一種利用表面固定化技術反復批次發(fā)酵生產(chǎn)d-乳酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用表面固定化技術反復批次發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法，其步驟包括：固定化反應體系的構建、固定化過程和反復批次發(fā)酵過程。表面固定化技術利用纖維材料作為固定化載體，具有高空隙率和比表面積的特點，改進了纖維材料的固定方式，提高細胞密度、提高發(fā)酵速率的同時還可以避免普通固定化技術的傳質問題。反復批次發(fā)酵技術可以種子培育的時間，極大地節(jié)省了種子培養(yǎng)的時間和勞動力。表面固定化技術與反復批次發(fā)酵技術的結合使每一批次結束后不需要保留發(fā)酵液作為下一批次的種子液，而是可以直接利用纖維材料固定的菌體直接進行發(fā)酵，進一步簡化了工藝操作，保證了長期發(fā)酵的穩(wěn)定性。
【專利說明】ー種利用表面固定化技術反復批次發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工【技術領域】，具體涉及ー種利用表面固定化技術反復批次發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法。
【背景技術】
[0002]D-乳酸是合成多種手性物質的前體，在高分子材料、農(nóng)藥和化工等方面的應用十分廣泛。D-乳酸最主要的功能是可以用于合成聚乳酸的前體，聚乳酸具有與聚苯乙烯相似的光澤度和加工性能。由聚乳酸制成的產(chǎn)品具有很好的生物相容性，可以用于制作骨內(nèi)固定物、手術縫合線和藥物控釋載體等醫(yī)用材料；還可以替代聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯等材料生產(chǎn)新型環(huán)保包裝材料。
[0003]目前發(fā)酵法是生產(chǎn)乳酸的主要方法，但高純度D-乳酸的生產(chǎn)規(guī)模相對較小，傳統(tǒng)的游離細胞發(fā)酵方式有ー些不足。一方面，發(fā)酵過程大都為鈣鹽法中和乳酸，即采用定期添加碳酸鈣作為中和劑控制PH，而且是采用發(fā)酵開始預加過量的方式，會給后續(xù)分離提取中的活性炭和納濾膜帶來很大壓力。因為乳酸鈣溶液中含有少量的殘?zhí)呛桶被?，在分離的沉降絮凝時會發(fā)生美拉德反應，生成水溶性黑精，使乳酸鈣溶液呈黃褐色，極難去除。另ー方面，傳統(tǒng)游離細胞的分批發(fā)酵的細胞濃度低、周期長、底物轉化率低、產(chǎn)酸率不高。同吋，初始底物濃度過高，培養(yǎng)基滅菌后抑制菌體生長，從而使生產(chǎn)成本升高。
[0004]近年來越來越多的人將固定化技術應用于乳酸發(fā)酵。傳統(tǒng)的固定化方法主要存在傳質問題，到發(fā)酵后期會造成死細胞大量累積影響發(fā)酵速率。美國俄亥俄州立大學的楊尚天教授等人于1992年發(fā)明了ー種新型的細胞固定化反應器——纖維床生物反應器用于固定化發(fā)酵，主要是使菌體吸附于載體表面形成高密度培養(yǎng)，但固定化載體單一，主要以棉織物為主，現(xiàn)階段應用范圍小而且僅限于實驗室規(guī)模的操作，目前還沒有將該固定化技術應用于D-乳酸的文獻報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供ー種表面固定化技術，將之與反復批次發(fā)酵技術相結合應用于D-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)上。表面固定化技術以纖維材料作為固定化載體將菌體吸附于表面，通過高密度的培養(yǎng)提高發(fā)酵速率，并通過反復批次發(fā)酵的方式得到高濃度的D-乳酸。這是ー種發(fā)酵效率高、底物轉化率高、長期發(fā)酵穩(wěn)定性好的D-乳酸發(fā)酵方法。
[0006]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案如下:
[0007]—種利用表面固定化技術反復批次發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法，它包括以下步驟:
