專利名稱：微生物轉化葡萄糖制備木糖醇及其中間體d-木酮糖的方法及所用的菌種的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種木糖醇中間體一D-木酮糖的制備方法、利用該中間體制備木糖醇的方法以及所用到的菌種，具體涉及一種以葡萄糖為原料通過微生物轉化制備D-木酮糖及木糖醇的方法以及所用的菌種。
背景技術：
木糖醇屬于五碳多元醇，是一種天然甜味劑。木糖醇不被口腔中細菌利用，具有優(yōu)良的防齲齒功能。另一方面，木糖醇無需胰島素參與，可直接進入人體細胞進行代謝補充能量，不會引起血糖升高，可減輕糖尿病人多飲多食多尿癥狀。木糖醇甜度和蔗糖相當，但具有比蔗糖更低的卡路里；與其他糖醇相比，它具有最高的溶解熱，食用有清涼感，因此木糖 醇是一種理想的蔗糖替代品，近年來廣泛應用于口香糖、牙膏、無糖食品、醫(yī)藥等領域。
目前木糖醇的生產(chǎn)方法可分為以下兩種
I.化學合成法是工業(yè)上常用的生產(chǎn)木糖醇的方法，其基本原理為多縮戊糖經(jīng)酸水解得到木糖，木糖在鎳的催化作用下氫化生成木糖醇，該方法雖然原料易得，但是其工藝復雜、副產(chǎn)物多、分離提純困難、對設備要求高、過程中消耗大量的酸堿和產(chǎn)生大量廢棄物、污染環(huán)境嚴重，導致目前木糖醇價格較高，這也在一定程度上限制了木糖醇的廣泛應用。2.生物轉化法根據(jù)原料不同分為(I)以木糖為原料將農(nóng)業(yè)廢棄物如玉米芯、稻草、甘蔗渣等中的木聚糖經(jīng)稀酸水解后，得到主要產(chǎn)物為木糖的水解液，然后利用微生物發(fā)酵水解液中的木糖生成木糖醇，但該法發(fā)酵液木糖醇含量很低，分離提取成本仍然很高，不具有工業(yè)化意義；(2)以葡萄糖為原料D-葡萄糖在耐高滲酵母的作用下轉化成D-阿拉伯糖醇，接著D-阿拉伯糖醇在氧化葡糖桿菌的作用下氧化成D-木酮糖，最后D-木酮糖通過酵母(Candida guilliermodii)的還原作用生成木糖醇,又稱為三步發(fā)酵法。但該法第一步發(fā)酵中，產(chǎn)物阿拉伯糖醇會有明顯的產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，導致阿拉伯糖醇濃度偏低，此外第三步酵母轉化D-木酮糖為木糖醇效率更低，產(chǎn)物濃度不超過30g/L。因此，目前生物轉化生產(chǎn)木糖醇主要存在的問題是葡萄糖轉化生成阿拉伯糖醇和D-木酮糖轉化生產(chǎn)木糖醇效率低下。專利EP403392A和專利EP421882A公開了這樣的方法，先用耐高滲酵母生產(chǎn)阿拉伯糖醇，然后通過采用醋酸桿菌屬、葡糖桿菌屬、克雷白氏桿菌屬的細菌將阿拉伯糖醇轉化為D-木酮糖，通過葡萄糖(木糖)異構酶作用轉化D-木酮糖為D-木糖和D-木酮糖的混合液，上面混合液氫化得到木糖醇。這種方法雖然解決了生物法轉化D-木酮糖為木糖醇效率低下的問題，但是耐高滲酵母生成阿拉伯糖醇低效率問題仍然存在，使得該方法生產(chǎn)成本仍然高于化學合成法。生物轉化葡萄糖生產(chǎn)木糖醇工藝中，采用耐高滲酵母轉化葡萄糖產(chǎn)生阿拉伯糖醇，阿拉伯糖醇會對菌體產(chǎn)生抑制現(xiàn)象，導致中后期阿拉伯糖醇生成速度降低。耐高滲酵母轉化葡萄糖為阿拉伯糖醇最適PH 4. 5-5. 5，溫度為30-35°C，需要酵母膏、MgSO4, KH2PO4等作為營養(yǎng)成分；而氧化葡糖桿菌轉化阿拉伯糖醇生成D-木酮糖速率很快，150 g/L阿拉伯糖醇約20-30 h即可轉化完，最適pH 5. 0-5. 5，溫度為30-35°C，需要酵母膏、MgSO4、KH2PO4等作為營養(yǎng)成分。從以上可以看出耐高滲酵母和氧化葡糖桿菌的生長及生物轉化條件基本一致，利用這一特性，專利CN200410031949. 4中嘗試采用微生物混菌發(fā)酵生成木糖醇的方法，該方法先分別培養(yǎng)釀酒酵母和氧化葡糖桿菌種液，然后將兩者同時接種發(fā)酵液混合培養(yǎng)，底物葡萄糖約為160 g/L，最終發(fā)酵液木糖醇濃度約為30 g/L，轉化效率仍然很低。綜上所述，化學合成法生產(chǎn)木糖醇，酸堿和能耗消耗較大，環(huán)境污染嚴重；生物轉化法生產(chǎn)木糖醇，條件溫和，對環(huán)境影響較小，是未來木糖醇生產(chǎn)技術的趨勢，但由于其生產(chǎn)木糖醇的效率低，不具有工業(yè)化價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中葡萄糖轉化成阿拉伯糖醇效率低下的缺陷，提供了一種微生物轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法，該方法可以解除阿拉伯糖醇的反饋抑制，使最終D-木酮糖的產(chǎn)率得到有效的提高。 本發(fā)明還提供了利用上述方法制得的D-木酮糖制備木糖醇的方法，該方法所得
木糖醇產(chǎn)率顯著提高。本發(fā)明還提供了轉化葡萄糖為阿拉伯糖醇的耐高滲酵母菌種一奧默柯達酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123 CGMCC NO. 6197。發(fā)明人通過實驗研究發(fā)現(xiàn)耐高滲酵母前期轉化葡萄糖生成阿拉伯糖醇的效率較高，隨著阿拉伯糖醇濃度的增加，轉化速率下降，如果前期加入高濃度的阿拉伯糖醇，耐高滲酵母前期轉化葡萄糖生成阿拉伯糖醇速率也很慢，表明阿拉伯糖醇對耐高滲酵母有反饋抑制作用；另一方面，氧化葡糖桿菌在高葡萄糖濃度條件下，轉化阿拉伯糖醇生成D-木酮糖的速率很慢，分析發(fā)現(xiàn)以上因素是導致耐高滲酵母和氧化葡糖桿菌混菌發(fā)酵效率不高的原因。在研究過程中，發(fā)明人嘗試了先培養(yǎng)耐高滲酵母發(fā)酵葡萄糖轉化為阿拉伯糖醇，中后期接種氧化葡糖桿菌、并且控制葡萄糖濃度在10 g/L以下的方式制備D-木酮糖，發(fā)現(xiàn)采用這種方式的混菌發(fā)酵可以解除阿拉伯糖醇的反饋抑制，顯著提高葡萄糖轉化為D-木酮糖的效率。發(fā)明人進一步的進行了研究，得到了生產(chǎn)D-木酮糖的技術方案，如下所示
