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利用pFastBacDual桿狀病毒表達PCV2Cap蛋白的方法

文檔序號:411971閱讀:2559來源:國知局
專利名稱:利用pFast Bac Dual桿狀病毒表達PCV 2 Cap蛋白的方法
技術(shù)領域
本發(fā)明屬于基因工程領域,具體涉及一種利用pFast Bac Dual桿狀病毒表達豬圓環(huán)病毒2型(PCV2) Cap蛋白的方法。
背景技術(shù)
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種重要病原微生物,該病毒被認為是斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemicwasting syndrome, PMWS)的主要病原(Allan, Meehan et al. 1998)。PCV2 的感染,會使動物機體產(chǎn)生免疫抑制,使機體的免疫抵抗力下降,造成其它病原的繼發(fā)感染,從而引起
更加嚴重的臨床癥狀。PCV2除了引起PMWS以外,還可導致豬皮炎/腎病綜合征(Porcinedermatitis and nephropathy sundrome,PDNA)、豬呼吸道病復合癥(Porcine respiratorydisease complex, PRDC)等相關(guān)疾病(Allan, McNeilly et al.2000;Kim, Chung etal. 2003;Ramamoorthy and Meng2009)。PMWS自1991年首次在加拿大被發(fā)現(xiàn),目前在多個國家和地區(qū)存在該病的流行(Kennedy and Allanl998)。PCV2感染引起的相關(guān)疾病在我國的流行情況也十分嚴重,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失(朗洪武,張廣川等.2000;張朝霞,劉長明等.2008)。目前尚無控制和消滅PCV2感染的有效措施,雖然市場上有可以預防PCV2感染的疫苗,但是其價格高昂,大部分豬場無力使用。所以,加強對PCV2的檢測顯得尤為重要。檢測PCV2有效的方法有PCR、免疫組化、原位核酸雜交和ELISA技術(shù)。ELISA技術(shù)相對于其他技術(shù)具有高度敏感性與特異性,操作簡單、方便易行,便于大量樣品的檢測。PCV2基因組為單股環(huán)狀負鏈DNA,全長為1767bp或1768bp。PCV2的基因組共編碼11個開放閱讀框架(open reading frames, ORFs),其中功能上重要的是ORFl和0RF2。ORFl 編碼與病毒 DNA 滾環(huán)復制相關(guān)的 Rep 蛋白(Mankertz, Mankertz et al. 1998)。ORF2共有702個核苷酸,位于基因組互補鏈上,編碼病毒的核衣殼蛋白,即Cap蛋白。Cap蛋白是PCV2病毒粒子唯一的結(jié)構(gòu)蛋白,蛋白分子量大小約32kDa,同時也是PCV2主要的免疫原性蛋白。Cap蛋白的N端65 87aa、113 147aa、157 183aa區(qū)域及C端4個氨基酸為病毒的主要抗原位點。其中N端69 83aa和117 131aa兩個抗原位點具有針對PCV2型特異性,能被PCV2多抗所識別,N端157 183aa抗原位點為PCVl和PCV2共同具有。雖然PCVl和PCV2的Cap蛋白存在一個共同的抗原位點,但血清學實驗結(jié)果顯示,兩種血清型的Cap蛋白之間不存在抗原交叉性,這可能是因為整個Cap蛋白掩蓋了其共同的抗原位點。Cap蛋白經(jīng)體外表達后,能自我組裝成類病毒樣顆粒,具有PCV2病毒粒子的免疫學特性,在流行病學診斷及疫苗的研究中具有十分重要地位,因此Cap蛋白在體外的高效表達是PCV2的研究熱點。Cap蛋白的N端有一段由41個氨基酸組成的核定位信號肽(nuclearlocalization signal,NLS) (Liu, Tikoo et al. 2001),該 NLS 核酸序列含有約 30% 的大腸埃希菌稀有密碼子(Trundova and Celer2007),因此Cap蛋白在大腸埃希菌的原核表達系統(tǒng)里很難得到大量表達(Lou, Li et al.2011)。近年來,許多研究者嘗試利用桿狀病毒來表達具有其天然活性的Cap蛋白(樊惠英,陳煥春,黃洪亮等.2005;劉長明,陸月華,張超范等.2005),但是表達量都較低。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有方法中PCV2Cap蛋白表達量低、活性不足的缺陷,本發(fā)明的目的在于提供一種利用pFast Bac Dual桿狀病毒表達豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)Cap蛋白的方法,該方法利用Bac-to-Bac桿狀病毒高效表達系統(tǒng)中的pFast Bac Dual桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體來構(gòu)建表達Cap蛋白的重組桿狀病毒,添加His標簽,利用NI-NTA純化樹脂純化Cap蛋白,所得到的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白保持了其天然活性,并且是高效表達。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)
