，其堿基序列為
5’ - CCGACTTCAATACGGAGTTCAC -3’ ；
3)用于檢測(cè)梅毒螺旋體核酸的探針，其堿基序列為
5’ - ACTAGCCCTCCCTTCTACCTGAGATAAG -3’ ；
所述探針5’端用突光染料標(biāo)記,3’端用淬滅突光染料標(biāo)記。所述突光探針5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM、JOE或HEX，所述淬滅熒光基團(tuán)為BHQ1、BHQ2或TAMRA。所述探針為Taqman或MGB探針。在本試劑盒中，采用一對(duì)TP特異性引物擴(kuò)增TP基因組部分片段，該片段為梅毒螺旋體基因組的保守區(qū)域，再在該保守區(qū)域內(nèi)，設(shè)計(jì)一條特異片段的探針，并進(jìn)行熒光素標(biāo)記。在含目的基因的PCR反應(yīng)中，該探針會(huì)被Taq DNA聚合酶分解，釋放出熒光信號(hào)。利用 熒光PCR對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)TP基因的檢測(cè)。dUTP-UNG防污染技術(shù)的原理是在PCR反應(yīng)液中用dUTP代替dTTP，使PCR產(chǎn)物中摻入大量dU。利用UNG酶可分解含UTP的單或雙鏈DNA，而對(duì)RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用的性質(zhì)，在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。該技術(shù)可有效地消除或減弱因PCR產(chǎn)物污染造成的假陽性。本試劑盒中引入了一個(gè)人工構(gòu)建的用于避免檢測(cè)結(jié)果假陰性的內(nèi)參照系統(tǒng)，所述內(nèi)參照系統(tǒng)為擬南芥內(nèi)參照系統(tǒng)，包括
1)上游引物,其堿基序列為5'- CGTCGCTGGAGCTGGTTTA -3'；
2)下游引物，其堿基序列為5'- GGCGGTTTGTCAAGCTGAT -3'；
3)熒光探針，其堿基序列為5' - CTGCCGATATAGGTCACAGCATGG -3'。內(nèi)參照原理試劑盒設(shè)置了內(nèi)參照，該內(nèi)參照為含擬南芥基因(SUC基因)的質(zhì)粒，SUC基因是一段與人及梅毒螺旋體無關(guān)的基因，因此可作為內(nèi)參照以檢測(cè)每次PCR反應(yīng)中是否有PCR抑制物存在，從而確保PCR結(jié)果的可信性。當(dāng)內(nèi)參照結(jié)果為陽時(shí)，表示PCR反應(yīng)體系以及操作正常；因此當(dāng)目的基因結(jié)果為陰時(shí)，內(nèi)參照結(jié)果為陽就顯得十分重要了 ；但當(dāng)目的基因結(jié)果為陽時(shí)，內(nèi)參照的擴(kuò)增曲線較目的基因擴(kuò)增曲線要推遲，或是內(nèi)參照結(jié)果為陰都是正常的；然而目的基因和內(nèi)參照基因結(jié)果都為陰時(shí)，該實(shí)驗(yàn)視為無效，需再重復(fù)。本試劑盒中的DNA提取試劑包括提取液A和提取液B，其中
所述提取液A的制備方法為取684-1368g蔗糖，7. 874-10. 297g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，250-350mL聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，混合均勻，鹽酸調(diào)pH值為7. 5-8. O,純水定容至3000mL，取每人份3mL ；
所述提取液B的制備方法為取O. 05-0. 15g聚苯乙烯基體離子交換樹脂(ChelexlOO)，O. 25-0. 75mL TritonX-100,0. 04-0. 08g Tris,鹽酸調(diào) pH 值為 7. 8-8. 3，純水定容至50mL,取每人份O. 05mL。本試劑盒中還包括梅毒螺旋體核酸檢測(cè)的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品的制備方法為a)收集測(cè)序檢測(cè)為TP陽性的樣本，b)經(jīng)PCR擴(kuò)增和T載體克隆獲得質(zhì)粒，c)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，d)菌株培養(yǎng)，e)離心收集大腸桿菌細(xì)胞，f)用含30%甘油的TE溶液稀釋重懸細(xì)胞至質(zhì)粒濃度為1.0X107COpieS/ml作為試驗(yàn)用陽性質(zhì)控品。