一種微生物轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法，以D-葡萄糖為原料，通過將可轉化葡萄糖為阿拉伯糖醇的耐高滲酵母和可轉化阿拉伯糖醇為D-木酮糖的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)混菌發(fā)酵得含有D-木酮糖發(fā)酵液,發(fā)酵液經(jīng)進一步處理得D-木酮糖，其特征是，混菌發(fā)酵包括以下步驟首先，分別制備耐高滲酵母種液和氧化葡糖桿菌種液，然后先將耐高滲酵母種液接種到含葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，將葡萄糖轉化為阿拉伯糖醇，在耐高滲酵母發(fā)酵中后期再將氧化葡糖桿菌種液接種到發(fā)酵液中，同時控制發(fā)酵液中葡萄糖含量為5-10 g/L，繼續(xù)發(fā)酵將阿拉伯糖醇轉化為D-木酮糖，得含有D-木酮糖的發(fā)酵液。上述制備D-木酮糖方法的主要創(chuàng)新點是將混菌發(fā)酵的方法由原先的將兩種菌種培養(yǎng)液同時加入含葡萄糖培養(yǎng)基中進行混菌發(fā)酵，使葡萄糖轉化成阿拉伯糖醇和阿拉伯糖醇轉化為D-木酮糖的方式變?yōu)橄仍谄咸烟侵薪臃N耐高滲酵母轉化葡萄糖為阿拉伯糖醇，在發(fā)酵中后期再接種氧化葡糖桿菌進行發(fā)酵將阿拉伯糖醇轉化為D-木酮糖，控制過程中葡萄糖的濃度10g/L左右，解除阿拉伯糖醇的反饋抑制作用，以提高阿拉伯糖醇的轉化率，提高D-木酮糖的產(chǎn)率。圖2為微生物混菌發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇中間體(D-木酮糖)典型過程曲線圖，從圖中可以看出耐高滲酵母接種后，OD值(菌體量)迅速增加，20 h時進入穩(wěn)定期，與此同時，阿拉伯糖醇開始生成；在20-80 h，菌體生長緩慢，葡萄糖快速消耗，阿拉伯糖醇快速生成；在80h接種氧化葡糖桿菌后，菌體出現(xiàn)二次生長，阿拉伯糖醇含量迅速下降，100 h時降到3 g/L,此后一直保持較低水平，過程中D-木酮糖含量迅速升高，直到發(fā)酵140 h后OD值下降，D-木酮糖生產(chǎn)速率逐漸下降，發(fā)酵150 h,發(fā)酵液中D-木酮糖含量148 g/L。上述方法中，所用的耐高滲酵母和氧化葡糖桿菌可以是現(xiàn)有技術中公開的可用于葡萄糖轉化為D-木酮糖的所有耐高滲酵母菌種和氧化葡糖桿菌菌種，例如專利EP403392A、專利EP421882A和專利CN200410031949. 4中公開的菌種，只要按照本發(fā)明的方式進行混菌發(fā)酵均可起到解除阿拉伯糖醇反饋抑制、提高葡萄糖轉化為D-木酮糖效率的目的。在使用現(xiàn)有技術公開的菌種，其培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件根據(jù)現(xiàn)有技術公開的內(nèi)容即可實現(xiàn)。 進一步的，上述方法中，可轉化葡萄糖為阿拉伯糖醇的耐高滲酵母優(yōu)先選用發(fā)明人自行篩選的奧默柯達酵母(Kodamaea ohmeri)TL-1123,該TL-1123菌種已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期為2012年6月6日，保藏編號為CGMCCNO. 6197。該菌種能夠耐高滲、耐高溫，在200 g/L葡萄糖和35°C條件下可以正常生長繁殖，能夠高效轉化葡萄糖生成阿拉伯糖醇，轉化率可達44%，發(fā)酵液中D-木酮糖的含量可達150g/L。該菌種篩選過程為
①將桃樹、南瓜、西瓜花粉等樣品，在無菌條件下接入富集培養(yǎng)基中(2 X 25 cm試管，裝液量10 mL)于35 ° C，220 r/min下培養(yǎng)2 4 d。富集培養(yǎng)基組成(g噸―1):葡萄糖50，酵母膏3，蛋白胨3。②用移液槍以10%接種量移將①中的培養(yǎng)液轉接入裝有10 mL的富集培養(yǎng)基搖管中培養(yǎng)廣3天，如此重復3 4次，將菌液稀釋涂布于分離培養(yǎng)基中進行平皿分離，于35° C下培養(yǎng)2 4 d。平板分離和斜面保藏培養(yǎng)基組成(g · Γ1):富集培養(yǎng)基+瓊脂20。③將分離獲得的單菌落擴大培養(yǎng)，于30 ° C下培養(yǎng)2 4 d后，分別接入裝有50 mL初篩發(fā)酵培養(yǎng)液的三角瓶內(nèi)(250 mL搖瓶裝50 mL發(fā)酵液)，35 ° C下培養(yǎng)3 d，發(fā)酵培養(yǎng)結束后，檢測D-阿拉伯糖醇含量，留取產(chǎn)率較高的菌株進行復篩。初篩發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g · L-1):葡萄糖50，酵母膏3，蛋白胨3，CaC0315。④將復篩菌株接入裝有50 mL復篩發(fā)酵培養(yǎng)液的250 mL三角瓶內(nèi)，35 ° C下培養(yǎng)3 d，發(fā)酵培養(yǎng)結束后，檢測D-阿拉伯糖醇含量，選取阿拉伯糖醇產(chǎn)率高的菌株進行進一步發(fā)酵實驗和菌種鑒定實驗。復篩發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g ·Ι^):葡萄糖200，酵母膏3，蛋白胨 3，CaCO315 ο進一步的，上述方法中，可轉化阿拉伯糖醇為D-木酮糖的氧化葡糖桿菌優(yōu)選專利CN200910024579. 4 中公開的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans) NH-10,保藏號CGMCCNo.2709。進一步的，上述方法中，混菌發(fā)酵具體包括以下步驟首先，分別制備耐高滲酵母種液和氧化葡糖桿菌種液，然后按5-15%的接種量，先將耐高滲酵母種液接種到含有葡糖糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在100-200 rpm，通氣比為O. 