利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)l-乳酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，以蔗渣為原料，通過(guò)原料預(yù)處理、纖維素酶解，以霉菌為發(fā)酵菌種，以蔗渣纖維素的酶解液為碳源，游離細(xì)胞發(fā)酵或固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。該法原料易得、成本低廉；酶解得到的還原糖量與其他報(bào)道相比較高，發(fā)酵周期短，發(fā)酵液分離容易，產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率高；既可采用游離發(fā)酵，也可進(jìn)行固定化發(fā)酵，后者固定細(xì)胞可重復(fù)利用，產(chǎn)酸率穩(wěn)定，乳酸轉(zhuǎn)化率高?？傊?，本發(fā)明是一種適應(yīng)于工業(yè)化的高效轉(zhuǎn)化蔗渣纖維素生產(chǎn)L-乳酸的方法，大大降低了乳酸的生產(chǎn)成本，解決了乳酸菌發(fā)酵過(guò)程難控制以及游離細(xì)胞對(duì)分離提純?cè)斐傻碾y度問(wèn)題，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸的【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]L-乳酸(L-lactic acid)是在微生物發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)L-乳酸脫氫酶的催化作用將丙酮酸轉(zhuǎn)換成的左旋乳酸。與D-乳酸相比，由于L -乳酸可被人體直接吸收，且無(wú)任何副作用，所以被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。
[0003]目前發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的微生物主要是乳酸菌和根霉菌，乳酸菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分要求高，而且是兼性厭氧型微生物，發(fā)酵過(guò)程中不好控制，生產(chǎn)的L-乳酸光學(xué)純度也不高。傳統(tǒng)發(fā)酵多采用游離細(xì)胞發(fā)酵方式，游離發(fā)酵中，真菌菌絲比較發(fā)達(dá)，經(jīng)常出現(xiàn)凝塊和結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，懸浮的菌絲體還會(huì)增加發(fā)酵液的粘度，減少了細(xì)胞間的氧氣傳遞，降低了乳酸的產(chǎn)量，而且對(duì)后續(xù)的分離過(guò)程也有影響，分離難度大，得到的產(chǎn)物少。
[0004]生產(chǎn)成本是制約L-乳酸應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。工業(yè)化生產(chǎn)都采用淀粉質(zhì)原料，這大大增加了生產(chǎn)成本。而一些廉價(jià)可再生的原料，如生物質(zhì)原料，含有豐富的碳水化合物，可用于L-乳酸的生產(chǎn)。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年產(chǎn)生上億噸的農(nóng)林廢棄物，但是只有極少數(shù)被有效地利用，大部分被作為廢棄物丟掉。這不僅浪費(fèi)了豐富的可再生資源，而且也污染了環(huán)境。因此，若能利用這些生物質(zhì)纖維素來(lái)生產(chǎn)L-乳酸等各類高附加值產(chǎn)品，走“變廢為寶”的路線，應(yīng)用前景 將非常廣闊。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種生產(chǎn)成本低、發(fā)酵周期短、工藝簡(jiǎn)單可控、產(chǎn)品純度高的利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，以蔗渣為原料，通過(guò)原料預(yù)處理、纖維素酶解，以霉菌為發(fā)酵菌種，以蔗渣纖維素的酶解液為碳源，游離細(xì)胞發(fā)酵或固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。
[0007]原料預(yù)處理按以下操作進(jìn)行:用粉碎機(jī)粉碎蔗渣，過(guò)20-40目篩；精確稱取過(guò)篩后的蔗渣30g，按料液比為1:30加入質(zhì)量濃度為0.6-0.8%的H2O2和3_5%的NaOH混合溶液，于85°C下攪拌3-5h ;抽濾，用蒸餾水洗滌至濾液為中性，殘?jiān)?05°C干燥箱中干燥至恒重，再用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)20-40目篩，收集備用。
[0008]纖維素酶解按以下操作進(jìn)行:精確稱取預(yù)處理后的蔗渣，按每g蔗渣加入濃度為10mg/mL的纖維素酶液4_8mL，底物濃度28_66g/L，pH4.0-5.4的檸檬酸緩沖溶液17_21mL，于45-55°C、轉(zhuǎn)速120r/min的恒溫水浴鍋中酶解36_60h，然后煮沸滅酶活，離心分離，回收酶解液備用，測(cè)定酶解液中的還原糖含量。
