專利名稱：一種雷公藤細(xì)胞固定化的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種利用固定化載體材料固定雷公藤細(xì)胞的方法，并初步建立了最優(yōu)固定化雷公藤細(xì)胞體系。
背景技術(shù)：
雷公藤(Tripterygium wilfordii Hok . fl)是一種雙子葉木質(zhì)藤本植物,也是一種珍貴的藥用植物。分布于南方福建、江西、浙江、廣東、湖南、湖北、臺灣等省份。雷公藤提取物中含有70種以上的有效成分，主要有；生物堿類、二萜類、三萜類、倍半萜類等次生代謝物。這些成分具有解毒散結(jié)、活血化瘀、消炎、抗腫瘤、免疫調(diào)整、抗炎、抗生育、抗HIV等多種藥理作用。廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺病、腎病、皮膚病、白血病等疾病。
由于植物此生代謝產(chǎn)物具有極其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，至今仍沒有找到有效的或經(jīng)濟(jì)合成方法。近幾十年來利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究獲得了快速發(fā)展，其中固定化細(xì)胞技術(shù)在藥用植物次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)上具有極大的應(yīng)用潛力和廣闊的發(fā)展前景。微生物固定化細(xì)胞技術(shù)是20世紀(jì)80年代興起的一種生物技術(shù)。所謂固定化細(xì)胞就是指用物理或化學(xué)的手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，仍保留催化活性且在反復(fù)或連續(xù)使用后仍具有催化活力。固定化細(xì)胞保持了胞內(nèi)酶系的原始狀態(tài)和天然環(huán)境，有效地利用游離細(xì)胞的完整酶系統(tǒng)和細(xì)胞膜的選擇通透性，既具有固定化酶的優(yōu)點(diǎn)，又具有其自身的優(yōu)越性。植物細(xì)胞固定化后可以進(jìn)行高密度增殖培養(yǎng)，提高生物反應(yīng)器單位體積的生物轉(zhuǎn)化速率，延長發(fā)酵細(xì)胞的壽命，增加穩(wěn)定性，利于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)等；與懸浮培養(yǎng)相比，它還具有抗剪功能增強(qiáng)，耐受有毒前體的濃度高，易于積累和分離次生產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)。自Brodelius在1979年首次利用藻酸鈣凝膠固定化培養(yǎng)長春花生產(chǎn)次生產(chǎn)物以來，通過固定化培養(yǎng)植物細(xì)胞生產(chǎn)活性產(chǎn)物的研究取得了重大進(jìn)展。目前，國內(nèi)外已建立了包括銀杏、莨菪、長春花、紅豆杉、人參等藥用植物在內(nèi)的50余種植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)，所產(chǎn)次生代謝物包括有生物堿類、甙類、黃酮類、醌類等。上述研究證明，藥用植物細(xì)胞在固定化培養(yǎng)條件下不僅表現(xiàn)出較好的次生代謝產(chǎn)物釋放能力，而且多數(shù)活性產(chǎn)物的產(chǎn)量要高于傳統(tǒng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。因此，面臨雷公藤植物資源少、有效成分含量低的問題，本研究提出開展雷公藤固定化細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)甲素的研究，從而為甲素的高效生產(chǎn)開辟新的途徑。雷公藤甲素是雷公藤中活性最高的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，是雷公藤中主要的活性成分，可有效治療自身免疫性疾病，并具明顯的抗白血病和抗腫瘤活性，且相關(guān)藥用效價(jià)比雷公藤總苷高100-200倍。由于具有廣泛的藥理作用，雷公藤甲素已成為使用最為廣泛的雷公藤活性物質(zhì)，目前是雷公藤片、雷公多甙片等成藥制劑的主要成分。
目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)利用固定化載體對雷公藤細(xì)胞進(jìn)行固定的報(bào)道，本發(fā)明首次建立了利用固定化載體對雷公藤進(jìn)行固定的方法及體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立雷公藤細(xì)胞固定化培養(yǎng)體系，主要包含四項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，分別為(I)雷公藤細(xì)胞的培養(yǎng)與取得；(2)細(xì)胞固定化的制備；(3)固定化細(xì)胞培養(yǎng)系的建立；