3-0. 8 L/L*min，30_35°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)65-85 h，將葡萄糖轉化為阿拉伯糖醇；然后再將氧化葡糖桿菌種液按5-15%的接種量接種到發(fā)酵液中，在100-200 rpm，通氣比為O. 3-0. 8 L/L*min，30_35°C條件下繼續(xù)發(fā)酵，同時在發(fā)酵液中流加葡萄糖和堿性物質溶液(堿性物質溶液為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀等的水溶液)，使發(fā)酵液中葡萄糖含量為5-10 g/L、pH為4. 6-5. 4，整個發(fā)酵時間持續(xù)130-150 h后停止補充葡萄糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗盡后停止發(fā)酵，得含有D-木酮糖的發(fā)酵液。進一步的，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖120-160 g/L，玉米漿5-10 g/L，酵母膏3-5g/L, KH2PO4 3-4 g/L, MgSO4 O. 5-1. 5 g/L, pH 5. 0-5. 5。進一步的，耐高滲酵母種子液采用下述方法制備取一接種環(huán)斜面保存的耐高滲酵母菌種，接種在種子培養(yǎng)基A中，在100-250 rpm、30_35°C條件下培養(yǎng)10-20 h，得一級種液，將所得一級種液按5-15%的接種量接種到種子培養(yǎng)基A中，在100-200 rpm、通氣比為 O.3-0. 8 L/L*min、30-35°C條件下擴大培養(yǎng)12-20 h，得耐高滲酵母種液；種子培養(yǎng)基A組成為葡萄糖 60-80 g/L,玉米衆(zhòng) 5-10 g/L,酵母膏 3-5 g/L, MgSO4 O. 5-1. 5 g/L,自然 pH;
氧化葡糖桿菌種子液采用下述方法制備將一支氧化葡糖桿菌斜面上的全部菌體接種到種子培養(yǎng)基B中，在100-250 rpm、30-35°C條件下培養(yǎng)16-24 h，得一級種液，將所得一級種液按5-15%的接種量接種到種子培養(yǎng)基B中，在100-200 rpm、通氣比為O. 3-0. 8 L/L*min、30-35°C條件下擴大培養(yǎng)16-20 h，得氧化葡糖桿菌種液；種子培養(yǎng)基B組成為阿拉伯糖醇 100-120 g/L，酵母膏 5-10 g/L，碳酸鈣 O. 5-1. 5 g/L, pH 5. 1-5.4。進一步的，上述方法中，含D-木酮糖發(fā)酵液的后處理過程為將發(fā)酵液經(jīng)板框過濾、超濾膜超濾、活性炭脫色和離子交換除去菌體和雜質，然后濃縮、結晶得D-木酮糖，更具體的為將發(fā)酵液采用板框過濾除菌、再用截留分子量為1000-3000 Da的超濾膜過濾，然后用活性碳脫色和離子交換處理。再將離子交換后的發(fā)酵液濃縮至干物質含量為80-95%，然后降溫至40-55°C，向濃縮液中加入干物質含量2_4%的D-木酮糖作為晶種，再自然降溫至室溫進行結晶，結晶后離心，得到D-木酮糖。上述制得D-木酮糖為木糖醇制備的中間體，可以用上述方法制得的D-木酮糖進一步的制備木糖醇，步驟為以葡糖糖為原料，通過上述混菌發(fā)酵的方法制得的D-木酮糖進一步的采用現(xiàn)有技術還原為木糖醇，即得。將D-木酮糖還原為木糖醇的技術有很多，例如可以采用酵母(Candidaguilliermodii)的還原作用將D-木酮糖還原為木糖醇，也可以采用木糖異構酶(也叫葡萄糖異構酶，下同)先轉化D-木酮糖為D-木糖和D-木酮糖的混合液，然后將D-木糖分離、氫化得到木糖醇。上述現(xiàn)有技術均可用于本發(fā)明中將D-木酮糖還原為木糖醇，但是優(yōu)選采用木糖異構酶轉化D-木酮糖生成D-木糖，采用木糖異構酶所得木糖醇效率更高一些，更加利于工業(yè)化大生產(chǎn)。本發(fā)明制備木糖醇的方法優(yōu)選采用混菌發(fā)酵制備D-木酮糖和采用木糖異構酶轉化D-木酮糖這兩者結合的方式進行，所得木糖醇產(chǎn)率大大提高，優(yōu)選方法方案如下
一種微生物轉化葡萄糖制備木糖醇的方法，以葡糖糖為原料，采用上述微生物轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法將葡萄糖轉化為D-木酮糖，采用木糖異構酶將D-木酮糖轉化為D-木糖和D-木酮糖的混合液，然后將D-木糖分離、氫化得到木糖醇，包括以下步驟①D-木酮糖的制備采用上述微生物混菌培養(yǎng)轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法制備D-木酮糖；
②D-木糖的制備將步驟①中的D-木酮糖配成水溶液，在木糖異構酶的作用下制得含有D-木酮糖和D-木糖的異構糖液；
③D-木糖的提取精制利用模擬移動床裝置處理步驟②中的異構糖液，將D-木酮糖和D-木糖分離得到富含D-木酮糖組分和富含D-木糖組分，將富含D-木糖組分過離子交換樹脂除去雜質，然后濃縮、結晶，得D-木糖；富含D-木酮糖組分進入步驟②中套用；
④木糖醇的制備將步驟③中的D-木糖配成水溶液，在催化劑存在下進行加氫反應，得到木糖醇溶液；
⑤木糖醇的提取精制將木糖醇反應液過濾除去催化劑、過離子交換樹脂除去雜質，然后濃縮、結晶，得D-木糖醇。
進一步的，D-木糖的制備具體包括以下步驟將步驟①中的D-木酮糖配成35-45%的水溶液，調節(jié)PH為8. 0-8. 3，再向水溶液中加入硫酸鎂和SO2，至硫酸鎂在水溶液中的濃度為43-48 mg/L、S02在水溶液中的濃度為95-120 mg/L，然后將D-木酮糖水溶液以2_4 m3/h流速流過酶異構柱，異構柱含木糖異構酶200-400公斤，反應溫度55-60°C，得含有D-木酮糖和D-木糖的異構糖液；
