專利名稱：適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞工程技術領域，特別是涉及ー種用于支持Vero細胞貼壁生長和支持病毒増殖的培養(yǎng)基和使用方法，更具體地說是用于VeiO細胞微載體懸浮培養(yǎng)及微載體懸浮規(guī)模放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基及利用該養(yǎng)基實現(xiàn)規(guī)?；囵B(yǎng)的方法。
背景技術：
Vero細胞來源清晰，歷史清楚，一定代次內無致瘤性，是世界衛(wèi)生組織(WHO)和我國生物制品規(guī)程批準可用于人類和獸類疫苗生產的細胞系，是現(xiàn)階段病毒疫苗生產最主要的細胞基質。Vero細胞對多種病毒敏感，且病毒増殖滴度高。目前國內各種以Vero細 胞為生產介質的生物制品產業(yè)蓬勃發(fā)展，越來越多的企業(yè)已達到了商業(yè)化生產的要求，這就需要大量可供生產用的細胞培養(yǎng)基，同時也亟需一定規(guī)模的體外培養(yǎng)。然而，大多數(shù)傳統(tǒng)培養(yǎng)基需要添加10%左右的牛血清，血清購買和儲存的成本高，更重要的是，添加高濃度的血清大大增加了下游產品純化的壓力。血清組分的復雜性及其中存在病毒等病原微生物污染的潛在風險，増加了產品生產的不穩(wěn)定性和產品質量控制的難度。不可否認，使用無血清培養(yǎng)基是避免以上風險的較好途徑，國外也已有多種商品化的Vero細胞無血清培養(yǎng)基上市，如JRH公司的EX-CELLTMVERO，Invitrogen公司的VP-SFM和OptiPro SFM等。但無血清培養(yǎng)基售價高，供貨期長，對企業(yè)來說增加了大量成本，降低了其市場競爭力；另外，細胞由含血清培養(yǎng)基轉入無血清培養(yǎng)基存在適應過程，需要根據(jù)細胞株的特性嘗試不同的無血清培養(yǎng)基產品，細胞無血清適應需要4 5代的時間，一般情況下細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)8代后，生長會變慢。無血清細胞庫的建立也是ー個難題。當涉及反應器微載體系統(tǒng)的規(guī)模放大，采用無血清培養(yǎng)基的生產路線將面臨更大的問題。貼壁依賴型細胞的放大需要胰蛋白酶的消化，去除了血清，如何中和培養(yǎng)基中的胰蛋白酶是技術人員要迫切解決的?，F(xiàn)在常用的方法是添加植物來源的胰蛋白酶抑制劑，如大豆胰蛋白酶抑制劑。但是，胰蛋白酶抑制劑容易失活，儲存條件苛刻；更重要的是大量使用胰蛋白酶抑制劑成本上是不允許的。另外，長時間使用胰酶抑制劑會抑制細胞的生長。降低細胞生長階段的血清添加量，優(yōu)選的將血清濃度降至痕量(1% (v/v)以下)應該是可行的方法。本發(fā)明通過提供一種低成本細胞培養(yǎng)基解決了現(xiàn)有的技術問題。即Vero細胞生長階段添加痕量血清，可支持Vero在方瓶、滾瓶上生長，并可支持Vero細胞微載體懸浮培養(yǎng)和微載體懸浮規(guī)模放大培養(yǎng)。另外本培養(yǎng)基可以作為病毒維持液，實現(xiàn)病毒無血清生產?；谖⑤d體細胞培養(yǎng)生產疫苗的エ藝規(guī)模已達到1000L以上[1-5]。反應器放大到下一級反應器的基本轉移模式有消化轉移和球轉球。球轉球是指微載體上的細胞匯合成單層后，按ー定比例加入新的微載體，并采取某些措施(如低轉速攪拌、間歇攪拌等)促使細胞從舊微載體向新微載體遷移而實現(xiàn)放大。球轉球放大過程可以直接在原反應器中添加新微載體，使微載體濃度増大；也可以將長有細胞的舊球打入下一級反應器中，加入新微載體后用新鮮培養(yǎng)基稀釋微載體至原來濃度。雖然已有學者報道了球轉球放大的成功案例[6]，但要求細胞的遷移能力強，而且舊球上的細胞容易長得過老，因此限制了其廣泛應用。消化轉移是指用胰蛋白酶將細胞從微載體上消化下來，并把細胞或者細胞和微載體接入下一級反應器中，補加新微載體和新鮮培養(yǎng)基后開始新ー輪的微載體細胞培養(yǎng)。從操作層面上講只要在兩級反應器之間加入消化反應器，消化轉移適用于絕大多數(shù)微載體放大工藝。然而越來越多的學者在實踐中發(fā)現(xiàn)微載體培養(yǎng)的系列傳代是十分復雜的，隨著傳代數(shù)増加，細胞在微載體上的生長速率急劇下降。Van等報道了ー種猴腎細胞在微載體上傳代時細胞最高密度逐漸下降，傳至第六代或第七代時細胞停止増殖[7]。