用于aldh2基因芯片檢測的特異性引物對和探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，公開了用于檢測ALDH2基因的SNP位點的特異性寡核苷酸探針，這種探針可以與ALDH2基因第504位不同基因型雜交。本發(fā)明還公開了檢測上述SNP位點時，用于擴增ALDH2基因的特異性引物對，引物對可特異性擴增ALDH2基因中的含有檢測目標位點的目標區(qū)域。本發(fā)明所提供的產(chǎn)品可用于檢測ALDH2基因型，為人們了解自身的個體酒精代謝解毒能力、正確使用硝酸甘油提供信息。
【專利說明】用于ALDH2基因芯片檢測的特異性引物對和探針
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域和核酸檢測領(lǐng)域，具體設(shè)計用于擴增ALDH2基因的特異性引物對和用于ALDH2基因芯片檢測的特異性探針。
【背景技術(shù)】
[0002]人類乙醒脫氫酶(aldehyde dehydrogenase gene, ALDH)是一種四聯(lián)體蛋白，催化乙醛和其他脂肪族醛氧化。ALDH2基因第12外顯子內(nèi)存在一個單核苷酸多態(tài)(single
nucleotide polymorphism, SNP)-rs671,出現(xiàn)堿基置換:鳥嘌呤(G)—腺嘌呤(A),故導
致密碼子改變:GAA — AAA，進而發(fā)生該酶第504個氨基酸的改變，谷氨酸(Glu)—賴氨酸(Lys) ο ALDH2 有兩個等位基因:野生型(ALDH2*1, *504Glu)，突變型(ALDH2*2, *504Lys)。研究證實，ALDH2這一突變導致酶活性發(fā)生顯著改變，會嚴重影響酒精、硝酸甘油等的代謝，且這一突變存在明顯的種族差異，其在歐美白種人中少見，而在中、日、韓等東亞黃種人中突變率高達30%-50%。
[0003]檢測ALDH2的基因型，對揭示個體酒精代謝解毒能力以及正確使用硝酸甘油，具有重要意義。目前測定 ALDH2基因型的方法主要采用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、手工或自動測序、序列特異性引物PCR等方法，操作繁瑣，檢測周期長，檢測結(jié)果不易準確，難以滿足臨床檢驗的要求。
[0004]近幾年在高科技領(lǐng)域內(nèi)出現(xiàn)的最具時代特征的重大科技進展之一便是基因芯片。用基因芯片檢測ALDH2基因亞型，發(fā)揮基因芯片檢測操作簡單、快捷、結(jié)果準確的特點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測ALDH2基因SNP位點的特異性擴增弓丨物對和特異性寡核苷酸雜交探針。
[0006]這種用于檢測ALDH2基因SNP位點的特異性寡核氨酸探針可以與ALDH2基因第504位不同基因型雜交，用于檢測ALDH2基因rs671的504Glu/LysSNP位點。
[0007]特異性寡核氨酸探針序列如下，使用時可從下列三條序列中挑選一條:
[0008]檢測位點為504Glu(GAA)時，特異性寡核苷酸探針序列含有以下核苷酸序列之一(下劃線部分為SNP位點):
[0009](I)SEQ ID N0.1:5’-CAGGCATACACT￡AAGTGAAAA_3’ ；
[0010](2) SEQ ID N0.2:5’-GGCATACACI^AAGTGAAAACTG-3’ ；
[0011](3) SEQ ID N0.3:5’ -AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT-3 ；
[0012]所述的檢測位點為504Lys (AAA)時，特異性寡核苷酸探針序列含有以下核苷酸序列之一(下劃線部分為SNP位點):
[0013](4) SEQ ID N0.4:5’ -GCAGGCATACACTMAGTGAAAACT-3’
[0014](5) SEQ ID N0.5:5’ -GGCATACACTMAGTGAAAACTG-3’
[0015](6) SEQ ID N0.6:5’ -CTGCAGGCATACACTMAGTGAA-3’[0016]優(yōu)選的，所述的檢測位點為504Glu (GAA)時，特異性寡核苷酸探針為SEQIDN0.1-3中的一個；所述的檢測位點為504Lys (AAA)時，特異性寡核苷酸探針為SEQ IDN0.4-6中的一個。