進一步的，D-木糖的提取精制具體包括以下步驟以鈣型陽離子交換樹脂作為吸附齊U，以水為洗脫劑，在50-65°C下利用模擬移動床裝置處理步驟②中的異構糖液，得到富含D-木酮糖組分和富含D-木糖組分，將富含木糖組分按常規(guī)方式進行活性炭脫色、板框過濾和過離子交換樹脂除去雜質，濃縮至干物質含量為75-90%以上，然后自然降溫至40-60°C，向濃縮液中加入干物質含量3-5%的D-木糖作為晶種，再自然降溫至室溫進行結晶，結晶后將晶體離心，得到D-木糖；富含D-木酮糖組分進入步驟②中套用。去除雜質時使用的離子交換樹脂有陽離子型離子交換樹脂和陰離子型離子交換樹脂，其中，陽離子型離子交換樹脂優(yōu)選大孔強酸苯乙烯-二乙烯苯系樹脂和大孔弱酸丙烯酸-二乙烯苯系樹脂，陰離子型離子交換樹脂優(yōu)選大孔弱堿苯乙烯系樹脂和大孔強堿型苯乙烯系樹脂。進一步的，木糖醇的制備具體包括以下步驟將步驟③中的D-木糖配成40-50%的水溶液，加入水溶液重量O. 3-0. 8%的雷尼鎳或雷尼釕作為催化劑，在140-170°C，7. 2-8. OMpa氫氣壓力下進行加氫反應，反應2-4 h，得到木糖醇溶液。進一步的，木糖醇的提取精制具體包括以下步驟將木糖醇溶液按常規(guī)方式進行活性炭脫色、板框過濾和過離子交換樹脂除去雜質，濃縮至干物質含量為75-90%以上，然后自然降溫至40-60°C，向濃縮液中加入干物質含量2-4%的木糖醇作為晶種，然后降溫至室溫進行結晶，結晶后將晶體離心，55-75°C烘干，得D-木糖醇。去除雜質時使用的離子交換樹脂有陽離子型離子交換樹脂和陰離子型離子交換樹脂，其中，陽離子型離子交換樹脂優(yōu)選大孔強酸苯乙烯-二乙烯苯系樹脂和大孔弱酸丙烯酸-二乙烯苯系樹脂，陰離子型離子交換樹脂優(yōu)選大孔弱堿苯乙烯系樹脂和大孔強堿型苯乙烯系樹脂。本發(fā)明具有以下優(yōu)點
I、將制備D-木酮糖的混菌發(fā)酵技術進行了改進，先接種耐高滲酵母進行阿拉伯糖醇發(fā)酵，然后在發(fā)酵中后期再接種氧化葡糖桿菌，解除了阿拉伯糖醇的反饋抑制，比現(xiàn)有技術中同時接種耐高滲酵母和氧化葡糖桿菌的方法轉化效率高，提高了 D-木酮糖的產(chǎn)率；一步發(fā)酵即可將葡萄糖轉化為D-木酮糖，比現(xiàn)有技術中先用耐高滲酵母制備阿拉伯糖醇，再用阿拉伯糖醇制備D-木酮糖的二步發(fā)酵法操作簡單，周期短，節(jié)約了原料，降低了能耗。2、優(yōu)選使用自行篩選的奧默柯達酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123作為耐高滲酵母，該菌株耐高滲、耐高溫，在200 g/L葡萄糖和35°C條件下正常生長繁殖，能夠高效轉化葡萄糖生成阿拉伯糖醇，轉化率可達44%，發(fā)酵液中D-木酮糖的含量可達150 g/L。3、利用混菌發(fā)酵方法制得的D-木酮糖制備木糖醇提高了生產(chǎn)效率，降低了成本。進一步的，優(yōu)選采用木糖異構酶制備木糖醇的方法，效率進一步提高，在實際生產(chǎn)中更易于操作和實現(xiàn)。


為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結合附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中
圖I為本發(fā)明所述的微生物轉化葡萄糖制備木糖醇及其中間體D-木酮糖工藝流程
圖2為微生物混菌發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇中間體(D-木酮糖)典型過程曲線圖。保藏信息
本發(fā)明所用耐高滲酵母奧默柯達酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期為2012年6月6日，保藏編號為CGMCCNO. 6197。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體工藝條件、物料配比及其結果僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所描述的本發(fā)明。下述實施例中，所用耐高滲酵母為奧默柯達酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123,保藏編號CGMCC NO. 6197 ;所用氧化葡糖桿菌為氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)NH-10，保藏編號CGMCC NO. 2079，已在專利CN200910024579. 4中公開。因此，本發(fā)明所用菌種滿足公開充分的要求。奧默柯達酵母和氧化葡糖桿菌用斜面在4°C下進行保存，奧默柯達酵母保藏斜面培養(yǎng)基組成(g/L):葡萄糖50，酵母膏3，蛋白胨3，瓊脂20，自然pH;氧化葡糖桿菌保藏斜面培養(yǎng)基組成(g/L):阿拉伯糖醇80，酵母膏5，蛋白胨3，碳酸鈣1，瓊月旨 20，pH 5. 2。下述實施例中，除去雜質所用的陽離子交換樹脂為Amberlite IRC50與AmberliteFPC22Na的混合物，陰離子交換樹脂為Amberlite FPA51與Amberlite FPA90CI的混合物，木糖異構酶，也稱為葡萄糖異構酶，采用糖醇工業(yè)常用的固定化葡萄糖異構酶。實施例I
(I)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基A組成為葡萄糖80 g/L，玉米漿10 g/L，酵母膏3 g/L, MgSO4
0.5 g/L,自然pH ;種子培養(yǎng)基B組成為阿拉伯糖醇120 g/L，酵母膏10 g/L，碳酸鈣I. 5g/L, pH 5. 2 ;發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖160 g/L，玉米漿10 g/L，酵母膏3 g/L, KH2PO4 3g/L, MgSO4 0. 5 g/L, pH 5· 0。