Hu等也報道了相似的現(xiàn)象，他們用胰蛋白酶將FS-4細胞從微載體上成功消化下來并接種到新的微載體上，結果發(fā)現(xiàn)細胞在第一代時倍增了 2. 2倍，而在第三代只倍増I. 5倍[8]。傳代過程中不能維持穩(wěn)定的細胞增埴速度已成為微載體應用于大規(guī)模細胞培養(yǎng)的一大障礙。國內廣泛采用兩階段法生產生物制品細胞生長階段用MEM、M199等基礎培養(yǎng)基添加10% NBCS，待細胞匯合成單層，經PBS洗滌去除血清；生產階段用基礎培養(yǎng)基添加適量白蛋白或者少量血清作為細胞維持液，用于產品的生產。首先，由于在細胞生長階段添加了大量血清，用PBS洗滌時可能會有過量的血清殘留而造成產品不合格，尤其在大規(guī)模生產過程中對上千升培養(yǎng)體系的洗滌是非常繁瑣和困難的。其次，血清批間差異很大是造成生物制品批次間差異的重要因素，10% NBCS的添加無疑大大增加了批次間的不穩(wěn)定。再次，生產階段去除或大幅度降低血清濃度后，很難長時間保持良好的細胞狀態(tài)，從而顯著影響產品的產量和質量。完全無血清生產自行開發(fā)或者直接購買商業(yè)化無血清培養(yǎng)基，從細胞生長到產品生產都使用無血清培養(yǎng)基。
首先，無血清培養(yǎng)基開發(fā)難度大，開發(fā)費用高。其次，商業(yè)化無血清培養(yǎng)基售價高，供貨期長，細胞株普適性較差。再次，貼壁細胞需要胰蛋白酶消化才能傳代，失去了血清的中和作用，胰蛋白酶會對細胞造成傷害，使用胰酶抑制劑(植物多肽)可以抑制胰酶的活性，但是胰酶抑制劑本身對細胞有一定的毒害作用，很難實現(xiàn)微載體系統(tǒng)培養(yǎng)規(guī)模的放大。大多數(shù)常規(guī)細胞培養(yǎng)基的起點是ー種基本的基礎培養(yǎng)基，一般包含氨基酸、糖類、維生素、無機鹽、微量元素、緩沖液。對大多數(shù)常規(guī)的培養(yǎng)基而言，將適當?shù)膭游镅寤蛘哐灏椎鞍滓约爸|成分加入到該基本的基礎培養(yǎng)基中而制得用于支持細胞生長和繁殖、重組蛋白表達以及病毒復制或病毒產物表達所必需的完全培養(yǎng)基?？紤]到血清的安全和批次間穩(wěn)定性問題，在現(xiàn)有技術中在用其他蛋白替換物替換血清成分方面已經做了ー些嘗試。例如，中國專利200710187466公布了ー種無血清培養(yǎng)基，它由I)常規(guī)的基礎培養(yǎng)基，2)脂類混合物，3)重組蛋白和生長因子組成，其中添加了脂溶性維生素、轉鐵蛋白、胰島素、表皮生長因子、前列腺素、三碘甲狀腺激素等重組蛋白、多肽和激素。雖然在該培養(yǎng)基中可以實現(xiàn)VeiO細胞單細胞懸浮培養(yǎng)，但是最大細胞密度僅僅達到2. I X 106細胞數(shù)/毫升，與基礎培養(yǎng)基添加10%牛血清貼壁培養(yǎng)時細胞密度一致，說明完全無血清懸浮培養(yǎng)不能很好的支持細胞生長。盡管實現(xiàn)了 Vero細胞無血清培養(yǎng)，但是其中添加成分非常昂貴，大大増加了培養(yǎng)基成本，遠遠超過基礎培養(yǎng)基添加10%牛血清的成本，不能支持細胞的生長至足夠高的水平以用于經濟的生產。因此，在培養(yǎng)基的性能和總成本兩方面仍需要改進。說明現(xiàn)階段完全摒棄血清不能夠獲得良好的Ver0細胞培養(yǎng)效果。中國專利201110231805. 3描述了 Vero細胞無血清微載體懸浮培養(yǎng)方法，其使用的培養(yǎng)基為商業(yè)化培養(yǎng)基。雖然實現(xiàn)了 Vero細胞無血清微載體懸浮培養(yǎng)，但是僅僅實現(xiàn)了5升總體積生物反應器培養(yǎng)，沒有涉及放大培養(yǎng)，并且在2克/升cytodexl微載體其僅僅實現(xiàn)了最大細胞密度I. 2X106細胞數(shù)/毫升。

發(fā)明內容
本發(fā)明主要解決的技術問題是提供ー種適用于VeiO細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基及方法，能夠不僅適合在添加痕量血清情況下Veix)方瓶靜置培養(yǎng)和滾瓶培養(yǎng)，也支持微載體懸浮培養(yǎng)和反應器微載體放大培養(yǎng)，還可以作為無血清病毒維持液實現(xiàn)無血清病 毒生產。為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的一個技術方案是提供ー種適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于包括氨基酸，無機鹽，維生素，蛋白水解物，脂類，緩沖成分和添加物(請給出幾種物質的配比比例或者整體比例范圍)。優(yōu)選的是，所述氨基酸的含量以毫克/升計為L-色氨酸5~60
