專利名稱：利用pCold-sumo表達(dá)載體高效表達(dá)PCV 2 Cap蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用pCold-sumo表達(dá)載體高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的缺失核定位信號(hào)肽的Cap蛋白的方法。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種重要病原微生物，該病毒被認(rèn)為是斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemicwasting syndrome,PMWS)的主要病原(Allan, Meehan et al. 1998)。PCV2 的感染，會(huì)使動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫抑制，使機(jī)體的免疫抵抗力下降，造成其它病原的繼發(fā)感染，從而引起更加嚴(yán)重的臨床癥狀。PCV2除了引起PMWS而外，還可導(dǎo)致豬皮炎/腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy sundrome, PDNA)、豬呼吸道病復(fù)合癥(Porcine respiratorydisease complex, PRDC)等相關(guān)疾病(Allan, McNeilly et al. 2000;Kim, Chung etal. 2003; Ramamoorthy and Meng2009)。PMWS自1991年首次在加拿大被發(fā)現(xiàn)，目前多個(gè)國(guó)家和地區(qū)存在該病的流行(Kennedy and Allanl998)。PCV2感染引起的相關(guān)疾病在我國(guó)的流行情況也十分嚴(yán)重(朗洪武，張廣川等.2000;張朝霞，劉長(zhǎng)明等.2008)。雖然目前市場(chǎng)上開始出現(xiàn)可以預(yù)防PCV2感染的疫苗，但是其價(jià)格高昂，大部分豬場(chǎng)無力使用，并且其質(zhì)量參差不齊，豬場(chǎng)仍然無控制和消滅pCV2感染的有效措施。所以PCV2給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2基因組為單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA，全長(zhǎng)為1767bp或1768bp。PCV2的基因組共編碼11個(gè)開放閱讀框架(open reading frames, ORFs),其中功能上重要的是ORFl和0RF2。ORFl 編碼與病毒 DNA 滾環(huán)復(fù)制相關(guān)的 Rep 蛋白(Mankertz, Mankertz et al. 1998)。ORF2共有702個(gè)核苷酸，位于基因組互補(bǔ)鏈上，編碼病毒的核衣殼蛋白，即Cap蛋白。Cap蛋白是PCV2病毒粒子唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，蛋白分子量大小約32kDa，同時(shí)也是PCV2主要的免疫原性蛋白。Cap蛋白的N端65 87aa、113 147aa、157 183aa區(qū)域及C端4個(gè)氨基酸為病毒的主要抗原位點(diǎn)。其中N端69 83aa和117 131aa兩個(gè)抗原位點(diǎn)具有針對(duì)PCV2型特異性，能被PCV2多抗所識(shí)別，N端157 183aa抗原位點(diǎn)為PCVl和PCV2共同具有。雖然PCVl和PCV2的Cap蛋白存在一個(gè)共同的抗原位點(diǎn)，但血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種血清型的Cap蛋白之間不存在抗原交叉性，這可能是因?yàn)檎麄€(gè)Cap蛋白掩蓋了其共同的抗原位點(diǎn)。Cap蛋白經(jīng)體外表達(dá)后，能自我組裝成類病毒樣顆粒，具有PCV2病毒粒子的免疫學(xué)特性，在流行病學(xué)診斷及疫苗的研究中具有十分重要地位，因此Cap蛋白在體外的高效表達(dá)是PCV2的研究熱點(diǎn)。Cap蛋白的N端有一段由41個(gè)氨基酸組成的核定位信號(hào)肽(nuclearlocalization signal,NLS) (Liu, Tikoo et al. 2001),該 NLS 核酸序列含有約 30% 的大腸埃希菌(E. coli)稀有密碼子(Trundova and Celer2007),嚴(yán)重阻礙Cap蛋白在大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)中的有效表達(dá)(Lou，Li et al.2011)。另外，目前Cap蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)情況多以包涵體形式表達(dá)(Kong, Kong et al.2011;趙玲，朱玲等.2011),對(duì)蛋白的純化帶來不便，其反應(yīng)原性和免疫原性亦不如可溶性蛋白好。所以，目前Cap蛋白的體外有效表達(dá)、純化是Cap蛋白應(yīng)用于流行病學(xué)診斷及疫苗的研究中急需攻克的難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有方法中Cap蛋白表達(dá)量低、表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在給后續(xù)純化帶來諸多不便，以及表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種利用pCold-sumo表達(dá)載體高效表達(dá)PCV2缺失核定位信號(hào)肽的Cap蛋白的方法，該方法能夠高效表達(dá)可溶性的豬圓環(huán)病毒2型缺失核定位信號(hào)肽的Cap蛋白，并且表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)反應(yīng)活性更佳。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)—種利用pCold-sumo表達(dá)載體高效表達(dá)PCV 2 Cap蛋白的方法,包括以下步驟 (I)抽提PCV2病毒的DNA ;根據(jù)PCV 2 0RF2的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到PCV2去核定位信號(hào)肽的Cap蛋白的基因片段；(2)將步驟(I)擴(kuò)增得到的基因片段連接到pCold-SUMO質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold-SUMO-dCap ；(3)將重組質(zhì)粒 pCoId-SUMO-dCap 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 ArticExpress Escherichiacoli,得到重組大腸桿菌Artic Exp. E. coli / pCold-Sumo-dCap ;然后對(duì)重組大腸桿菌Artic Exp. E. coli / pCold-Sumo-dCap低溫誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后得到可溶性的sumo-dCap融合蛋白；步驟(I)所述的引物，其序列為引物PI : 5，-ATCAggatccAATGGCATCTTCAACACCCG-3，；引物P2 :5 ’ -ATCACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3，；步驟(2)所述的將步驟(I)擴(kuò)增得到的基因片段連接到pCold-SUMO質(zhì)粒中，是將擴(kuò)增片段插入到pCold-SUMO質(zhì)粒的BamHI與PstI克隆位點(diǎn)；步驟(3)所述的重組大腸桿菌Artic Exp. E. coli/pCold-Sumo-dCap 已于 2012年5月4日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC 6080，分類命名是大腸埃希氏菌Escherichia coli ；步驟(3)所述的低溫優(yōu)選15°C ;步驟(3)所述的純化是用NI-NTA樹脂純化。