[0008](1)固定化反應體系的構建:將纖維材料固定在不銹鋼支架上放入帶夾套的不銹鋼柱中構建固定化反應器，固定化反應器通過循環(huán)管路與發(fā)酵罐相連通發(fā)酵罐的調(diào)控系統(tǒng)和循環(huán)管路保證固定化反應器的液體混勻以及調(diào)控反應器的PH，并且在固定化反應器的夾套內(nèi)通過蠕動泵循環(huán)通入由恒溫水浴鍋控溫的水以控制反應器的溫度；[0009](2)固定化過程:將培養(yǎng)至對數(shù)期的芽孢乳桿菌種子液接入發(fā)酵罐中，接種量5~15 (v/v) %，發(fā)酵罐通入0.1~lL/mL的氮氣，培養(yǎng)溫度30~50°C，攪拌速度20~150rpm，并流加液體堿性物質將發(fā)酵罐內(nèi)PH值控制在5.5~7.0，培養(yǎng)12~60h至菌懸液OD66tl達到6.0后，再通過蠕動泵將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基打入固定化反應器中，將循環(huán)流速設置為30~100mL/min,在固定化反應器內(nèi)開始菌體的固定化過程，固定化過程維持在24~96h ；
[0010](3)反復批次發(fā)酵過程:固定化過程結束以后將發(fā)酵罐和固定化反應器中的培養(yǎng)基泵出，之后泵入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基開始反復批次發(fā)酵過程，進行3~8個批次的發(fā)酵。
[0011]其中，所述的纖維材料是用于固定菌體的固定化介質，具體可以為經(jīng)過農(nóng)業(yè)秸桿、甘蔗渣、玉米芯、棉纖維、麻纖維、竹纖維、無紡布、靜電紡絲、活性炭纖維、聚乙烯醇纖維和聚砜纖維中的任意ー種。當纖維材料使用農(nóng)業(yè)秸桿中的玉米秸桿時，需要對玉米秸桿進行改性處理，主要通過蒸汽爆破處理改變其結構，使其表面出現(xiàn)褶皺，結構變的蓬松，比表面積増大。
[0012]其中，對于無紡布、棉纖維、竹炭纖維這樣的長纖維材料，可以將其纏繞不銹鋼支架外圍ー圈進行固定；對于甘蔗渣、玉米芯、秸桿這樣的短纖維材料，可以將其填充在不銹鋼支架網(wǎng)內(nèi)。
[0013]其中，所述的不銹鋼支架是在ー根不銹鋼管上360度錯落焊接帶有小孔的不銹鋼鉄片(如圖1所示)，或者是將三個不銹鋼絲網(wǎng)槽焊接在四根細不銹鋼管上并附有可拆卸的不銹鋼絲網(wǎng)蓋子(如圖2所示)。
[0014]其中，在批次發(fā)酵的過程中，每ー批次可以采用單批補料發(fā)酵、補料分批發(fā)酵、和同步糖化發(fā)酵方式中的任意ー種。
[0015]其中，所述液體堿性物質選自NaOH水溶液、NH4OH水溶液、Na2CO3水溶液、NaHCO3水溶液和KOH水溶液中的任意ー種或幾種。
[0016]其中，芽孢乳桿菌種子液接入發(fā)酵罐之前一般需要經(jīng)過平板培養(yǎng)和種子培養(yǎng)的過程。
[0017]平板培養(yǎng):將凍存保藏的菌株接種到平板培養(yǎng)基上，厭氧箱中30~50°C靜置培養(yǎng)24~72h活化。
[0018]種子培養(yǎng):從活化的平板挑取菌體接入50~100ml種子培養(yǎng)基中，30~50°C下靜置培養(yǎng)12~60h形成一級種子液。再將ー級種子液轉接于裝有500ml種子培養(yǎng)基中，接種量5%~15%，30~50°C下靜置培養(yǎng)12~60h形成二級種子液。
[0019]優(yōu)選地，所述初始平板培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、氮源和無機鹽等其他成分。
[0020]優(yōu)選地，所述碳源選自淀粉、洋姜、木薯、葡萄糖、果糖、蔗糖、菊糖、麥芽糖和甘露糖中的ー種或幾種；更優(yōu)選地，所述碳源的初始濃度為0.01~250g/L，優(yōu)選為30~200g/
し
[0021]優(yōu)選地，所述氮源選自酵母粉、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、尿素、硫酸銨中的ー種或幾種；更優(yōu)選地，所述氮源的初始濃度為0.01~100g/L，優(yōu)選為I~20g/L。
[0022]優(yōu)選地，所述無機鹽選自磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽中的ー種或幾種；更優(yōu)選地，所述無機鹽的初始濃度為0.001~100g/L，優(yōu)選為0.01~10g/L。
[0023]優(yōu)選地，所述初始種子培養(yǎng)基中含有こ酸鹽，其中こ酸鹽選自こ酸鈉、こ酸銨和こ酸鉀的ー種或幾種；更優(yōu)選地，所述こ酸鹽的初始濃度為0.01~100g/L，優(yōu)選為I~IOg/