[0009]上述利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，采用游離細(xì)胞發(fā)酵方式，按以下操作進(jìn)行:[0010]〈1>斜面培養(yǎng):將菌種米根霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)4-6天，后于4°C冰箱中保存；
[0011]〈2>孢子懸浮液:取一支已培養(yǎng)好的斜面菌種，用無(wú)菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無(wú)菌的玻璃珠充分打散，用滅菌的脫脂棉過(guò)濾，用無(wú)菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個(gè)孢子/mL ；
[0012]<3>種子培養(yǎng):將孢子懸浮液按4%的接種量接入到裝液量為20_70mL的三角瓶中，于28-32°C、200r/min下培養(yǎng)12_24h，制成種子培養(yǎng)液；
[0013]<4>發(fā)酵培養(yǎng):將種子培養(yǎng)液按10-14%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，30°C、180-200r/min下，發(fā)酵36_72h，得到含發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的發(fā)酵液；發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，取清液，按EDTA法測(cè)定L-乳酸的濃度，計(jì)算L-乳酸的轉(zhuǎn)化率(L-乳酸的轉(zhuǎn)化率=(L-乳酸的濃度/還原糖的濃度)X 100%)。
[0014]斜面培養(yǎng)基按以下配制:馬鈴薯200g，加水1000mL,葡萄糖15_25g，瓊脂15_25g，加熱溶解分裝試管，121°C滅菌20min ；
[0015]種子培養(yǎng)基按以下配制:葡萄糖為50_70g/L，酵母膏(氮源)5_7g/L，KH2PO40.3-0.5g/L, MgSO4.7Η200.2-0.4g/L, ZnSO4.7Η200.08g/L, CaC0310g/L, 121。。滅菌20min, CaCO3分開(kāi)滅菌。
[0016]發(fā)酵培養(yǎng)基按以下配制:酶解液30-38g/L，(NH4) 2S043_7g/L，KH2PO40.2-0.4g/L，MgSO4.7Η200.2-0.4g/L, ZnSO4.7Η200.04-0.08g/L, CaC0310_30g/L，121。。滅菌 20min, CaCO3分開(kāi)滅菌。
[0017]上述利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，采用固定化細(xì)胞發(fā)酵方式，按以下操作進(jìn)行:
[0018]〈1>斜面培養(yǎng):將菌種米根`霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)4-6天，后于4°C冰箱中保存；
[0019]<2>孢子懸浮液:取一支已培養(yǎng)好的斜面菌種，用無(wú)菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無(wú)菌的玻璃珠充分打散，用滅菌的脫脂棉過(guò)濾，用無(wú)菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個(gè)孢子/mL ；
[0020]<3>ACA微膠囊法固定化細(xì)胞制備:將滅菌的質(zhì)量濃度為1.5-2.5%的海藻酸鈉和制備好的孢子懸浮液(按5:1)—起混合于滅過(guò)菌的三角瓶中充分搖勻；用同一型號(hào)的注射器(內(nèi)徑Imm)將混合液逐滴加入到質(zhì)量濃度2.0-3.0%的CaCl2溶液中，鈣化0.5-1.5h，形成直徑為3-4mm的海藻酸鈣微球，去掉上清液,用無(wú)菌水洗去CaCl2,再于質(zhì)量濃度0.4-0.8%的殼聚糖溶液(溶于1%的冰醋酸溶液)中成膜15min，棄去多余的殼聚糖，洗凈，用0.15%的海藻酸鈉溶液處理微膠囊表面5min，再用0.075mol/L的檸檬酸鈉溶液囊內(nèi)液化15_25min，濾去處理液，用無(wú)菌水洗凈，用無(wú)菌生理鹽水于4°C下保存(不超過(guò)3天)，備用。
[0021]<4>固定化細(xì)胞培養(yǎng):將固定化細(xì)胞接入到裝液量為50mL的三角瓶中，于30°C、200r/min下培養(yǎng)12_24h，制成固定化細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0022]<5>發(fā)酵培養(yǎng):將固定化細(xì)胞培養(yǎng)液按10-14%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，30°C、180-200r/min下，發(fā)酵36_50h，得到含發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的發(fā)酵液；發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，取清液，按EDTA法測(cè)定L-乳酸的濃度，計(jì)算L-乳酸的轉(zhuǎn)化率(L-乳酸的轉(zhuǎn)化率=(L-乳酸的濃度/還原糖的濃度)X 100%。[0023]固定化發(fā)酵時(shí)間為36h。