陽性對(duì)照原理每次試驗(yàn)都需同時(shí)做陽性對(duì)照。陽性對(duì)照結(jié)果為陽，表明對(duì)靶基因的檢測(cè)系統(tǒng)是正常的；而當(dāng)結(jié)果為陰時(shí)，表明該次實(shí)驗(yàn)無效，需重復(fù)。陰性質(zhì)控品的制備方法為a)將空白T載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，b)菌株培養(yǎng)，c)離心收集大腸桿菌細(xì)胞。d)用含30%甘油的TE溶液稀釋重懸細(xì)胞至質(zhì)粒濃度為I. OX 107copies/ml,作為試驗(yàn)用陰性質(zhì)控品。陰性對(duì)照原理為證明有否污染存在，每次試驗(yàn)也需同時(shí)做陰性對(duì)照。陰性對(duì)照結(jié)果為陰，表明本次試驗(yàn)無污染；如結(jié)果為陽，則表明該次實(shí)驗(yàn)無效，需重復(fù)。實(shí)施例I
表I :試劑盒組成
__組分虞稱__.數(shù)量
眞凝寧液A 72_1/魏2艇
m酸
M
取
金裰_激B 1·2_1/管 2管
τ 德·
W-PCE AM 1 , PCE 重/f 2 ψ
液
蠊孽關(guān)pl/管 I管 JStm----
I,翁控-皂麵經(jīng)——建—重.......凳—
Xr I闘餘質(zhì)控品|20#p!/管 I管
提取液A的制備方法為取684g蔗糖，7. 874g三羥甲基氨基甲烷(Tris)，250mL聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，混合均勻，鹽酸調(diào)pH值為7. 5-8. 0，純水定容至3000mL，取每人份3mL ；
提取液B的制備方法為取O. 05g聚苯乙烯基體離子交換樹脂(CheleX100)，0. 25mLTritonX-100,0. 04g Tris，鹽酸調(diào) pH 值為 7. 8-8. 3，純水定容至 50mL,取每人份 O. 05mL。
表2 : TP-PCR反應(yīng)液配方
雨號(hào)|組分I初濃度I數(shù)量-
I__-_25 μ L
2FcRbuffer~ IOx5μ L
3MgCla~25mM7μ L
4Tntp μ l
5L-pri-Tl10 μ mo IIuL
6L-pri~T210 μ mo IIuL
7L-pri-Il10 μ mo I0. 5 μ L
8L-pri-I210 μ moI0. 5 μ L
9L-pro-Tl10 μ mo IIuL
10L-pro-Il10 μ mo I0. 5 μ L
權(quán)利要求
1.一種梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，主要包括PCR反應(yīng)試劑和DNA提取試劑，其特征在于，所述PCR反應(yīng)試劑包括 1)特異性擴(kuò)增梅毒螺旋體核酸的上游外引物，其堿基序列為5’ - GGTCGATGTGCAAATGAGTGTT -3’ ； 2)特異性擴(kuò)增梅毒螺旋體核酸的下游外引物，其堿基序列為5’ - CCGACTTCAATACGGAGTTCAC -3’ ； 3)用于檢測(cè)梅毒螺旋體核酸的探針，其堿基序列為5’ - ACTAGCCCTCCCTTCTACCTGAGATAAG -3’ ； 所述探針5’端用熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，引入了一個(gè)人工構(gòu)建的用于避免檢測(cè)結(jié)果假陰性的內(nèi)參照系統(tǒng)，所述內(nèi)參照系統(tǒng)為擬南芥內(nèi)參照系統(tǒng)包括 1)上游引物,其堿基序列為5'- CGTCGCTGGAGCTGGITTA -3'； 2)下游引物，其堿基序列為5'- GGCGGITTGTCAAGCTGAT -3'； 3)熒光探針，其堿基序列為5' - CTGCCGATATAGGTCACAGCATGG -3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述熒光探針5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，所述熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM、JOE或HEX，所述淬滅熒光基團(tuán)為BHQ1、BHQ2或TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述探針為Taqman 或 MGB 探針。