し
[0024]優(yōu)選地，所述金屬離子選自鉀離子、納離子、亞鐵離子、錳離子、鎂離子、鈣離子、鋅離子中的ー種或幾種；更優(yōu)選地，所述無機鹽的初始濃度為0.001~100g/L，優(yōu)選為0.01 ~10g/L。
[0025]其中，所述方法中反復批次發(fā)酵方式是當?shù)谝慌l(fā)酵達到末期時，移除發(fā)酵液并且補入新鮮的培養(yǎng)基，固定化反應器中的纖維材料固定的菌體即作為第二批的發(fā)酵的種子，而當?shù)诙l(fā)酵進行到末期，再移除發(fā)酵液補入新鮮培養(yǎng)基進行第三批的發(fā)酵，如此反復批次發(fā)酵得到高濃度D-乳酸的發(fā)酵液。
[0026]有益效果:本發(fā)明具有如下優(yōu)勢:
[0027]I)不利用碳酸鈣作為中和劑，而是通過中間流加氨水等液體堿性物質，中和不斷產(chǎn)生的乳酸，維持發(fā)酵所需要的適宜酸度，避免了在發(fā)酵結束時會形成高濃度的乳酸鈣固體，從而給后續(xù)分離提取中的活性炭和納濾膜帶來很大壓力，造成下罐困難，清洗、取樣不便。同時利用氨水作為中和劑在后期分離中產(chǎn)生的NH4SO4有較高的經(jīng)濟利用價值，可以提高D-乳酸生產(chǎn)鏈的經(jīng)濟效益。
[0028]2)固定化反應器中細胞吸附于纖維材料表面，很大程度上提高了細胞密度，而纖維材料作為固定化載體具有高空隙率和比表面積的特點，使其傳質效率明顯高于傳統(tǒng)固定化方式，可以有效避免固定化后期堵塞的問題。
[0029]3)改進優(yōu)化了纖維材料的固定方式，避開傳統(tǒng)的鐵絲網(wǎng)+纖維+鐵絲網(wǎng)三明治形式的固定方式，將纖維材料直接縫接在特定的支架上或者是填充在分三層設計的鋼絲網(wǎng)槽中，增加了發(fā)酵液中的菌體與纖維材料的接觸面積，利于發(fā)酵液中的菌體更好地吸附在纖維材料上。`
[0030]4)在反復批次過程中，通過分批補料和同步糖化發(fā)酵控制較低濃度的碳源，可以減小底物抑制，提高底物利用率和發(fā)酵效率。
[0031]5)在反復批次發(fā)酵的過程中，上一批次發(fā)酵過程中纖維床反應器固定菌體可以直接作為下ー批次發(fā)酵的種子，略去了種子培育的時間，極大地節(jié)省了種子培養(yǎng)的時間和勞動力。
[0032]6)利用表面固定化技術進行反復批次發(fā)酵的特點在于每ー批次結束后不需要保留發(fā)酵液作為下ー批次的種子液，而是直接利用纖維材料固定的菌體直接進行發(fā)酵。
[0033]7)本發(fā)明的單批發(fā)酵與傳統(tǒng)的單批游離細胞發(fā)酵相比，發(fā)酵速率提高了 0.58~0.96g/L/h，發(fā)酵時間由144~168h縮短至72~96h，產(chǎn)物得率(乳酸產(chǎn)量/葡萄糖消耗)提高了 1.74% ~10.32%(w/w)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1是將纖維材料固定于不銹鋼支架構成細胞固定化載體的ー種方式的示意圖。
[0035]圖2是將纖維材料固定于不銹鋼支架構成細胞固定化載體的另ー種方式的示意圖。
[0036]圖1是在ー根不銹鋼管上360度錯落焊接帶有小孔的不銹鋼鉄片，將纖維材料如無紡布、棉纖維、竹炭纖維等是通過小孔繞ー圈縫接在不銹鋼支架上；圖2是將三個不銹鋼絲網(wǎng)槽焊接在四根細不銹鋼管上并附有不銹鋼絲網(wǎng)蓋子，將纖維材料如玉米芯、秸桿顆粒、甘蔗渣等填充在分三層的不銹鋼網(wǎng)槽內(nèi)。
[0037]圖3為固定化反應器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的示意圖。
[0038]圖1、圖2和圖3中，I表示不銹鋼支架；2表示不銹鋼鐵片上的小孔；3表示纖維材料；4表示焊有網(wǎng)槽的不銹鋼支架；5表示可拆卸的不銹鋼絲網(wǎng)蓋子；6表示恒溫水浴鍋；7表不固定化反應器(內(nèi)有固定化載體)；8表不發(fā)酵罐；9表不發(fā)酵罐控制箱；10表不磁力攪拌槳表示pH電極；12表示溫度電極；13表示堿液瓶；14表示補料瓶；15表示氮氣入ロ ；16表示尾氣出ロ ；17表示蠕動泵；18表示蠕動泵。
【具體實施方式】
[0039]根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
[0040]以下各實施例中的分析方法如下:
[0041](I)生物量的測定:
[0042]將發(fā)酵液樣品稀釋，用752分光光度計于660nm處測量其吸光度，其吸光度OD66。與每升的細胞干重(DW/L)的轉化值為:IOD66tl=0.392g DW/L。
[0043](2)乳酸和葡萄糖含量的測定:
[0044]將各發(fā)酵液樣品進行離心，測定菌體干重，取上清稀釋后，采用AgilentllOO高效液相色譜儀測定D-乳酸含量(HPLC)。色譜柱為Bio-Rad公司的Aminex HPX-87H ionexclusion column (300 X 7.8mm)，柱溫25°C，檢測器為示差檢測器，流動相為5mM的H2SO4水溶液；流速0.6mL/min ;進樣量:20uLo
[0045](3) D-乳酸光學純度測定:
[0046]手性分離柱Sumichiral 0A-5000C150X4.6mm 1.D., Sumika chemical AnalysisService, Osaka, /Japan), 2mmol/L硫酸銅作為流動相,流速:lml/min,紫外檢測器,檢測波長:254nm,操作溫度:50°C, D-乳酸標品購Sigma-Aldrich公司。
[0047]實施例1:
[0048]本實施例以玉米淀粉為原料，采用同步糖化發(fā)酵的補料形式進行固定化反復批次發(fā)酵，方法步驟如下:
[0049]平板培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖80g/L，酵母膏8g/L，無水こ酸鈉2g/L，無水硫酸鎂
0.8g/L，KH2P042g/L，硫酸亞鐵0.lg/L，硫酸錳0.1 g/L ;種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，無水硫酸鎂0.4g/L，硫酸亞鐵0.lg/L，硫酸錳0.lg/L, CaC0320g/L ；
[0050]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉150g/L,酵母膏6.5g/L,無水硫酸鎂0.8g/L,無水こ酸鈉4g/L,硫酸亞鐵0.lg/L,硫酸猛0.lg/L。
[0051]I)平板培養(yǎng):將凍存保藏的菌株接種到平板培養(yǎng)基上，厭氧箱中35°C靜置培養(yǎng)60h活化。
[0052]2)種子培養(yǎng):從活化的平 板挑取菌體接入60ml種子培養(yǎng)基中，35°C下靜置培養(yǎng)48h形成一級種子液。再將ー級種子液轉接于裝有500ml種子培養(yǎng)基中，接種量8%，35°C下靜置培養(yǎng)48h形成二級種子液。[0053]3)固定化反復批次發(fā)酵:
[0054]①固定化反應體系的構建:將麻纖維3固定在不銹鋼支架I外圍(如圖1所示)放入帶夾套的不銹鋼柱中構建固定化反應器7，固定化反應器通過循環(huán)管路與發(fā)酵罐8相連(如圖3所示)，發(fā)酵罐的調(diào)控系統(tǒng)9和循環(huán)管路保證固定化反應器的液體混勻以及調(diào)控反應器的PH，并且在固定化反應器的夾套內(nèi)通過蠕動泵18循環(huán)通入由恒溫水浴鍋控溫6的水以控制反應器的溫度。
[0055]②發(fā)酵培養(yǎng)基的預處理:將玉米淀粉用液化酶90°C液化SOmin后加入糖化酶以及滅過菌的其他發(fā)酵培養(yǎng)基成分，打入發(fā)酵罐。
[0056]③固定化過程:將培養(yǎng)至對數(shù)期(培養(yǎng)時間36h)的種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%，發(fā)酵罐內(nèi)的工作體積為4L，通入0.3L/mL的氮氣保持反應器中的厭氧環(huán)境，培養(yǎng)溫度35°C，攪拌速度lOOrpm，并流加NaOH將pH控制在6.0，培養(yǎng)28h至菌懸液吸光度(OD66tl)達到6.0左右，通過蠕動泵17將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基打入固定化反應器，將循環(huán)流速設置為30mL/min，在FBB反應器內(nèi)開始菌體的固定化過程，這個過程進行60h。