L-半胱氨酸5 ~ 72
L-異亮氨酸27 ~ 175
し亮氨酸30 ~ 200
L-纈氨酸20 ~ 200
L-精氨酸鹽酸鹽48 415
L-組氨酸鹽酸鹽20~98 L-賴氨酸30 ~ 215
L-蛋氨酸22 ~ 115
L-谷氨酸4~30
L-苯丙氨酸25 ~ 196
L-天冬酰胺47 ~ 600
甘氨酸3~40
L-脯氨酸17.25 ~ 150
L-丙氨酸3~45
L-天冬氨酸3 ~ 70.5
し絲氨酸27 ~ 270
し蘇氨酸50 ~ 300
し谷氨酰胺365 一 584
L-胱氨酸鹽酸鹽32~64
し酪氨酸ニ鈉鹽56 ~ 100。
優(yōu)選的是，所述維生素的含量以毫克/升計為
維生素C0.1 ~ 15
磷酸吡哆醇0.2 ~ 2
磷酸P比哆醛0.001 ~ 0.1
鉆銨素0.03 ~ 3
煙酰胺0.1-5
核黃素0.1 ~ 0.8
鹽酸疏胺素0.2 ~ 5
氯化膽堿I ~ 8
D-泛酸鈣0.1-4
葉酸0.1 ~ 4
生物素0.003 ~ 0.1
肌醇2~10。優(yōu)選的是，所述無機鹽的含量以毫克/升計為
六水氯化鎂I ~ 60無水硫酸鎂1~60
無水氯化鈣5 ~ 160
氯化鐘50 400
氣化鈉5000 ~ 7000
づK嶙酸ニ氫鈉40-200
磷酸氫ニ鈉10 ~ 180
七水合硫酸鋅O.卜0.5
九水合硝酸鐵0.01 ~ 0.5
亞硒酸鈉0.001 ~ 0.02
五水疏酸銅0.0001 ~ 0.002。優(yōu)選的是，所述水解物含量以毫克/升計為大豆水解物500 6000優(yōu)選的是，所述脂類的含量以毫克/升計為亞油酸O. 01 O. I嵌段式聚醚F68 500 1000。優(yōu)選的是，所述緩沖劑的含量以毫克/升計為碳酸氫鈉2400 28OO羥こ基哌嗪こ磺酸2000 3800。
優(yōu)選的是，所述添加物的含量以毫克/升計為
D-葡萄糖1000 ~ 5000
丙酮酸鈉30-165
還原型谷耽甘肽 0.01 ~ 0.9次黃嘌呤納鹽0.1 ~ 5
腐胺0.08 ~ 0.4
硫辛酸0.1 ~ 0.4
重組人表皮生長因子0.00卜0.01。優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)基也可含有其他水溶性成分，包括胰島素，用于可以加強糖類的吸收；運鐵蛋白，用于轉運鐵；痕量元素如硒，作為過氧化反應保護劑；こ醇胺，作為脂質前體；類固醇激素如睪丸素；甲狀腺激素如三碘甲腺原氨酸；核酸前體如次黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷、脫氧腺苷和脫氧胞苷，以及在常規(guī)的用于細胞培養(yǎng)的補充了血清的培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基中含有的其他營養(yǎng)成分。一種用于VeiO細胞生物反應器微載體培養(yǎng)并實現(xiàn)多種方式的生物反應器放大工藝，使用適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基在T-25組織培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)Vero細胞，將在T-25組織培養(yǎng)瓶中用含10% (v/v)新生牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero細胞用O. 25% (w/v)的胰蛋白酶消化8分鐘；分別用下列表I所列的含1% (v/v)新生牛血清的低血清培養(yǎng)基和含10% (v/v)新生牛血清的MEM培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度為2. 5 X IO5細胞數(shù)/毫升。按5ml/瓶接種于T-25組織培養(yǎng)瓶，37°C、5%C02靜止培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照記錄。培養(yǎng)72小時后，VeiO細胞在本發(fā)明含1% (v/v)新生牛血清的低血清培養(yǎng)基和含10% (v/V)新生牛血清的MEM培養(yǎng)基中匯合成單細胞層；表I