(4)固定化細(xì)胞的釋放。本發(fā)明是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的
一種雷公藤細(xì)胞的固定方法，其特征在于包括以下步驟
1)雷公藤細(xì)胞的培養(yǎng)與取得摘取野生雷公藤進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)出愈傷組織并將其繼代三次以上，而后將繼代后的愈傷組織切成碎末狀，置于white培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)5 6d，獲得雷公藤懸浮細(xì)胞溶液;其中所述的white培養(yǎng)液為21. 26g white培養(yǎng)基+0. 5mLIBA+0. 5mL 2，4-D+O. Iml KT, pH=5.8 ；
2)細(xì)胞固定化的制備方法取海藻酸鈉水溶液、CaCl2水溶液、NaCl水溶液進(jìn)行滅菌處理；取出雷公藤懸浮細(xì)胞溶液，過濾后將殘?jiān)湃牒Ｔ逅徕c溶液中攪拌均勻，將攪拌均勻所得的混合溶液緩慢滴入CaCl2溶液中，使其形成圓形的凝膠珠，將凝膠珠在CaCl2水溶液中浸泡一小時(shí)，之后將浸泡的CaCl2溶液倒掉，加入NaCl水溶液洗滌一至兩分鐘，重復(fù)洗滌三次；所述的海藻酸鈉水溶液濃度為30g/L;所述CaCl2水溶液濃度為8g/L;所述NaCl水溶液濃度為9g/L;
3)固定化細(xì)胞培養(yǎng)體系建立將洗滌后的凝膠珠放入如步驟I)所述的white培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)24d,每12d繼代一次；
4)固定化細(xì)胞的釋放將步驟3)中培養(yǎng)完成后的培養(yǎng)液進(jìn)行過濾，過濾出來的凝膠珠放入O. lmol/L, PH=7. 8磷酸緩沖液中振蕩，待凝膠珠溶散后，再次過濾，過濾后的殘?jiān)吹美坠偌?xì)胞。其中，步驟I)與步驟3)中振蕩培養(yǎng)的條件均為在25 °C、黑暗條件、振蕩速率為110r/mino本發(fā)明公開了一種利用固定化載體材料固定雷公藤(Tripterygium wilfordiiHok . Π)細(xì)胞的方法，并初步建立了最優(yōu)固定化雷公藤細(xì)胞體系。該體系的建立，對于雷公藤甲素的高效生產(chǎn)開辟新的途徑。實(shí)驗(yàn)證明固定化雷公藤細(xì)胞能夠富集大量的雷公藤甲素。說明書附圖

圖I和圖2 :雷公藤固定化細(xì)胞的效果。
具體實(shí)施例方式現(xiàn)舉例說明本發(fā)明，但本發(fā)明內(nèi)容不限于此。實(shí)施例I
①雷公藤細(xì)胞的培養(yǎng)與取得摘取野生雷公藤進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)出愈傷組織繼代三次以上，而后取生長勢頭良好的愈傷組織進(jìn)行稱量、切碎，取O. Sg置于盛有white培養(yǎng)液(white 培養(yǎng)基21. 26g white 培養(yǎng)基 +0. 5mL IBA+0. 5mL 2，4-D+O. Iml KT, pH=5. 8。)的250ml的三角瓶中，25 1黑暗條件下的振蕩培養(yǎng)箱中以llOr/min的速率振蕩培養(yǎng)6d，得到懸浮細(xì)胞。②細(xì)胞固定化的制備方法取30g/L海藻酸鈉水溶液、8g/L CaCl2水溶液；9g/LNaCl水溶液進(jìn)行滅菌處理。將懸浮細(xì)胞過濾后，取濾渣放入IOOmL滅菌后的海藻酸鈉水溶液中攪拌均勻，將混合物吸入注射器中，再由注射器緩慢滴入CaCl2溶液中，使其形成圓形凝膠珠，滴完后凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡一小時(shí)，然后將浸泡的CaCl2溶液倒掉，加入NaCl溶液洗滌一至兩分鐘，將水倒掉，重復(fù)三次。③固定化細(xì)胞培養(yǎng)體系建立將洗滌完的凝膠珠放入盛有如步驟①所述的white培養(yǎng)液的250ml的三角瓶中，放入設(shè)置為110r/min ,25 °C黑暗條件下的振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。為避免培養(yǎng)液中的營養(yǎng)都被消耗完，需要每12d繼代一次。繼代一次后取出。④固定化細(xì)胞的釋放將步驟③中繼代完成后的三角瓶中的物質(zhì)進(jìn)行過濾，過濾出的凝膠珠的放入O. lmol/L, PH=7. 8磷酸緩沖液中振蕩處理，待凝膠珠溶散后再次過濾，過濾后的殘洛即為雷公藤細(xì)胞。雷公藤固定化細(xì)胞的效果如圖I所示。