[0017]更優(yōu)選的，所述的檢測位點為504Glu (GAA)時，特異性寡核苷酸探針為SEQIDN0.1-3中的一個，并且其5’端還包含5’氨基修飾的聚脫氧胸苷酸；所述的檢測位點為504Lys (AAA)時，特異性寡核苷酸探針為SEQ ID N0.4_6中的一個，并且其5’端還包含5’氨基修飾的聚脫氧胸苷酸。聚脫氧胸苷酸長度為5~25。即上述特異性寡核苷酸探針的5’端還包含一段5-25聚的聚脫氧胸苷酸。
[0018]檢測上述ALDH2基因SNP位點時，用于擴增ALDH2基因rs671的504Glu/Lys SNP位點所使用的特異性引物對含有以下核苷酸序列之一:
[0019](I)上游 SEQ ID N0.7:5，-AAGACTTTGGGGCAATACAG-3’
[0020]下游 SEQ ID N0.8:5，-GGGTAAAATTCGGACTCTTC-3，，或，
[0021](2)上游 SEQ ID N0.9:5’ -GGGGGTCCTGGGAGTGTAAC-3’
[0022]下游 SEQ ID N0.10:5，-CCTAAATCCCAGACGACCCG-3，，或，
[0023](3)上游 SEQ ID N0.11:5’ -AGTGTAACCCATAACCCCCA-3’
[0024]下游 SEQ ID N0.12:5-CATTTCTGGGTCGGAGACGA_3，。
[0025]即引物對序列含有SEQ ID N0.7和N0.8的核苷酸序列，或者含有SEQ IDN0.9和N0.10的核苷酸序列，或者含有SEQ ID N0.11和N0.12的核苷酸序列。
[0026]優(yōu)選的，所述引物對序列為SEQ ID N0.7和N0.8的核苷酸序列，或者SEQID N0.9和N0.10的核苷酸序列，或者SEQ ID N0.11和N0.12的核苷酸序列。
[0027]更優(yōu)選的，上述特異性引物對核苷酸序列的5’端用生物素、地高辛、熒光素、熒光素衍生物、熒光分子、堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶進行了修飾。
[0028]利用上述引物對及特異性寡核苷酸探針檢測ALDH2基因rs671的504Glu/Lys位點的方法，步驟包括:
[0029](I)制備待測樣品的基因組DNA ；
[0030](2)采用聚合酶鏈反應(yīng)方法擴增ALDH2基因中包含504Glu/Lys SNP位點的基因片段；用上述的引物對進行擴增，
[0031](3)將所得擴增產(chǎn)物與雜交緩沖液混合；
[0032](4)將上述混合液與ALDH2基因SNP檢測芯片雜交；所述的ALDH2基因SNP檢測芯片包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的特異性寡核苷酸探針；
[0033](5)檢測芯片的雜交信號。
[0034]步驟(5)中檢測雜交信號的方法選自堿性磷酸酶催化的四氮唑藍顯色反應(yīng)，辣根過氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺顯色反應(yīng)，或者熒光檢測。
[0035]上述的特異性寡核苷酸探針用于制備ALDH2基因SNP檢測芯片或試劑盒。
[0036]上述的引物對用于制備ALDH2基因SNP檢測芯片或試劑盒。
[0037]本發(fā)明還提供一種用于檢測ALDH2基因SNP的試劑盒，該試劑盒包含上述的ALDH2基因SNP檢測芯片和使用說明書。
[0038]上述ALDH2基因SNP檢測芯片可用于檢測ALDH2基因504Glu/Lys SNP位點的基因型。[0039]上述基因芯片的制備可按照生物芯片的常規(guī)制造方法進行。例如，如果固相支持物采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片，排列成預(yù)定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到基因芯片。如果寡核苷酸探針不含氨基修飾，則其制備方法也可參照:王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》;Derisi，JL等于1997年在《科學》278 (5338):680-686發(fā)表的“探討基因組內(nèi)基因表達的代謝和遺傳控制”(Dersi，幾，IyerVR, Brown P0.Exploring the metablic and genetic control of gene expression on agenomic scale.Science.1997; 278 (5338):680-686)及馬立人等主編的生物芯片，化學工業(yè)出版社。