一種利用pFast Bac Dual桿狀病毒表達PCV2Cap蛋白的方法,包括以下步驟(I)抽提PCV2病毒的DNA ;根據(jù)PCV20RF2的序列設計引物,擴增得到帶有His標簽的編碼PCV2Cap蛋白的基因片段;(2)將步驟(I)擴增得到的基因片段連接到pFast Bac Dual質(zhì)粒上,獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pFast Bac-plO-ORF2-pH-ORF2 ;(3)將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast Bac-plO-ORF2-pH_ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac,發(fā)生轉(zhuǎn)座作用,經(jīng)藍白斑篩選后得到含有0RF2基因的重組穿梭載體Bac-plO-ORF2-pH-ORF2 ;(4)以脂質(zhì)體介導的方法將重組穿梭載體Bac-plO-ORF2-pH-ORF2轉(zhuǎn)染昆蟲細胞,獲得重組桿狀病毒Ac. Dual-Cap ;(5)將重組桿狀病毒Ac. Dual-Cap接毒于昆蟲細胞,培養(yǎng)后收集昆蟲細胞,重組Cap蛋白在昆蟲細胞的細胞核和細胞質(zhì)中獲得表達;將表達產(chǎn)物純化后得到重組Cap蛋白;步驟(I)所述引物的序列為PlOF :5’ - CCATGGATGCACCACCATCATCACCACACGTATCCAAGGAGGCGTTT-3’ PlOR :5,-TGCAGGTACCTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCT-3> ;PHF :5’ -GGATCCATGCACCACCATCATCACCACACGTATCCAAGGAGGCGTTT-3’ ;PHR :5,-CGCAAGCTTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTT-3> ;步驟(2)所述的將步驟(I)擴增得到的基因片段連接到pFast Bac Dual質(zhì)粒上,是將步驟(I)擴增得到的基因片段分別插入pFast Bac Dual質(zhì)粒plO啟動子下游的Ncol、KpnI克隆位點和pH啟動子下游的BamHI、HindIII克隆位點;步驟(4)所述的重組桿狀病毒Ac. Dual-Cap已于2012年5月4日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所),保藏號為CGMCC 6069,分類命名是重組假型桿狀病毒。步驟(4)和(5)所述的昆蟲細胞優(yōu)選Sf9昆蟲細胞;步驟(5)所述的純化是用NI-NTA樹脂純化。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果I、本發(fā)明利用pFast Bac Dual桿狀病毒表達系統(tǒng)表達PCV2Cap蛋白,能解決Cap蛋白在真核細胞中表達量低的難題,使得Cap蛋白在真核表達系統(tǒng)中成功獲得高效表達。2、本發(fā)明方法重組的Cap蛋白設計有His標簽,利于其后續(xù)的純化。3、本發(fā)明桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的Cap蛋白的生物活性優(yōu)于原核表達系統(tǒng)所表達的Cap蛋白,可以應用于流行病學診斷方法的建立及PCV2亞單位疫苗的研發(fā)。


圖I 是PCV20RF2 的PCR擴增凝膠電泳圖;其中,M-DNA Marker DL2000 ;1_PCR擴增產(chǎn)物 0RF2-1,含有 NcoI、KpnI 位點,約 720bp ;2_PCR 擴增產(chǎn)物 0RF2-2,含有 BamHI、HindIII位點,約720bp。圖2是重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的雙酶切鑒定凝膠電泳圖;其中,Ml-DNA MarkerDL15000 ;M2-DNA Marker DL2000 ;M3-DNA Markerlkb ladder ;l_NcoI、KpnI 雙酶切鑒定 0RF2-1 基 因與pFast Bac Dual質(zhì)粒的連接產(chǎn)物;2-BamHI、HindIII雙酶切鑒定重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-plO-ORF2-pH-ORF2。