[0024]固定化細(xì)胞的重復(fù)利用批次為7批。
[0025]針對(duì)目前L-乳酸生產(chǎn)存在的問(wèn)題，發(fā)明人以蔗渣為原料，首次建立了利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，通過(guò)原料預(yù)處理、纖維素酶解，以霉菌為發(fā)酵菌種，以蔗渣纖維素的酶解液為碳源，游離細(xì)胞發(fā)酵或固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。該法原料易得、成本低廉；酶解得到的還原糖量與其他報(bào)道相比較高，發(fā)酵周期短，發(fā)酵液分離容易，產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率高；既可采用游離發(fā)酵，也可進(jìn)行固定化發(fā)酵，后者固定細(xì)胞可重復(fù)利用，產(chǎn)酸率穩(wěn)定。總之，本發(fā)明是一種適應(yīng)于工業(yè)化的高效轉(zhuǎn)化蔗渣纖維素生產(chǎn)L-乳酸的方法，大大降低了乳酸的生產(chǎn)成本，解決了乳酸菌發(fā)酵過(guò)程難控制以及游離細(xì)胞對(duì)分離提純?cè)斐傻碾y度問(wèn)題，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1蔗渣纖維素的酶解
[0027]用粉碎機(jī)粉碎蔗渣，過(guò)20目篩；精確稱取過(guò)篩后的蔗渣30g，按料液比為1:30加入質(zhì)量濃度為0.7%的H2O2和4%的NaOH混合溶液，于85°C下攪拌4h ;抽濾，用蒸餾水洗滌至濾液為中性，殘?jiān)?05°C干燥箱中干燥至恒重，再用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，收集備用。
[0028]精確稱取預(yù)處理后的蔗渣lg，加入濃度為10mg/mL的纖維素酶液7mL，底物濃度40g/L，pH5.0的檸檬酸緩沖溶液18mL，于50°C、轉(zhuǎn)速120r/min的恒溫水浴鍋中酶解36h，然后煮沸滅酶活，離心分離，回收酶解液備用。
[0029]利用DNS法測(cè)定酶解液中的還原糖的濃度，結(jié)果顯示，測(cè)得酶解液中還原糖濃度為 34.36g/L。
[0030]實(shí)施例2游離細(xì)胞發(fā)酵
[0031]<1>斜面培養(yǎng)基的配制:將馬鈴薯去皮，稱取200g，加水1000mL,煮沸30min，過(guò)濾，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)至1000mL,加入葡萄糖20g,瓊脂20g,加熱溶解分裝試管，121°C滅菌20min，傾斜擺放，冷卻即得；
[0032]〈2>菌種的斜面培養(yǎng):將菌種米根霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)5天，后于4°C冰箱中保存；
[0033]<3>孢子懸浮液的制備:取一支已培養(yǎng)好的斜面菌種，用無(wú)菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無(wú)菌的玻璃珠充分打散，用滅菌的脫脂棉過(guò)濾，用無(wú)菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個(gè)孢子/mL ；
[0034]<4>按以下配方“葡萄糖為60g/L,酵母膏(氮源)7g/L, KH2PO40.4g/L,MgSO4.7H200.3g/L, ZnSO4.7H200.08g/L, CaC0310g/L” 配成 50mL 的種子培養(yǎng)基，121°C滅菌20min, CaCO3分開(kāi)滅菌。
[0035]<5>種子培養(yǎng):將孢子懸浮液按4%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，于30°C、200r/min下培養(yǎng)18h，制成種子培養(yǎng)液；
[0036]〈6> 發(fā)酵培養(yǎng)基按以下配制:酶解液 36.49g/L，(NH4) 2S045g/L，KH2PO40.4g/L,MgSO4.7H200.2g/L, ZnSO4.7H200.04g/L, CaC0320g/L, 121°C滅菌 20min，CaCO3 分開(kāi)滅菌。
[0037]<7>游離細(xì)胞發(fā)酵:將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為50mL的三角瓶中，30°C、200r/min下， 發(fā)酵72h，得到含發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的發(fā)酵液。[0038]發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，取清液，按EDTA法測(cè)定L-乳酸的濃度，計(jì)算L-乳酸的轉(zhuǎn)化率(L-乳酸的轉(zhuǎn)化率=(L-乳酸的濃度/還原糖的濃度)X 100%)，測(cè)得的乳酸的轉(zhuǎn)化率為28.45%。
[0039]實(shí)施例3固定化細(xì)胞發(fā)酵
[0040]<1>斜面培養(yǎng)基的配制:將馬鈴薯去皮，稱取200g，加水1000mL,煮沸30min，過(guò)濾，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)至1000mL,加入葡萄糖20g,瓊脂15g,加熱溶解分裝試管，121°C滅菌20min，傾斜擺放，冷卻即得；