[0040]制備用于PCR擴增的染色體DNA的方法很多，可以從全血中制備,也可以從組織中制備。具體方法可參閱文獻(丁振諾主編《臨床PCR基因診斷技術(shù)》，世界圖書出版公司)。
[0041]用PCR方法擴增基因組DNA的特定片段的關(guān)鍵在于引物設(shè)計。
[0042]取適量擴增產(chǎn)物加入雜交緩沖液中與基因芯片雜交。與基因芯片雜交時，可以先將基因芯片與預(yù)雜交緩沖液進行預(yù)雜交。
[0043]本發(fā)明擴增產(chǎn)物與基因芯片之間的固相雜交按照本領(lǐng)域的經(jīng)典方法進行，本領(lǐng)域一般人員依據(jù)經(jīng)驗容易較易確定有關(guān)緩沖液、探針和樣品濃度、預(yù)雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件?；蛘咭部蓞⒄胀跎晡逯骶幍摹痘蛟\斷技術(shù)-非放射性操作手冊》；J.薩姆布魯克等主編的《分子克隆實驗指南》，科學出版社。
[0044]然后根據(jù)標記信號在基因芯片上的位置、強度等信息獲取待測信息。本發(fā)明所述檢測基因芯片雜交信號的方法是基于與抗生物素抗體或親和素或鏈親和素或抗地高辛抗體或抗熒光素抗體復(fù)合在一起的堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶催化的四氮唑藍(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺鹽(BCIP)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的顯色反應(yīng)。具體方法可參照王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》。若擴增產(chǎn)物用熒光基團標記，也可參照用熒光檢測設(shè)備(如激光共聚焦掃描儀SCanarray3000等)獲取待測信息。
[0045]本發(fā)明所制備的ALDH2基因SNP檢測芯片具有良好的信噪比，所設(shè)計的探針有良好的特異性，能準確區(qū)分各類型的突變位點，并且所述檢測方法步驟簡單。全自動化雜交過程更加方便快捷并且避免了人為操作過程中存在的諸多不確定因素。本發(fā)明提供的探針、特異性引物對及其試劑盒，可用于檢測ALDH2基因型，為人們了解自身的個體酒精代謝解毒能力、正確使用硝酸甘油提供信息。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1為實施例1本發(fā)明基因芯片上的一種點樣列陣。
[0047]圖2為實施例5中，用實施例1的芯片和探針檢測ALDH2基因時所得結(jié)果的照片?！揪唧w實施方式】
[0048]以下實施例是對本發(fā)明的更詳細說明，而不是對本發(fā)明范圍的限定。
[0049]所用基因序列的來源為NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心):
[0050]ALDH2 504Glu/Lys, rs671
[0051]實施例1基因芯片的制備[0052]人工合成(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)以下特異性探針，用水溶解為lOOpmol/ul濃度的溶液，然后用2X點樣buffer (產(chǎn)品編號:BST02010，上海百傲科技有限公司)等比混合。接著，用Affymetrix公司的GSM417點樣儀按說明書所述方法,在醒基修飾的載玻片(產(chǎn)品編號:BSM03011，上海百傲科技有限公司)上點制如圖1的陣列。室溫放置過夜。
[0053]各特異性探針序列如下:
[0054]檢測位點504Glu (GAA)的特異性寡核苷酸探針序列為:
[0055]NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT CAGGCATACACTGAAGTGAAAA ;檢測 504Lys (AAA)位點的特
異性寡核苷酸探針序列為:nh2-ttttttttttttttttgcaggcatacactaaagtgaaaact。即上述各探針分別為序列表中SEQ ID N0.1和4，且5’端還包含一段5’氨基(-NH2)修飾的16聚Polyd T (多聚脫氧胸苷酸)。
[0056]如圖1所示，在載玻片上點上質(zhì)控點、504G1U探針、504Lys探針、陰性對照探針和空白對照。其中O為質(zhì)控探針，I為ALDH2基因504Glu探針，2為ALDH2基因504Lys探針。