(2)種子液制備a)奧默柯達酵母(Kodamaea ohmeri) TL_1123種子液從斜面上取一環(huán)菌，接種在搖瓶中(培養(yǎng)基A)，裝液量15%，250 rpm，35°C培養(yǎng)16 h作為酵母搖瓶種液(即為一級種子液，下同)，然后按10%接種量將酵母搖瓶種液接種在100 L發(fā)酵罐種液中(培養(yǎng)基A)，裝液量60%，通氣比為O. 5 L/L*min,150 rpm，35°C擴大培養(yǎng)14 h作為酵母擴培種液(即耐高滲酵母種子液，下同);b)氧化葡糖桿菌種子液從一支氧化葡糖桿菌斜面上洗脫全部菌落，接種在搖瓶中(培養(yǎng)基B)，裝液量15%，250 rpm，35°C培養(yǎng)16 h作為氧化葡糖桿菌搖瓶種液(即為一級種子液，下同)，然后按10%接種量將氧化葡糖桿菌搖瓶種液接種在100 L發(fā)酵罐種液中(培養(yǎng)基B)，裝液量60%，通氣比為O. 5 L/L*min,200 rpm，35°C擴大培養(yǎng)16 h作為氧化葡糖桿菌擴培種液(即為氧化葡糖桿菌種子液，下同)。(3)混菌發(fā)酵按10%接種量，先將酵母擴培種液接種在Im3發(fā)酵罐(發(fā)酵培養(yǎng)基)中，裝液量60%，200 rpm，通氣比為O. 5 L/L*min，35°C發(fā)酵培養(yǎng)85 h，然后按10%接種量，再將氧化葡糖桿菌擴培種液接種在發(fā)酵液中繼續(xù)混菌發(fā)酵，過程中流加葡萄糖和10wt%Na2C03溶液，150 rpm，通氣比為0.5 L/L*min，控制發(fā)酵液中葡萄糖含量在5 g/L, pH在5.1，發(fā)酵145 h (酵母發(fā)酵+氧化葡糖桿菌發(fā)酵共145h，下同)，停止補糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗盡下罐，液相檢測發(fā)酵液中D-木酮糖的含量為148. 3 g/L,葡萄糖對D-木酮糖的轉化率為·43. 2%。(4) D-木酮糖的提取精制將發(fā)酵液首先采用常規(guī)方式板框過濾除菌，再采用截留分子量為1000 Da的超濾膜過濾，然后進行活性碳脫色和離子交換。再濃縮至干物質含量為80%，然后降溫至40°C，向濃縮液中加入干物質含量2%的D-木酮糖作為晶種，再自然降溫至室溫進行結晶，結晶后離心，得到D-木酮糖。(5)酶轉化將精制D-木酮糖配成35-45%的水溶液，調節(jié)pH為8. 0-8. 3，再向水溶液中加入硫酸鎂和SO2,至硫酸鎂在水溶液中的濃度為48 mg/L、SO2在水溶液中的濃度為95 mg/L ,D-木酮糖水溶液以2 m3/h流速流過酶異構柱,異構柱含木糖異構酶300公斤,反應溫度60°C，得含有D-木酮糖和D-木糖的異構糖液；(液相檢測含有D-木酮糖43. 5%和D-木糖 55. 2%,寡糖 I. 3%)ο(6)木糖提取精制利用12柱模擬移動床裝置處理異構糖液，分離D-木酮糖和D-木糖；以鈣型陽離子交換樹脂作為吸附劑，以水為洗脫劑，在65°C下連續(xù)進料、進水、出料，得到富含D-木酮糖組分(D-木酮糖純度91. 1%，濃度25. 56%)和富含D-木糖(D-木糖純度95. 3%，濃度29. 65%)組分；將富含木糖組分以常規(guī)方式過離子交換樹脂，去除雜質，然后濃縮至干物質含量為80%，自然降溫至50°C，向濃縮液中加入相對干物質含量3%的木糖晶種，自然降溫至室溫，離心，得到結晶D-木糖；富含木酮糖組分返到步驟(5)進行酶異構。(7)氫化將結晶木糖配成45%溶液，以溶液重量O. 3 %加入雷尼鎳，在150°C，8.0Mpa氫氣壓力下，進行加氫反應，反應時間3 h，得到木糖醇溶液。(8)木糖醇的提取精制將木糖醇溶液按常規(guī)方式進行活性炭脫色、板框過濾和過離子交換樹脂去除雜質，濃縮至干物質含量為84%，然后自然降溫至40°C，向濃縮液中加入相對干物質含量4%的木糖醇作為晶種，然后自然降溫至室溫進行結晶，結晶后將晶體離心，65 °C烘干，得D-木糖醇。實施例2
(I)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基A組成為葡萄糖70 g/L，玉米漿8 g/L，酵母膏4. 5 g/L, MgSO40.9g/L,自然pH ;種子培養(yǎng)基B組成為阿拉伯糖醇110 g/L,酵母膏7 g/L,碳酸|丐I. 2 g/L，pH 5. I ;發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖150 g/L，玉米漿8 g/L，酵母膏4 g/L, KH2PO4 3. 5 g/L, MgSO4 O. 9 g/L, pH 5· 3。(2)種子液制備a)奧默柯達酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123種子液從斜面上取一環(huán)菌，接種在搖瓶中(培養(yǎng)基A)，裝液量15%，180 rpm，33°C培養(yǎng)18 h作為酵母搖瓶種液，然后按15%接種量將酵母搖瓶種液接種在100 L發(fā)酵罐種液中(培養(yǎng)基A)，裝液量60%，通氣比為O. 8 L/L min, 100 rpm,33°C擴大培養(yǎng)12 h作為酵母擴培種液；b)氧化葡糖桿菌種液從一支氧化葡糖桿菌斜面上洗脫全部菌落，接種在搖瓶中(培養(yǎng)基B)，裝液量15%，100 rpm, 33°C培養(yǎng)20 h作為氧化葡糖桿菌搖瓶種液，然后按15%接種量將氧化葡糖桿菌搖瓶種液接種在100 L發(fā)酵罐種液中(培養(yǎng)基B)，裝液量60%，通氣比為O. 8 L/L*min, 100rpm，33°C擴大培養(yǎng)16 h作為氧化葡糖桿菌擴培種液。(3)混菌發(fā)酵按10%接種量，先將酵母擴培種液接種在Im3發(fā)酵罐(發(fā)酵培養(yǎng)基)中，裝液量60%，200 rpm，通氣比為0.3 L/L*min，33°C發(fā)酵培養(yǎng)75 h，然后按5%接種量，再將氧化葡糖桿菌擴培種液接種在發(fā)酵液中繼續(xù)發(fā)酵，通氣比為O. 