圖3是重組桿狀病毒Ac. Dual-Cap的間接免疫熒光試驗結(jié)果圖;其中,A-未接毒的正常Sf9昆蟲細胞(X200) ;B-重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞(X 200)。圖4是重組Cap蛋白的SDS-PAGE分析圖;其中,M-蛋白相對分子質(zhì)量標準;1_未接毒的Sf9昆蟲細胞對照;2、3-感染重組桿狀病毒的Sf9昆蟲細胞。圖5是重組Cap蛋白的Western Blot鑒定結(jié)果圖;其中,M-蛋白相對分子質(zhì)量標準;1_未接毒的Sf9昆蟲細胞對照;2_感染重組桿狀病毒的Sf9昆蟲細胞;3_純化后的Cap蛋白。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述,但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例一種利用pFast Bac Dual桿狀病毒表達系統(tǒng)表達PCV2Cap蛋白的方法,包括以下步驟一、重組穿梭載體Bac plO-ORF2-pH_ORF2的構(gòu)建I、PCV2 的 DNA 的提取將?(^2毒株^&11,¥6 et al. 2012)接種于無PCV污染的PK15細胞,于37°C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),然后收集并處理細胞,根據(jù)OMEGA公司的Blood DNAKit試劑盒說明書抽提PCV2的DNA,作為模板DNA。2、PCR引物設計根據(jù)PCV20RF2的序列設計2對特異性引物PlOF :5,-CCATGGATGCACCACCATCATCACCACACGTATCCAAGGAGGCGTTT-3’ ;PlOR :5,-TGCAGGTACCTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCT-3> ;PHF :5’ -GGATCCATGCACCACCATCATCACCACACGTATCCAAGGAGGCGTTT-3’ ;PHR :5,-CGCAAGCTTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTT-3> ;擴增含有His標簽的0RF2基因(約720bp)。四條引物分別包含NcoI、KpnI、BamHI、HindIII位點。引物由Invitrogen公司合成。3、0RF2基因的擴增PCR反應體系為50μ L,其中模板DNA1. 5μ L,上、下游引物(20pmol/L)各I μ L,dNTP s(2. 5mmol/L)4y L,IOXEx Taq Buffer5y L,Ex Taq DNA聚合酶(5U/μ L) 0. 5 μ L,去離子水37yL。PCR反應條件為94°C預變性3min ;進入PCR循環(huán),94°C變性30s,58°C退火45s,72°C延伸40s,進行30個循環(huán)后,72°C延伸IOmin。反應結(jié)束后,用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果(圖I ),并對PCR產(chǎn)物進行膠回收純化。4、重組轉(zhuǎn)移載體 pFast Bac-plO-ORF2-pH_ORF2 構(gòu)建對純化的PCR產(chǎn)物0RF2-1和pFast Bac Dual質(zhì)粒均進行Ncol、KpnI雙酶切,回收并純化酶切產(chǎn)物。用T4DNA Ligase酶連接0RF2-1基因和pFast Bac Dual質(zhì)粒,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞,通過雙酶切鑒定(圖2A)、DNA測序鑒定篩選陽性重組質(zhì)粒 。然后接著對純化的PCR產(chǎn)物0RF2-2和重組質(zhì)粒均進行BamHI、HindIII雙酶切,回收并純化酶切產(chǎn)物,T4DNA Ligase酶連接酶切后的0RF2-2和重組質(zhì)粒,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細胞,通過雙酶切鑒定(圖2B)、DNA測序鑒定獲得陽性重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-plO-ORF2-pH-ORF2。5、重組桿狀病毒穿梭載體的獲得取2 μ L重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast Bac-plO-ORF2-pH_ORF2轉(zhuǎn)化100 μ L含有穿梭載體Bacmid的DHlOBac大腸桿菌感受態(tài)細胞,冰浴30min后,于42°C水浴45s進行熱激,然后冰浴2min,加入900 μ L LB液體培養(yǎng)基(高鹽),37°C振搖培養(yǎng)4 5h,按10—1、10_2、10_3稀釋細胞后,各取 100 μ L 涂布于三抗高鹽 LB 平板(含 50 μ g/ml Kan, 7 μ g/ml Gen, 10 μ g/ml Tet),37°C培養(yǎng)36 48h,挑選白色菌落,在同樣的含三種抗生素的LB平板上繼續(xù)接種傳代一次,純化陽性菌落,挑取白斑于高鹽LB液體培養(yǎng)基中(含50 μ g/ml Kan, 7 μ g/ml Gen, 10 μ g/mlTet),37°C振搖培養(yǎng)至細菌對數(shù)生長期時,以通用pUC M13上、下游引物進行菌液PCR鑒定,陽性菌液進行提取穿梭質(zhì)粒,從而獲得重組桿狀病毒穿梭載體Bac-plO-ORF2-pH-ORF2。