[0057]實施例2染色體DNA的制備
[0058]使用上海百傲科技有限公司血液DNA提取試劑盒按說明書操作如下:
[0059]吸附柱活化:
[0060]將吸附柱置于收集管中，加入500 μ L緩沖液BHl，靜置2_3min，12，OOOrpm(9，500Xg)離心30s ;棄去收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中，在吸附柱中加入500 μ L緩沖液BH2，12，OOOrpm (9，500 Xg)離心30s，棄去收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中待用。
[0061]操作程序:
[0062](I)將20 μ L的蛋白酶K用移液器加入到1.5mL離心管底部。
[0063](2)將200 μ L的血液樣品加入到離心管中。
[0064](3)加入200 μ L緩沖液BL到離心管中，振蕩混勻15s。
[0065](4)離心管 56°C保溫 lOmin。
[0066](5)短暫離心將離心管蓋的液滴離下。
[0067](6)加入200 μ L無水乙醇，振蕩混勻15s。短暫離心將離心管蓋的液滴離下。
[0068](7)取已活化的吸附柱套在2mL收集管中，將上述混合液小心加入吸附柱中，不要弄濕管口。蓋上管蓋，12，OOOrpm (9，500 X g)離心lmin，棄取裝廢液的收集管，將吸附柱插入新的收集管中。
[0069](8)小心打開吸附柱的管蓋,加入500 μ L緩沖液BWl,不要弄濕管口。蓋上管蓋，12, OOOrpm (9，500Xg)離心lmin,倒掉廢液,將吸附柱插入收集管中。
[0070](9)小心打開吸附柱的管蓋,加入500 μ L緩沖液BW2,不要弄濕管口。蓋上管蓋，
12,OOOrpm (9，500Xg)離心lmin,倒掉廢液,將吸附柱插入收集管中。
[0071](10)將吸附柱插入收集管中。12，OOOrpm (9，500Xg)離心lmin。
[0072](11)將吸附柱插入干凈的1.5mL無菌離心管，棄去裝廢液的收集管。小心打開吸附柱的管蓋，加入60 μ L的洗脫液BE或去離子水。室溫(15~25°C)放置5min，然后
12,OOOrpm (9, 500)離心 lmin。
[0073](12)抽提好的DNA放置_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。[0074]實施例3用本發(fā)明提供的引物通過PCR方法擴增ALDH2基因片段
[0075]委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物，引物信息如下。
[0076]用于擴增和檢測ALDH2基因504Glu/Lys的引物對序列為:
[0077]SEQ ID N0.7:上游 5，-AAGACTTTGGGGCAATACAG-3，，
[0078]SEQ ID N0.8:下游 5，-GGGTAAAATTCGGACTCTTC-3，。
[0079]并且，引物的5’端用生物素進行修飾。
[0080]然后用水溶解并稀釋至lOpmol/μ I。將購置的Taq酶(TaKaRa)UOX緩沖液(TaKaRa)、dNTP (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、純水以及實施例2獲得的PCR擴增模板按以下表1配方配制PCR擴增體系:
[0081]表1
【權(quán)利要求】
1.一組用于檢測ALDH2基因SNP位點的特異性寡核苷酸探針，其特征在于，所述特異性寡核苷酸探針用于檢測ALDH2基因rs671的504Glu/Lys SNP位點； 所述的檢測位點為504Glu時，特異性寡核苷酸探針序列為含有以下核苷酸序列之一:
(1)SEQID N0.1:5’-CAGGCATACACTGAAGTGAAAA-3’ ；
(2)SEQ ID N0.2:5’-GGCATACACTGAAGTGAAAACTG-3’ ；
(3)SEQ ID N0.3:5’-AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT-3 ； 所述的檢測位點為504Lys時，特異性寡核苷酸探針序列含有以下核苷酸序列之一:
(4)SEQ ID N0.4:5’-GCAGGCATACACTAAAGTGAAAACT-3’
(5)SEQ ID N0.5:5’-GGCATACACTAAAGTGAAAACTG-3’
(6)SEQ ID N0.6:5’-CTGCAGGCATACACTAAAGTGAA-3’。