8 L/L-min, 100 rpm，過程 中流加葡萄糖和10wt%Na0H溶液，控制發(fā)酵液中葡萄糖含量在8 g/L，pH在4. 6，發(fā)酵150 h，停止補糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗盡下罐，液相檢測發(fā)酵液中D-木酮糖的含量為153. 2g/L,葡萄糖對D-木酮糖的轉化率為44. 3%。(4) D-木酮糖的提取精制將發(fā)酵液首先采用常規(guī)方式板框過濾除菌，再采用截留分子量為2000 Da的超濾膜過濾，然后進行活性碳脫色和離子交換。再濃縮至干物質含量為90%，然后降溫至48°C，向濃縮液中干物質含量3%的D-木酮糖作為晶種，再自然降溫至室溫進行結晶，結晶后離心，得到D-木酮糖。(5)酶轉化將精制D-木酮糖配成35%的水溶液，調節(jié)pH為8.0，再向水溶液中加入硫酸鎂和SO2，至硫酸鎂在水溶液中的濃度為43 mg/L、SO2在水溶液中的濃度為110 mg/L，D-木酮糖水溶液以3 m3/h流速流過酶異構柱，異構柱含木糖異構酶200公斤，反應溫度58 0C，得含有D-木酮糖和D-木糖的異構糖液(含有D-木酮糖45. 2%和D-木糖53. 4%，寡糖
1.4%)ο(6)木糖提取精制利用12柱模擬移動床裝置處理異構糖液，分離D-木酮糖和D-木糖；以鈣型陽離子交換樹脂作為吸附劑，以水為洗脫劑，在58°C下連續(xù)進料、進水、出料，得到富含D-木酮糖組分(D-木酮糖92. 0%，濃度26. 46%)和富含D-木糖(D-木糖96. 3%，濃度29. 32%)組分；將富含木糖組分以常規(guī)方式過離子交換樹脂，去除雜質，然后濃縮至干物質含量為90%，自然降溫至60°C，向濃縮液中加入相對干物質含量4%的木糖晶種，自然降溫至室溫，離心，得到結晶D-木糖；富含木酮糖組分返到步驟(5)進行酶異構。(7)氫化將結晶木糖配成40%溶液，以溶液重量O. 5%加入雷尼釕，在140°C，7. 6Mpa氫氣壓力下，進行加氫反應，反應時間2 h，得到木糖醇溶液。(8)木糖醇的提取精制將木糖醇溶液按常規(guī)方式進行活性炭脫色、板框過濾和過離子交換樹脂去除雜質，濃縮至干物質含量為75%，然后自然降溫至50°C，向濃縮液中加入干物質含量2%的木糖醇作為晶種，然后自然降溫至室溫進行結晶，結晶后將晶體離心，55 °C烘干，得D-木糖醇。實施例3(I)培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基A為葡萄糖60 g/L,玉米漿5 g/L,酵母膏5 g/L, MgSO4 I. 5g/L,自然pH ;種子培養(yǎng)基B組成為阿拉伯糖醇100 g/L,酵母膏5 g/L,碳酸I丐O. 5 g/L,pH
5.4;發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖120 g/L，玉米漿5 g/L，酵母膏5 g/L, KH2PO4 4 g/L, MgSO4
I.5 g/L, pH 5. 5。(2)種子液制備a)奧默柯達酵母(Kodamaea ohmeri) TL_1123種子液從斜面上取一環(huán)菌，接種在搖瓶中(培養(yǎng)基A)，裝液量15%，100 rpm，30°C培養(yǎng)20 h作為酵母搖瓶種液，然后按5%接種量將酵母搖瓶種液接種在100 L發(fā)酵罐種液中(培養(yǎng)基A)，裝液量60%，通氣比為O. 3 L/L*min,200 rpm，30°C擴大培養(yǎng)20 h作為酵母擴培種液；b)氧化葡糖桿菌種子液從一支氧化葡糖桿菌斜面上洗脫全部菌落，接種在搖瓶中(培養(yǎng)基B)，裝液量15%，180 rpm，3(TC培養(yǎng)24 h作為氧化葡糖桿菌搖瓶種液，然后按5%接種量將氧化葡糖桿菌搖瓶種液接種在100 L發(fā)酵罐種液中(培養(yǎng)基B)，裝液量60%，通氣比為O. 3 L/L*min,200rpm，3(TC擴大培養(yǎng)20 h作為氧化葡糖桿菌擴培種液。 (3)混菌發(fā)酵按5%接種量，先將酵母擴培種液接種在Im3發(fā)酵罐(發(fā)酵培養(yǎng)基)中，裝液量60%，100 rpm，通氣比為O. 8 L/L*min，30°C發(fā)酵培養(yǎng)65 h，然后按15%接種量，再將氧化葡糖桿菌擴培種液接種在發(fā)酵液中繼續(xù)發(fā)酵，過程中流加葡萄糖和10wt%K0H溶液，通氣比為O. 3 L/L.min，100 rpm，控制發(fā)酵液葡萄糖含量在10 g/L和pH在5. 0，發(fā)酵130 h，停止補糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗盡下罐，液相檢測發(fā)酵液中D-木酮糖的含量為136. 3g/L,葡萄糖對D-木酮糖的轉化率為41. 2%。(4) D-木酮糖的提取精制將發(fā)酵液首先采用常規(guī)方式板框過濾除菌，再采用截留分子量為3000 Da的超濾膜過濾，然后進行活性碳脫色和離子交換。再濃縮至干物質含量為95%，然后降溫至55°C，向濃縮液中加入干物質含量4%的D-木酮糖作為晶種，再自然降溫至室溫進行結晶，結晶后離心，得到D-木酮糖。(5)酶轉化將精制D-木酮糖配成40%的水溶液，調節(jié)pH為8. 2，再向水溶液中加入硫酸鎂和SO2，至硫酸鎂在水溶液中的濃度為45 mg/L、SO2在水溶液中的濃度為120 mg/L, D-木酮糖水溶液以4 m3/h流速流過酶異構柱,異構柱含木糖異構酶400公斤,反應溫度55 0C，得含有D-木酮糖和D-木糖的異構糖液(含有D-木酮糖48. 5%和D-木糖50. 1%，寡糖