5.按權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述上游引物的濃度為5-20 PM，所述下游引物的濃度為5-20 PM，所述探針的濃度為5_20 y M。
6.按權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)試劑還包括每人份25 u L純水、5 ii L 10倍PCR緩沖液、7 y L 20-40mM的MgCl2、I u L IOmM的dNTP、I u L 4-6U/ ii L 的 Taq 酶和 I y L 0. 5-1. 5U/ ii L 的 UNG 酶，所述 dNTP 包括 dATP、dUTP、dGTP、dCTP，并且為 dATP: dCTP: dGTP: dUTP=l: 1: 1:2 配制，所述的 10 倍 PCR 緩沖液的配制方法為稱取 18. 171-30. 285gTris 和 48. 425-70. 775gKCL,加入 700_800mL 去離子水并攪拌均，待所有固體溶解后，使用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8. 5-8. 9，去離子水定容至IOOOmL的混合液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述DNA提取試劑包括提取液A和提取液B，其中 所述提取液A的制備方法為取684-1368g蔗糖、7. 874-10. 297g三羥甲基氨基甲烷(Tris)和250-350mL聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-IOO)，混合均勻，鹽酸調(diào)pH值為7.5-8. 0,純水定容至3000mL，取每人份3mL ； 所述提取液B的制備方法為取0. 05-0. 15g聚苯乙烯基體離子交換樹脂(ChelexlOO)、0. 25-0. 75mL TritonX-IOO 和 0. 04-0. 08g Tris,鹽酸調(diào) pH 值為 7. 8-8. 3，純水定容至50mL,取每人份0. 05mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述陽性質(zhì)控品的制備方法為a)收集測(cè)序檢測(cè)為TP陽性的樣本，b)經(jīng)PCR擴(kuò)增和T載體克隆獲得質(zhì)粒，c)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，d)菌株培養(yǎng)，e)離心收集大腸桿菌細(xì)胞，f)用含30%甘油的TE溶液稀釋重懸細(xì)胞至質(zhì)粒濃度為I. OX 107COpieS/ml作為試驗(yàn)用陽性質(zhì)控品；所述陰性質(zhì)控品的制備方法為1)將空白T載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，2)菌株培養(yǎng)，3)離心收集大腸桿菌細(xì)胞，4)用含30%甘油的TE溶液稀釋重懸細(xì)胞至質(zhì)粒濃度為I. OX 107COpieS/ml， 作為試驗(yàn)用陰性質(zhì)控品。
全文摘要
一種梅毒螺旋體核酸檢測(cè)試劑盒，主要包括PCR反應(yīng)試劑和DNA提取試劑，其要點(diǎn)在于所述PCR反應(yīng)試劑包括1)特異性擴(kuò)增梅毒螺旋體核酸的上游外引物，其堿基序列為5’-GGTCGATGTGCAAATGAGTGTT-3’；2)特異性擴(kuò)增梅毒螺旋體核酸的下游外引物，其堿基序列為5’-CCGACTTCAATACGGAGTTCAC-3’；3)用于檢測(cè)梅毒螺旋體核酸的探針，其堿基序列為5’-ACTAGCCCTCCCTTCTACCTGAGATAAG-3’；所述探針5’端用熒光染料標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料標(biāo)記。本發(fā)明具備高靈敏度、高特異性、高通量等優(yōu)點(diǎn)，能快速準(zhǔn)確檢測(cè)出梅毒螺旋體，適用于臨床應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102816857SQ20121032682
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月13日
發(fā)明者李旭新, 楊玉芬 申請(qǐng)人:泰普生物科學(xué)(中國)有限公司