2.權(quán)利要求1所述用于檢測ALDH2基因SNP位點的特異性寡核苷酸探針，其特征在于， 所述的檢測位點為504Glu時，特異性寡核苷酸探針序列為以下核苷酸序列之一:
(1)SEQID N0.1:5’-CAGGCATACACTGAAGTGAAAA-3’ ；
(2)SEQ ID N0.2:5’-GGCATACACTGAAGTGAAAACTG-3’ ；
(3)SEQ ID N0.3:5’-AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT-3 ； 所述的檢測位點為504Lys時，特異性寡核苷酸探針序列為以下核苷酸序列之一:
(4)SEQ ID N0.4:5’-GCAGGCATACACTAAAGTGAAAACT-3’
(5)SEQ ID N0.5:5’-GGCATACACTAAAGTGAAAACTG-3’
(6)SEQ ID N0.6:5’-CTGCAGGCATACACTAAAGTGAA-3’。
3.權(quán)利要求1所述用于檢測ALDH2基因SNP位點的特異性寡核苷酸探針，其特征在于，所述的檢測位點為504Glu時，特異性寡核苷酸探針序列為以下核苷酸序列之一，并且其5’端還包含5’氨基修飾的聚脫氧胸苷酸，聚脫氧胸苷酸長度為5~25:
(1)SEQID N0.1:5’-CAGGCATACACTGAAGTGAAAA-3’ ；
(2)SEQ ID N0.2:5’-GGCATACACTGAAGTGAAAACTG-3’ ；
(3)SEQ ID N0.3:5’-AGGCATACACTGAAGTGAAAACTGT-3 ； 所述的檢測位點為504Lys時，特異性寡核苷酸探針序列為以下核苷酸序列之一，并且其5’端還包含一段5’氨基修飾的聚脫氧胸苷酸，聚脫氧胸苷酸長度為5~25:
(4)SEQ ID N0.4:5’-GCAGGCATACACTAAAGTGAAAACT-3’ ；
(5)SEQ ID N0.5:5’-GGCATACACTAAAGTGAAAACTG-3’ ；
(6)SEQ ID N0.6:5’-CTGCAGGCATACACTAAAGTGAA-3’。
4.一組用于檢測ALDH2基因SNP位點的引物對，其特征在于，所述引物對是用于擴增ALDH2rs671504Glu/Lys的特異性引物對，含有以下核苷酸序列之一:
(1)上游SEQ ID N0.7:5’ -AAGACTTTGGGGCAATACAG-3’
下游 SEQ ID N0.8:5’ -GGGTAAAATTCGGACTCTTC-3’，或，
(2)上游SEQ ID N0.9:5’ -GGGGGTCCTGGGAGTGTAAC-3’
下游 SEQ ID N0.10:5，-CCTAAATCCCAGACGACCCG-3，，或，
(3)上游SEQ ID N0.11:5’ -AGTGTAACCCATAACCCCCA-3’
下游 SEQ ID N0.12:5’ -CATTTCTGGGTCGGAGACGA-3 ’。
5.權(quán)利要求4所述用于檢測ALDH2基因SNP位點的引物對，其特征在于，所述引物對序列選自以下核苷酸序列之一:
(1)上游SEQ ID N0.7:5’ -AAGACTTTGGGGCAATACAG-3’
下游 SEQ ID N0.8:5’ -GGGTAAAATTCGGACTCTTC-3’，或，
(2)上游SEQ ID N0.9:5’ -GGGGGTCCTGGGAGTGTAAC-3’
下游 SEQ ID N0.10:5，-CCTAAATCCCAGACGACCCG-3，，或，
(3)上游SEQ ID N0.11:5’ -AGTGTAACCCATAACCCCCA-3’
下游 SEQ ID N0.12:5’ -CATTTCTGGGTCGGAGACGA-3 ’。
6.權(quán)利要求4或5所述用于檢測ALDH2基因SNP位點的引物對，其特征在于，所述的SEQ ID N0.7~12的核苷酸序列5’端用生物素、地高辛、熒光素、熒光素衍生物、熒光分子、堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶進行了修飾。
7.權(quán)利要求1~3任一項所述的特異性寡核苷酸探針用于制備ALDH2基因SNP檢測芯片或試劑盒。
8.權(quán)利要求4~6任一項所述的引物對用于制備ALDH2基因SNP檢測芯片或試劑盒。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540675SQ201310530079
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】邢軍芬, 朱濱, 孫悅, 張宇, 張瑩 申請人:上海百傲科技股份有限公司