[0057]④反復批次發(fā)酵過程:固定化過程結束之后將發(fā)酵罐和固定化反應器中的培養(yǎng)基泵出，通過蠕動泵將含有新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基打入發(fā)酵罐，然后開啟循環(huán)管路的蠕動泵，將循環(huán)流速設置為80mL/min,利用固定化反應器內(nèi)麻纖維固定的菌體發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸，當殘?zhí)菨舛鹊陀?0g/L時，放出發(fā)酵罐和固定化反應器內(nèi)的料液(保留麻纖維)，然后將新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基通過蠕動泵打入發(fā)酵罐并且通過循環(huán)管路與固定化反應器接通，開始反復批次發(fā)酵的第二批發(fā)酵，共進行了 3個批次的發(fā)酵。HPLC檢測結果見表1。
[0058]表1
[0059]
【權利要求】
1.ー種利用表面固定化技術反復批次發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，它包括以下步驟: (1)固定化反應體系的構建:將纖維材料固定在不銹鋼支架上放入帶夾套的不銹鋼柱中構建固定化反應器，固定化反應器通過循環(huán)管路與發(fā)酵罐相連通； (2)固定化過程:將培養(yǎng)至對數(shù)期的芽孢乳桿菌種子液接入發(fā)酵罐中，接種量5~15 (v/v) %，發(fā)酵罐通入0.1~lL/mL的氮氣，培養(yǎng)溫度30~50°C，攪拌速度20~150rpm，并流加液體堿性物質將發(fā)酵罐內(nèi)PH值控制在5.5~7.0，培養(yǎng)12~60h至菌懸液OD66tl達到6.0后，再通過蠕動泵將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基打入固定化反應器中，將循環(huán)流速設置為30~100mL/min,在固定化反應器內(nèi)開始菌體的固定化過程，固定化過程維持在24~96h ； (3)反復批次發(fā)酵過程:固定化過程結束以后將發(fā)酵罐和固定化反應器中的培養(yǎng)基泵出，之后泵入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基開始反復批次發(fā)酵過程，進行3~8個批次的發(fā)酵。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用表面固定化技術反復批次發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，所述的纖維材料為農(nóng)業(yè)秸桿、甘蔗渣、玉米芯、棉纖維、麻纖維、竹纖維、無紡布、靜電紡絲、活性炭纖維、聚乙烯醇纖維和聚砜纖維中的任意ー種。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用表面固定化技術反復批次發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，對于無紡布、棉纖維、竹炭纖維這樣的長纖維材料，可以將其纏繞不銹鋼支架外圍一圈進行固定；對于甘蔗渣、玉米芯、秸桿這樣的短纖維材料，可以將其填充在不銹鋼支架網(wǎng)內(nèi)。
4.根據(jù)權利要求1或3所述的利用表面固定化技術反復批次發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在干，所述的不銹鋼支架是在ー根不銹鋼管上360度錯落焊接帶有小孔的不銹鋼鐵片，或者是將三個不銹鋼絲網(wǎng)槽焊接在四根細不銹鋼管上并附有可拆卸的不銹鋼絲網(wǎng)蓋子。`
5.根據(jù)權利要求1所述的利用表面固定化技術反復批次發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，在批次發(fā)酵的過程中，每ー批次可以采用單批補料發(fā)酵、補料分批發(fā)酵、和同步糖化發(fā)酵方式中的任意ー種。
6.根據(jù)權利要求1所述的利用表面固定化技術反復批次發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的方法，其特征在于，所述液體堿性物質選自NaOH水溶液、NH4OH水溶液、Na2CO3水溶液、NaHCO3水溶液和KOH水溶液中的任意ー種或幾種。
【文檔編號】C12P7/56GK103555776SQ201310530636
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權日:2013年10月31日
【發(fā)明者】應漢杰, 陳勇, 趙婷, 柳東, 任恒飛, 施欣馳, 趙南, 陳小春, 吳菁嵐, 莊偉
申請人:南京工業(yè)大學