I.4%)ο(6)木糖提取精制利用12柱模擬移動床裝置處理異構糖液，分離D-木酮糖和D-木糖；以鈣型陽離子交換樹脂作為吸附劑，以水為洗脫劑，在50°C下連續(xù)進料、進水、出料，得到富含D-木酮糖組分(D-木酮糖89. 3%，濃度26. 34%)和富含D-木糖(D-木糖92. 0%，濃度28. 33%)組分；將富含木糖組分以常規(guī)方式過離子交換樹脂，去除雜質，然后濃縮至干物質含量為75%，自然降溫至40°C，向濃縮液中加入相對干物質含量5%的木糖晶種，自然降溫至室溫，離心，得到結晶D-木糖；富含木酮糖組分返到步驟(5)進行酶異構。(7)氫化將結晶木糖配成42%溶液，以溶液重量O. 8%加入雷尼鎳，在170°C，7. 2Mpa氫氣壓力下，進行加氫反應，反應時間4 h，得到木糖醇溶液。(8)木糖醇的提取精制將木糖醇溶液按常規(guī)方式進行活性炭脫色、板框過濾和過離子交換樹脂去除雜質，濃縮至干物質含量為90%，然后自然降溫至60°C，向濃縮液中加入干物質含量3%的木糖醇作為晶種，然后自然降溫至室溫進行結晶，結晶后將晶體離心，75 °C烘干，得D-木糖醇。
比較例
(I)培養(yǎng)基組成和種液制備方法同實施例I。(2)混菌發(fā)酵各按10%接種量，將酵母擴培種液和氧化葡糖桿菌擴培種液同時接種在Im3發(fā)酵罐(發(fā)酵培養(yǎng)基)中，裝液量60%，200 rpm，通氣比為0.5 L/L*min，35°C發(fā)酵培養(yǎng)85 h，待葡萄糖降到5 g/L以下，補糖，控制發(fā)酵液葡萄糖含量在5 g/L左右和pH在
5.1，發(fā)酵145 h，停止補糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗盡下罐，液相檢測發(fā)酵液中D-木酮糖的含量為36. I g/L，葡萄糖對D-木酮糖的轉化率為11. 5 %。( 3 )其他步驟條件同實施例I。從上述實施例和比較例可以看出，本發(fā)明方法木酮糖產(chǎn)量和轉化率大大提高，更加利于生物發(fā)酵制備木糖醇的工業(yè)化應用。 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉，而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
權利要求
1.一種微生物轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法，以葡萄糖為原料，通過可轉化葡萄糖為阿拉伯糖醇的耐高滲酵母和可轉化阿拉伯糖醇為D-木酮糖的氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)混菌發(fā)酵培養(yǎng)得D-木酮糖發(fā)酵液,發(fā)酵液經(jīng)進一步處理得D-木酮糖，其特征是，混菌發(fā)酵包括以下步驟首先，分別制備耐高滲酵母種液和氧化葡糖桿菌種液，然后先將耐高滲酵母種液接種到含葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，將葡萄糖轉化為阿拉伯糖醇，在耐高滲酵母發(fā)酵中后期再將氧化葡糖桿菌種液接種到發(fā)酵液中混菌發(fā)酵，同時控制發(fā)酵液中葡萄糖含量為5-10 g/L,繼續(xù)發(fā)酵將阿拉伯糖醇轉化為D-木酮糖，得含有D-木酮糖的發(fā)酵液。
2.根據(jù)權利要求I所述的微生物轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法，其特征是所述可轉化葡萄糖為阿拉伯糖醇的耐高滲酵母為奧默柯達酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123CGMCC NO. 6197 ;所述可轉化阿拉伯糖醇為D-木酮糖的氧化葡糖桿菌為氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)NH-IO CGMCC No. 2709。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的微生物轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法，其特征是 耐高滲酵母種液采用下述方法制備取一接種環(huán)斜面保存的耐高滲酵母菌種，接種在種子培養(yǎng)基A中，在100-250 rpm、30_35°C條件下培養(yǎng)10-20 h，得一級種液，將所得一級種液按5-15%的接種量接種到種子培養(yǎng)基A中，在100-200 rpm、通氣比為0. 3-0. 8 L/L min、30-35°C條件下擴大培養(yǎng)12-20 h，得耐高滲酵母種液；種子培養(yǎng)基A組成為葡萄糖 60-80 g/L，玉米漿 5-10 g/L，酵母膏 3-5 g/L, MgSO4 0. 5-1. 5 g/L，自然 pH; 氧化葡糖桿菌種液采用下述方法制備將一支氧化葡糖桿菌斜面上的全部菌體接種到種子培養(yǎng)基B中，在100-250 rpm、30-35°C條件下培養(yǎng)16-24 h，得一級種液，將所得一級種液按5-15%的接種量接種到種子培養(yǎng)基B中，在100-200 rpm、通氣比為0. 3-0. 8 L/L*min、30-35°C條件下擴大培養(yǎng)16-20 h，得氧化葡糖桿菌種液；種子培養(yǎng)基B組成為阿拉伯糖醇100-120 g/L，酵母膏 5-10 g/L，碳酸鈣 0. 5-1. 5 g/L, pH 5. 1-5.4。
4.根據(jù)權利要求I或2所述的微生物轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法，其特征是混菌發(fā)酵具體包括以下步驟首先，分別制備耐高滲酵母種液和氧化葡糖桿菌種液，然后按5-15%的接種量，先將耐高滲酵母種液接種到含有葡糖糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在100-200 rpm、通氣比為0.3-0. 8 L/L*min、30-35°C條件下發(fā)酵培養(yǎng)65-85 h，將葡萄糖轉化為阿拉伯糖醇；然后再將氧化葡糖桿菌種液按5-15%的接種量接種到發(fā)酵液中，在100-200 rpm、通氣比為0. 3-0. 8 L/L*min、30-35°C條件下混菌發(fā)酵；發(fā)酵過程中流加葡萄糖和堿性物質溶液，使發(fā)酵液中葡萄糖含量為5-10 g/L、pH為4. 6-5. 4，整個發(fā)酵時間持續(xù)130-150 h后停止補充葡萄糖，待葡萄糖和阿拉伯糖醇耗盡后停止發(fā)酵，得含有D-木酮糖的發(fā)酵液； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖120-160 g/L，玉米漿5-10 g/L，酵母膏3-5 g/L,KH2PO4 3-4 g/L, MgSO4 0. 5-1. 5 g/L, pH 5. 0-5. 5。