二、重組桿狀病毒Ac. Dual-Cap的獲得與Cap蛋白的表達I、轉(zhuǎn)染昆蟲細胞以LipofectaminTM2000為共轉(zhuǎn)染試劑,將上述獲得的重組穿梭載體Bac-plO-ORF2-pH-ORF2轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細胞中,轉(zhuǎn)染步驟如下選取生長狀態(tài)良好的Sf9細胞,加入少量Grace’s完全培養(yǎng)液輕輕吹下細胞,經(jīng)細胞計數(shù)后將其稀釋成濃度為I X IO6個/mL的Sf9細胞懸液,按2mL/孔接入6孔板,放置在27°C溫箱吸附lh。吸取3 μ g純化的重組Bacmid質(zhì)粒(指重組穿梭載體Bac-pl0-0RF2-pH-0RF2)分別加入100 μ I無血清Grace’s單純培養(yǎng)液中,輕輕混勻,作為A液。反復混勻共轉(zhuǎn)染試劑5 10次,然后吸取20 μ I加入100 μ I無血清Grace’s單純培養(yǎng)液中進行稀釋,作為B液。將A液和B液輕輕混勻后室溫孵育45 60min作為混合液。將6孔板中的含血清Grace’s培養(yǎng)液移去,并用無血清Grace’s單純培養(yǎng)液洗滌2次。向孵育好的混合液中補加O. 8mL的無血清Grace’ s單純培養(yǎng)液,輕輕混勻后加入6孔板,27°C培養(yǎng)4 6h。吸棄6孔板中轉(zhuǎn)染混合液,每孔加入2mL含血清Grace’ s完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至少72h,或直到觀察到細胞病變即可收毒。轉(zhuǎn)染后每12h觀察一次,直到細胞病變明顯時,收集細胞及上清液,全培養(yǎng)基,注意細胞的形態(tài)變化。轉(zhuǎn)染72h以上或細胞出現(xiàn)病變后收集細胞和上清,凍融一次后,500 Xg離心5min取上清,4°C避光保存,即為Pl代重組桿狀病毒Ac. Dual-Cap。2、P2、P3代重組桿狀病毒的擴增在6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)進行,病毒擴增當天,將活細胞數(shù)量大于97%的Sf9細胞用Grace’s完全培養(yǎng)基懸浮,調(diào)整濃度為I X IO6個/mL,每孔接種2mL,27°C貼附2h以上,再接種一定量的Pl代病毒液,27°C培養(yǎng)48 72h,收集培養(yǎng)上清,500 X g離心5min去除細胞和大的細胞碎片,避光保存于_80°C,即為P2代重組桿狀病。P3代病毒的擴增與P2代病毒的相同。3、間接免疫熒光檢測Cap蛋白在Sf9細胞中的表達于48孔細胞培養(yǎng)板中,P3代重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞96h后,吸棄培養(yǎng)上清,每孔用PBS (pH7. 4)洗滌2次,用_20°C預冷的丙酮-乙醇(3:2體積比)固定液_20°C 固定l(Tl5min,PBS洗滌3次,加入按1:30稀釋的抗PCV2的小鼠陽性血清(購自韓國JBT公司)為一抗,37°C作用30min,PBS洗3次每次5min,然后加入二抗(FITC標記的山羊抗鼠IgG),37°C作用30min,PBS洗3次每次5min。在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞的熒光并照相。未感染的Sf9昆蟲細胞同時作對照。結(jié)果表明成功獲得重組桿狀病毒Ac.Dual-Cap,且在Sf9昆蟲細胞中獲得表達,表達的Cap蛋白大部分存在于細胞核中(圖3)。4、SDS-PAGE和Western Blot檢測Cap蛋白在Sf9細胞中的表達于底面積為75cm2的細胞培養(yǎng)瓶中(約6X 106Sf9cells),P3代重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞96h后,吸棄培養(yǎng)上清,收集細胞,細胞用PBS(pH7. 4)洗滌2次,最后用500 μ IPBS重懸細胞,取30 μ I重懸液點樣跑SDS-PAGE檢測蛋白表達情況。結(jié)果顯示,重組Cap蛋白約占細胞總蛋白的15%,Cap蛋白表達量約為I· 5mg/6 X IO6Sf9ce11 s,重組Cap蛋白在Sf9昆蟲細胞中獲得較高表達(圖4、5)。5、純化重組Cap蛋白利用Ni-NTA純化樹脂純化表達的Cap蛋白。