由實(shí)施例I得到的雷公藤甲素的測定
在步驟④中，過濾出來的培養(yǎng)液用O. 22 μ m有機(jī)系微孔濾頭濾至離心管，留待測雷公藤甲素。將雷公藤細(xì)胞，進(jìn)行研磨，加入5ml甲醇，移至離心管，放至10小時(shí)，在4°C條件下，8000r/min離心10分鐘，沉淀后，取上清液，留待測雷公藤甲素。利用高效液相色譜分別對固定化細(xì)胞外的培養(yǎng)液及固定化細(xì)胞內(nèi)的雷公藤甲素濃度進(jìn)行檢測，雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司。液相色譜儀的參數(shù)設(shè)置為流動相為60%甲醇，40%水；流速為lmL/min，檢測波長208nm。檢測前將流動相，超純水，甲素標(biāo)準(zhǔn)溶液和發(fā)酵液樣品預(yù)先超聲波處理半小時(shí)。所得的雷公藤固定化細(xì)胞中胞內(nèi)與胞外的雷公藤甲素的含量如表I所示。從中可知，固定化雷公藤細(xì)胞能夠富集大量的雷公藤甲素。表I雷公藤固定化細(xì)胞甲素含量
權(quán)利要求
1.一種雷公藤細(xì)胞的固定方法，其特征在于包括以下步驟 1)雷公藤細(xì)胞的培養(yǎng)與取得摘取野生雷公藤進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)出愈傷組織并將其繼代三次以上，而后將繼代后的愈傷組織切成碎末狀，置于white培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)5 6d,獲得雷公藤懸浮細(xì)胞溶液;其中所述的white培養(yǎng)液為21. 26g white培養(yǎng)基+0. 5mLIBA+0. 5mL 2，4-D+O. Iml KT, pH=5.8 ； 2)細(xì)胞固定化的制備方法取海藻酸鈉水溶液、CaCl2水溶液、NaCl水溶液進(jìn)行滅菌處理；取出雷公藤懸浮細(xì)胞溶液，過濾后將殘?jiān)湃牒Ｔ逅徕c溶液中攪拌均勻，將攪拌均勻所得的混合溶液緩慢滴入CaCl2溶液中，使其形成圓形的凝膠珠，將凝膠珠在CaCl2水溶液中浸泡一小時(shí)，之后將浸泡的CaCl2溶液倒掉，加入NaCl水溶液洗滌一至兩分鐘，重復(fù)洗滌三次；所述的海藻酸鈉水溶液濃度為30g/L;所述CaCl2水溶液濃度為8g/L;所述NaCl水溶液濃度為9g/L; 3)固定化細(xì)胞培養(yǎng)體系建立將洗滌后的凝膠珠放入如步驟I)所述的white培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)24d,每12d繼代一次； 4)固定化細(xì)胞的釋放將步驟3)中培養(yǎng)完成后的培養(yǎng)液進(jìn)行過濾，過濾出來的凝膠珠放入0. lmol/L, PH=7. 8磷酸緩沖液中振蕩，待凝膠珠溶散后，再次過濾，過濾后的殘?jiān)吹美坠偌?xì)胞。
2.如權(quán)利要求I所述的一種雷公藤細(xì)胞的固定方法，其特征在于步驟I)與步驟3)中振蕩培養(yǎng)的條件均為在25 °C、黑暗條件、振蕩速率為110r/min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雷公藤細(xì)胞固定化的構(gòu)建的方法。通過對雷公藤細(xì)胞的培養(yǎng)與取得、細(xì)胞固定化的制備建立固定化細(xì)胞培養(yǎng)系。本發(fā)明主要包含四項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，分別為(1)雷公藤細(xì)胞的培養(yǎng)與取得；(2)細(xì)胞固定化的制備；(3)固定化細(xì)胞培養(yǎng)系的建立；(4)固定化細(xì)胞的釋放。通過對本發(fā)明產(chǎn)生的雷公藤固定化細(xì)胞進(jìn)行雷公藤甲素含量的測定，發(fā)現(xiàn)固定化細(xì)胞內(nèi)雷公藤甲素的含量高達(dá)56.5591μg/g，而雷公藤固定化細(xì)胞外的溶液中雷公藤甲素的含量高達(dá)2.6218mg/L，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N11/10GK102807974SQ20121028256
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月10日
發(fā)明者封磊, 萬曉琦, 洪偉, 吳承禎, 宋萍 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)