權利要求
1.一種適用于VeiX)細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于包括氨基酸，無機鹽，維生素，蛋白水解物，脂類，緩沖成分和添加物。
2.根據(jù)權利要求I所述的適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于所述氨基酸的含量以毫克/升計為L-色氨酸5~60 L-半胱氨酸5 ~ 72 L-異亮氨酸27~175 L-亮氨酸30 ~ 200 L-纈氨酸20 ~ 200 L-精氨酸鹽酸鹽48 ~ 415 L-組氨酸鹽酸鹽20~98 L-賴氨酸30 ~ 215 L-蛋氨酸22-115 L-谷氨酸4 ~ 30 L-苯丙氨酸25 ~ 196 L-天冬酰胺47 ~ 600 甘氨酸3~40 L-脯氨酸17.25 ~ 150L-丙氨酸3~45L-天冬氨酸3 ~ 70.5 L-絲氨酸27 ~ 270し蘇氨酸50 ~ 300L-谷氨酰胺365 ~ 584L-胱氨酸鹽酸鹽32 ~ 64L-酪氨酸ニ鈉鹽56 ~ 100。
3.根據(jù)權利要求I所述的適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于所述維生素的含量以毫克/升計為維生素C0.1 ~ 15磷酸P比哆醇0.2 ~ 2磷酸吡哆醛0.00卜0.1鈷銨素0.03 ~ 3煙酰胺0.1-5核黃素0.1 ~ 0.8鹽酸疏胺素0.2 ~ 5氯化膽堿I ~ 8D-泛酸約0.1-4葉酸0.1 ~ 4生物素0.003 ~ 0.1肌醇2~10。
4.根據(jù)權利要求I所述的適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于所述無機鹽的含量以毫克/升計為六水氯化鎂I ~ 60無水疏酸鎂1~60無水氯化鈣5 ~ 160氯化鉀50 ~ 400氯化鈉5000 ~ 7000一水鱗酸ニ氫鈉40 ~ 200磚酸氫ニ鈉10-180七水合硫酸鋅0.1 ~0.5九水合硝酸鐵0.01 ~ 0.5亞硒酸納0.001 ~ 0.02五水硫酸銅0.0001 ~ 0.002。
5.根據(jù)權利要求I所述的適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于所述水解物含量以毫克/升計為大豆水解物500 6000。
6.根據(jù)權利要求I所述的適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基,其特征在于所述脂類的含量以毫克/升計為亞油酸O. 01 O. I嵌段式聚醚F68 500 1000。
7.根據(jù)權利要求I所述的適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于所述緩沖劑的含量以毫克/升計為碳酸氫鈉2400 2800羥こ基哌嗪こ磺酸2000 3800。
8.根據(jù)權利要求I所述的適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于所述添加物的含量以毫克/升計為D-葡萄糖1000 ~ 5000丙酮酸納30-165還原型谷胱甘肽 0.01 ~ 0.9次黃嘌呤鈉鹽0.1-5腐胺0.08 ~ 0.4硫辛酸0.1 ~ 0.4重組人表皮生長因子0.001 ~0.01。
9.根據(jù)權利要求I所述的適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基也可含有其他水溶性成分，包括胰島素，用于可以加強糖類的吸收；運鐵蛋白，用于轉運鐵；痕量元素如硒，作為過氧化反應保護劑；こ醇胺，作為脂質前體；類固醇激素如睪丸素；甲狀腺激素如三碘甲腺原氨酸；核酸前體如次黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷、脫氧腺苷和脫氧胞苷，以及在常規(guī)的用于細胞培養(yǎng)的補充了血清的培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基中含有的其他營養(yǎng)成分。