[0041]〈2>菌種的斜面培養(yǎng):將菌種米根霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)5天，后于4°C冰箱中保存；
[0042]<3>孢子懸浮液的制備:取一支已培養(yǎng)好的斜面菌種，用無(wú)菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無(wú)菌的玻璃珠充分打散，用滅菌的脫脂棉過(guò)濾，用無(wú)菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個(gè)孢子/mL ；
[0043]<4>ACA微膠囊法固定化細(xì)胞制備:將滅菌的質(zhì)量濃度為1.5%的海藻酸鈉和制備好的孢子懸浮液(按5:1)—起混合于滅過(guò)菌的三角瓶中充分搖勻；用同一型號(hào)的注射器(內(nèi)徑Imm)將混合液逐滴加入到質(zhì)量濃度2.5%的CaCl2溶液中，鈣化lh，形成直徑為3_4_的海藻酸鈣微球，去掉上清液，用無(wú)菌水洗去CaCl2,再于質(zhì)量濃度0.6%的殼聚糖溶液(溶于1%的冰醋酸溶液)中成膜15min，棄去多余的殼聚糖，洗凈，用0.15%的海藻酸鈉溶液處理微膠囊表面5min，再用0.075mol/L的檸檬酸鈉溶液囊內(nèi)液化15min，濾去處理液，用無(wú)菌水洗凈，用無(wú)菌生理鹽水于4°C下保存(不超過(guò)3天)，備用。
[0044]<5>按以下配方“葡萄糖為50g/L,酵母膏(氮源)7g/L, KH2PO40.4g/L,MgSO4.7H200.4g/L, ZnSO4.7H200.08g/L, CaC0310g/L” 配成 50mL 的種子培養(yǎng)基，121°C滅菌20min, CaCO3分開(kāi)滅菌。`
[0045]<5>固定化細(xì)胞培養(yǎng):將固定化細(xì)胞接入到裝液量為50mL的三角瓶中，于30°C、200r/min下培養(yǎng)24h，制成固定化細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0046]〈6> 發(fā)酵培養(yǎng)基按以下配制:酶解液 36.49g/L，(NH4) 2S045g/L，KH2PO40.4g/L,MgSO4.7H200.3g/L, ZnSO4.7H200.06g/L, CaC0320g/L, 121°C滅菌 20min，CaCO3 分開(kāi)滅菌。
[0047]<7>固定化細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng):將固定化細(xì)胞培養(yǎng)液按14%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，30°C、200r/min下，發(fā)酵36h，得到含發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的發(fā)酵液。
[0048]發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行抽濾，取清液，按EDTA法測(cè)定L-乳酸的濃度，計(jì)算L-乳酸的轉(zhuǎn)化率(L-乳酸的轉(zhuǎn)化率=(L-乳酸的濃度/還原糖的濃度)X 100%，結(jié)果測(cè)得乳酸的轉(zhuǎn)化率為31%。
[0049]<8>固定化細(xì)胞的重復(fù)利用發(fā)酵:待第一批發(fā)酵結(jié)束后，在無(wú)菌條件下，用紗布過(guò)濾發(fā)酵液，用無(wú)菌生理鹽水洗凈固定化小球，接入到新鮮的培養(yǎng)基，于30°C，200r/min下發(fā)酵36h，發(fā)酵結(jié)束，重復(fù)上面的操作，用EDTA法測(cè)定每批發(fā)酵液中乳酸的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重復(fù)利用的批次為7批，之后乳酸轉(zhuǎn)化率呈下降的趨勢(shì)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于以蔗渣為原料，通過(guò)原料預(yù)處理、纖維素酶解，以霉菌為發(fā)酵菌種，以蔗渣纖維素的酶解液為碳源，游離細(xì)胞發(fā)酵或固定化細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于原料預(yù)處理按以下操作進(jìn)行:用粉碎機(jī)粉碎蔗渣，過(guò)20-40目篩；精確稱取過(guò)篩后的蔗渣30g，按料液比為1:30加入質(zhì)量濃度為0.6-0.8%的H2O2和3-5%的NaOH混合溶液，于85°C下攪拌3-5h;抽濾，用蒸餾水洗滌至濾液為中性，殘?jiān)?05°C干燥箱中干燥至恒重，再用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)20-40目篩，收集備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于纖維素酶解按以下操作進(jìn)行:精確稱取預(yù)處理后的蔗渣，按每g蔗渣加入濃度為lOmg/mL的纖維素酶液4-8mL，底物濃度28-66g/L，pH4.0-5.4的檸檬酸緩沖溶液17_21mL，于45_55°C、轉(zhuǎn)速120r/min的恒溫水浴鍋中酶解36_60h，然后煮沸滅酶活，離心分離，回收酶解液備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于采用游離細(xì)胞發(fā)酵方式，按以下操作進(jìn)行: 