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式,但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化,均應為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.ー種利用pFast Bac Dual桿狀病毒表達PCV2Cap蛋白的方法,其特征在于包括以下步驟 (1)抽提PCV2病毒的DNA;根據(jù)PCV20RF2的序列設計引物,擴增得到帶有His標簽的編碼PCV2Cap蛋白的基因片段; (2)將步驟(I)擴增得到的基因片段連接到pFastBac Dual質(zhì)粒上,獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 pFast Bac-plO-ORF2-pH-ORF2 ; (3)將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-plO-ORF2-pH-ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBac,發(fā)生轉(zhuǎn)座作用,經(jīng)藍白斑篩選后得到含有ORF2基因的重組穿梭載體Bac-plO-ORF2-pH-ORF2 ; (4)以脂質(zhì)體介導的方法將重組穿梭載體Bac-p10-0RF2-pH-0RF2轉(zhuǎn)染昆蟲細胞,獲得重組桿狀病毒Ac. Dual-Cap ; (5)將重組桿狀病毒Ac.Dual-Cap接毒于昆蟲細胞,培養(yǎng)后收集昆蟲細胞,重組Cap蛋白在昆蟲細胞的細胞核和細胞質(zhì)中獲得表達;將表達產(chǎn)物純化后得到重組Cap蛋白; 步驟(I)所述引物的序列為PIOF : 5 ’ - CCATGGATGCACCACCATCATCACCACACGTATCCAAGGAGGCGTTT-3,;PlOR :5’ -TGCAGGTACCTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCT-3> ;PHF :5’ -GGATCCATGCACCACCATCATCACCACACGTATCCAAGGAGGCGTTT-3’ ;PHR :5,-CGCAAGCTTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTT-3> ; 步驟(5)所述的純化是用NI-NTA樹脂純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用pFastBac Dual桿狀病毒表達PCV2Cap蛋白的方法,其特征在干步驟(2)所述的將步驟(I)擴增得到的基因片段連接到pFast Bac Dual質(zhì)粒上,是將步驟(I)擴增得到的基因片段分別插入pFast Bac Dual質(zhì)粒plO啟動子下游的Ncol、KpnI克隆位點和pH啟動子下游的BamHI、HindIII克隆位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用pFastBac Dual桿狀病毒表達PCV2Cap蛋白的方法,其特征在于步驟(4)和(5)所述的昆蟲細胞為Sf9昆蟲細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用pFast Bac Dual桿狀病毒表達PCV2Cap蛋白的方法,該方法包括以下步驟擴增帶有His標簽的編碼PCV 2 Cap蛋白的基因片段;將上述基因片段連接到pFast Bac Dual質(zhì)粒上,獲得重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast Bac-p10-ORF2-pH-ORF2;將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac,經(jīng)藍白斑篩選后得到重組穿梭載體Bac-p10-ORF2-pH-ORF2;將重組穿梭載體轉(zhuǎn)染昆蟲細胞,獲得重組桿狀病毒Ac.Dual-Cap;將重組桿狀病毒接毒于昆蟲細胞,培養(yǎng)后收集昆蟲細胞,將表達產(chǎn)物純化后得到重組Cap蛋白。本發(fā)明方法解決了Cap蛋白在真核細胞中表達量低的難題。本發(fā)明方法重組的Cap蛋白設計有His標簽,利于其后續(xù)的純化,并且其生物活性優(yōu)于原核表達系統(tǒng)所表達的Cap蛋白,可以應用于流行病學診斷方法的建立及PCV2亞單位疫苗的研發(fā)。
文檔編號C12N15/866GK102839195SQ201210248620
公開日2012年12月26日 申請日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者樊惠英, 廖明, 陳春麗, 葉昱, 張 杰 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學
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