5.根據(jù)權利要求I或2所述的微生物轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法，其特征是D-木酮糖發(fā)酵液的后處理過程為將發(fā)酵液首先采用常規(guī)方式板框過濾除菌，再采用截留分子量為1000-3000 Da的超濾膜過濾，然后進行活性碳脫色和離子交換，再將發(fā)酵液濃縮至干物質含量為80-95%，然后降溫至40-55°C，向濃縮液中加入干物質含量2_4%的D-木酮糖作為晶種，再自然降溫至室溫進行結晶，結晶后離心，得到D-木酮糖。
6.一種微生物轉化葡萄糖制備木糖醇的方法，以葡糖糖為原料，通過混菌發(fā)酵將葡萄糖轉化為D-木酮糖，再通過酶異構將D-木酮糖轉化為D-木糖，然后D-木糖加氫還原為木糖醇，其特征是采用權利要求1-6中任一項所述的微生物轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法將葡萄糖轉化為D-木酮糖。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征是采用木糖異構酶將D-木酮糖轉化為D-木糖和D-木酮糖的混合液，然后將D-木糖分離、氫化得到木糖醇。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的方法，其特征是包括以下步驟 (I )D-木酮糖的制備采用權利要求I或2所述的微生物轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法制備D-木酮糖； (2)D-木糖的制備將步驟(I)中的D-木酮糖配成水溶液，在木糖異構酶的作用下制得含有D-木酮糖和D-木糖的異構糖液；· (3)D-木糖的提取精制利用模擬移動床裝置處理步驟(2)中的異構糖液，將D-木酮糖和D-木糖分離得到富含D-木酮糖組分和富含D-木糖組分，將富含D-木糖組分過離子交換樹脂除去雜質，然后濃縮、結晶，得D-木糖；富含D-木酮糖組分進入步驟(2)套用； (4)木糖醇的制備將步驟(3)的D-木糖配成水溶液，在催化劑存在下進行加氫反應，得到木糖醇溶液； (5)木糖醇的提取精制將木糖醇溶液過濾除去催化劑、過離子交換樹脂除去雜質，然后濃縮、結晶，得D-木糖醇。
9.根據(jù)權利要求8所述的微生物轉化葡萄糖制備木糖醇的方法，其特征是 D-木糖的制備具體包括以下步驟將步驟(I)中的D-木酮糖配成35-45%的水溶液，調節(jié)PH為8. 0-8. 3，再向水溶液中加入硫酸鎂和SO2,至硫酸鎂在水溶液中的濃度為43-48mg/L、S02在水溶液中的濃度為95-120 mg/L，然后將D-木酮糖水溶液在55_60°C下、以2_4m3/h的流速流過填充有木糖異構酶的酶異構柱，得含有D-木酮糖和D-木糖的異構糖液； D-木糖的提取精制具體包括以下步驟以鈣型陽離子交換樹脂作為吸附劑，以水為洗脫劑，在50-65°C下利用模擬移動床裝置處理步驟(2沖的異構糖液，得到富含D-木酮糖組分和富含D-木糖組分，將富含木糖組分依次進行活性炭脫色、板框過濾除菌和離子交換樹脂除雜，然后將其濃縮至干物質含量為75-90%，然后降溫至40-60°C，向濃縮液中加入干物質含量3-5%的D-木糖作為晶種，再自然降溫至室溫進行結晶，結晶后離心，得到D-木糖；富含D-木酮糖組分進入步驟(2)套用； 木糖醇的制備具體包括以下步驟將步驟(3)中的D-木糖配成40-50%的水溶液，然后加入水溶液重量0. 3-0. 8%的雷尼鎳或雷尼釕作為催化劑，在140-170°C，7. 2-8. 0 MPa氫氣壓力下進行加氫反應，反應2-4 h，得到木糖醇溶液； 木糖醇的提取精制具體包括以下步驟將木糖醇溶液進行活性炭脫色、板框過濾除菌和離子交換樹脂除雜，然后將其濃縮至干物質含量為75-90%，然后自然降溫至40-60°C，向濃縮液中加入干物質含量2-4%的木糖醇作為晶種，然后自然降溫至室溫進行結晶，結晶后將晶體離心，55-70°C烘干，得D-木糖醇。
10.一種轉化葡萄糖為阿拉伯糖醇的耐高滲酵母菌種，其特征是所述菌種為奧默柯達酵母(Kodamaea ohmeri) TL-1123 CGMCC NO. 6197。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物轉化葡萄糖制備D-木酮糖的方法，首先，以葡萄糖為原料，分別制備耐高滲酵母種液和氧化葡糖桿菌種液，然后先接種耐高滲酵母種液進行阿拉伯糖醇發(fā)酵，中后期接入氧化葡糖桿菌種液混菌發(fā)酵，同時控制發(fā)酵液中葡萄糖含量為5-10g/L，將阿拉伯糖醇轉化為D-木酮糖，該方法解除了阿拉伯糖醇反饋抑制，提高了葡萄糖生產(chǎn)D-木酮糖的效率。本發(fā)明還公開了一種微生物轉化葡萄糖制備木糖醇的方法，首先通過上述方法將葡萄糖轉化為D-木酮糖，再通過酶異構把D-木酮糖轉化為D-木糖，經(jīng)提取精制，D-木糖催化加氫獲得木糖醇，該方法提高了木糖醇生產(chǎn)效率，降低了生物法制備木糖醇生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P39/00GK102796797SQ20121028196
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月9日 優(yōu)先權日2012年8月9日
發(fā)明者張全景, 付吉明, 王喬隆, 鄭秀寧, 劉敏, 莊祎 申請人:山東天力藥業(yè)有限公司