10.一種用于VeiX)細胞生物反應器微載體培養(yǎng)并實現(xiàn)多種方式的生物反應器放大工藝，其特征在于使用適用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基在T-25組織培養(yǎng)瓶中貼壁培養(yǎng)Vero細胞，將在T-25組織培養(yǎng)瓶中用含10% (v/v)新生牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero細胞用O. 25% (w/v)的胰蛋白酶消化8分鐘；分別用下列表I所列的含1% (v/v)新生牛血清的低血清培養(yǎng)基和含10% (v/v)新生牛血清的MEM培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度為2. 5X IO5細胞數(shù)/毫升。按5毫升/瓶接種于T-25組織培養(yǎng)瓶，37°C、5% CO2靜置培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照記錄。培養(yǎng)72小時后，VeiO細胞在本發(fā)明含I % (v/v)新生牛血清的低血清培養(yǎng)基和含10 % (v/v)新生牛血清的MEM培養(yǎng)基中匯合成單細胞層；表I__
11.一種用于VeiO細胞生物反應器微載體培養(yǎng)并實現(xiàn)多種方式的生物反應器放大工藝，其特征在于還包括微載體系統(tǒng)5升生物反應器消化放大培養(yǎng)至25升生物反應器，在5升反應器中微載體懸浮培養(yǎng)Veix)細胞，培養(yǎng)至72小時，微載體上的細胞用胰蛋白酶消化，補加新微載體，將消化下來的細胞和微載體混勻后打入25升生物反應器內培養(yǎng)，工作體積為18升；25升反應器反應器參數(shù)設置溫度為37°C、p小時值為7. 2、溶氧為40%飽和空氣、攪拌速度為35轉/分鐘；經過一次消化放大操作，Vero細胞在25升反應器中生長正常，培養(yǎng)96小時細胞可形成致密單層，培養(yǎng)144小時時細胞密度達到6. 5 X IO6升升升細胞數(shù)/毫升，最高密度的降低可能是消化轉移操作中微載體(微載體總量降低)損耗造成。
12.根據(jù)權利要求11所述的用于VeiO細胞生物反應器微載體培養(yǎng)并實現(xiàn)多種方式的生物反應器放大工藝，其特征在于還包括微載體系統(tǒng)25升生物反應器球轉球エ藝，在5升反應器中微載體懸浮培養(yǎng)Veix)細胞，培養(yǎng)至60小時，細胞即將長成單層，以新老微載體比例3 I向培養(yǎng)基中加入新微載體，與長滿細胞的老微載體混合，培養(yǎng)體積不變；初期進行間歇攪拌30分鐘攪拌3分鐘，攪拌轉速為30轉/分鐘，培養(yǎng)6小時，取樣觀察細胞的貼附情況，后續(xù)進行連續(xù)攪拌；連續(xù)攪拌時的反應器參數(shù)設置溫度為37°C、pH值為7. 2、溶氧為40%飽和空氣、攪拌速度為60轉/分鐘；Veix)細胞可從新微載體遷移至老微載體，將5升反應器中培養(yǎng)物轉移到25升生物反應器中并補加培養(yǎng)液至11升，整個培養(yǎng)過程持續(xù)200小時，最高細胞密度達到6. 5X IO6升升細胞數(shù)/毫升。
13.—種無血清培養(yǎng)基，其特征在于包括氨基酸、無機鹽、維生素、糖類等，其中加入了蛋白水解物成分、脂質成分和保護成分，這些物質一起提供了支持細胞生命、生長和繁殖所必需的基本營養(yǎng)成分。
14.根據(jù)權利要求13所述的ー種無血清培養(yǎng)基，其特征在于所述還包含蛋白水解物成分，該蛋白水解物不僅補償了培養(yǎng)基中氨基酸的含量，還提供了對血清或白蛋白的替代物。
15.根據(jù)權利要求14所述的ー種無血清培養(yǎng)基，其特征在于所述蛋白水解物是商業(yè)上可獲得的，包括水解乳白蛋白，大豆水解物，酪蛋白水解物，胰蛋白胨磷酸肉湯和植物水解物中的任ー種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種造用于Vero細胞微載體懸浮放大培養(yǎng)的培養(yǎng)基，包括氨基酸，無機鹽，維生素，蛋白水解物，脂類，緩沖成分和添加物。通過上述方式，本發(fā)明能夠不僅適合在添加痕量血清情況下Vero方瓶靜置培養(yǎng)和滾瓶培養(yǎng)，也支持微載體懸浮培養(yǎng)和反應器微載體放大培養(yǎng)，還可以作為無血清病毒維持液實現(xiàn)無血清病毒生產。
文檔編號C12N5/071GK102827804SQ20121031336
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權日2012年8月30日
發(fā)明者張大鶴, 滕小锘, 龔迪 申請人:蘇州市沃美生物技術有限公司