〈1>斜面培養(yǎng):將菌種米根霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)4-6天，后于4°C冰箱中保存； <2>孢子懸浮液:取一支已培養(yǎng)好的斜面菌種，用無(wú)菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無(wú)菌的玻璃珠充分打散,用滅菌的脫脂棉過(guò)濾,用無(wú)菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個(gè)孢子/mL ； <3>種子培養(yǎng):將孢子懸浮液按4%的接種量接入到裝液量為20-70mL的三角瓶中，于28-320C >200r/min下培養(yǎng)12_24h，制成種子培養(yǎng)液； <4>發(fā)酵培養(yǎng):將種子培養(yǎng)液按10-14%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，300C、180-200r/min下，發(fā)酵36_72h，得到含發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的發(fā)酵液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于: 所述斜面培養(yǎng)基按以下配制:馬鈴薯200g，加水lOOOmL，葡萄糖15_25g，瓊脂15_25g，加熱溶解分裝試管，121°C滅菌20min ； 所述種子培養(yǎng)基按以下配制:葡萄糖為50-70g/L，酵母膏5-7g/L，KH2PO40.3-0.5g/L，MgSO4.7Η200.2-0.4g/L, ZnSO4.7Η200.08g/L, CaC0310g/L, 121。。滅菌 20min, CaCO3 分開(kāi)滅菌； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基按以下配制:酶解液30-38g/L，(NH4) 2S043-7g/L，KH2PO40.2-0.4g/L，MgSO4.7Η200.2-0.4g/L, ZnSO4.7Η200.04-0.08g/L, CaC0310_30g/L，121。。滅菌 20min, CaCO3分開(kāi)滅菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于采用固定化細(xì)胞發(fā)酵方式，按以下操作進(jìn)行: 〈1>斜面培養(yǎng):將菌種米根霉(Gim3.129)接入滅菌的試管PDA培養(yǎng)基中，于28°C培養(yǎng)4-6天，后于4°C冰箱中保存； <2>孢子懸浮液:取一支已培養(yǎng)好的斜面菌種，用無(wú)菌生理鹽水將斜面上的孢子洗下，于滅菌的三角瓶中，加入無(wú)菌的玻璃珠充分打散,用滅菌的脫脂棉過(guò)濾,用無(wú)菌水沖洗濾渣，使濾液體積為30mL，稀釋至孢子懸浮液含I X IO7個(gè)孢子/mL ；<3>ACA微膠囊法固定化細(xì)胞制備:將滅菌的質(zhì)量濃度為1.5-2.5%的海藻酸鈉和制備好的孢子懸浮液按5:1 —起混合于滅過(guò)菌的三角瓶中充分搖勻；用內(nèi)徑1_同一型號(hào)的注射器將混合液逐滴加入到質(zhì)量濃度2.0-3.0%的CaCl2溶液中，鈣化0.5-1.5h，形成直徑為3-4mm的海藻酸鈣微球，去掉上清液，用無(wú)菌水洗去CaCl2,再于質(zhì)量濃度0.4-0.8%的殼聚糖溶液(溶于1%的冰醋酸溶液)中成膜15min，棄去多余的殼聚糖，洗凈，用0.15%的海藻酸鈉溶液處理微膠囊表面5min，再用0.075mol/L的檸檬酸鈉溶液囊內(nèi)液化15_25min，濾去處理液，用無(wú)菌水洗凈，用無(wú)菌生理鹽水于4°C下保存，備用； <4>固定化細(xì)胞培養(yǎng):將固定化細(xì)胞接入到裝液量為50mL的三角瓶中，于30°C、200r/min下培養(yǎng)12-24h，制成固定化細(xì)胞培養(yǎng)液； <5>發(fā)酵培養(yǎng):將固定化細(xì)胞培養(yǎng)液按10-14%的接種量接入到裝液量為50mL的三角瓶中，300C、180-200r/min下，發(fā)酵36_50h，得到含發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的發(fā)酵液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于:所述固定化發(fā)酵時(shí)間為36h。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用蔗渣纖維素發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于:固定化細(xì)胞的重復(fù)利用批次為7批。`
【文檔編號(hào)】C12P7/56GK103627739SQ201310691303
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月12日
【發(fā)明者】孫衛(wèi)東, 唐艷瓊, 戴莉, 唐湘毅, 蘇芬芬 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)