本發(fā)明的機(jī)理是由于PCV2主要抗原位點(diǎn)均不在Cap蛋白的NLS區(qū)域，NLS對(duì)PCV2主要起細(xì)胞核內(nèi)定位作用，因而在表達(dá)Cap蛋白的過程中，本發(fā)明通過將NLS序列截除以實(shí)現(xiàn)Cap蛋白的有效表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)異源性蛋白在E. coli中的可溶性表達(dá),各種表達(dá)元件被應(yīng)用在蛋白表達(dá)過程中，包括增加啟動(dòng)子、融合標(biāo)簽，優(yōu)化菌體生長(zhǎng)環(huán)境，密碼子優(yōu)化等。其中融合標(biāo)簽的作用效果較為明顯，例如SUMO標(biāo)簽及pET表達(dá)載體中的Nus、Trx、GST標(biāo)簽等。本發(fā)明通過選擇帶有SUMO標(biāo)簽的pCold-sumo表達(dá)載體以實(shí)現(xiàn)Cap蛋白在E. coli中的高效可溶性表達(dá)。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果I、本發(fā)明的方法能成功克服PCV2 Cap蛋白在大腸埃希菌中不表達(dá)或是表達(dá)量極低的難題。2、本發(fā)明方法表達(dá)的Cap蛋白主要以可溶性形式存在。3、本發(fā)明方法表達(dá)的Cap蛋白的純化方法簡(jiǎn)單可行，純化效果很好。4、Westernblot分析結(jié)果證明，本發(fā)明方法表達(dá)的Cap蛋白具有很好的免疫學(xué)反應(yīng)原性，可以應(yīng)用于流行病學(xué)診斷方法的建立及疫苗的研究。


圖I是PCV2去NLS的Cap蛋白基因片段的PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖；其中，M1-DNAMarker DL2000 ;1_PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(約 579bp)。 圖2是pCo I d-SUMO-dCap質(zhì)粒的菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定凝膠電泳圖；其中，Ml-DNA Marker DL2000 ;M2_DNA Marker DL15000 ; I-菌液 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物(約 579bp);
2-BamHI、PstI 雙酶切 pCold-SUMO-dCap 產(chǎn)物。圖3是重組蛋白SUMO-dCap的SDS-PAGE分析圖；其中，M-蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；l-pCold-SUM0-dCap未誘導(dǎo)對(duì)照；2-誘導(dǎo)的pCoId-SUMO空載體對(duì)照；3、4-pCold-SUMO-dCap誘導(dǎo)后菌體裂解沉淀；5-pCold-SUM0-dCap誘導(dǎo)后的菌體裂解上清；6-pCold-SUM0-dCap誘導(dǎo)后的菌體蛋白；7_純化后的SUMO-dCap融合蛋白。圖4是重組蛋白SUMO-dCap的Western Blot鑒定結(jié)果圖；其中,M-蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1_誘導(dǎo)的pCold-SUMO空載體上清；2_純化的SUM0-d0RF2融合蛋白；3_純化的d0RF2可溶性蛋白。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例—種利用pCold-sumo表達(dá)載體高效表達(dá)PCV 2 Cap蛋白的方法,包括以下步驟一、重組表達(dá)載體pCo I d-sumo-dCap的構(gòu)建I、PCV2 的 DNA 的提取將PCV2毒株接種于無PCV污染的PK15細(xì)胞，于37°C的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，收集并處理細(xì)胞，根據(jù)OMEGA公司的Blood DNA Kit試劑盒說明書抽提PCV2的DNA，作為模板DNA。2、PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)PCV2 0RF2序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物序列如下引物Pl :5，-ATCAGGATCCAATGGCATCTTCAACACCCG-3> ；引物P2 :5，-ATCACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3，；擴(kuò)增去核定位信號(hào)肽(NLS)的0RF2基因(579bp)。其中上游引物包含BamHI位點(diǎn)，下游引物包含PstI位點(diǎn)。引物由Invitrogen公司合成。3、去NLS的0RF2基因的擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系為 50 μ L，其中模板 DNA I. 5 μ L，引物 Ρ1、Ρ2 (20pmol / L)各I μ L, dNTP s (2. 5mmol / L) 4 μ L，10 X Ex Taq Buffer 5 μ L, Ex Taq DNA 聚合酶(5U/yL)0. 5yL，去離子水37yL。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min ;進(jìn)入PCR循環(huán)，94°C變性30s，58°C退火45s，72°C延伸40s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸IOmin。反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果(圖1)，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。4、重組質(zhì)粒 pCold-SUMO-dCap 構(gòu)建對(duì)純化的PCR產(chǎn)物和pCoId-SUMO質(zhì)粒分別進(jìn)行BamHI、PstI雙酶切，回收純化酶切產(chǎn)物。用T4DNA Ligase酶連接去NLS的0RF2基因和pCold-SUMO質(zhì)粒，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR鑒定、雙酶切鑒定、DNA測(cè)序鑒定篩選陽性重組質(zhì)粒，獲得pCold-SUMO-dCap 質(zhì)粒(圖 2)。二、融合蛋白SUMO-dCap的誘導(dǎo)表達(dá)與純化將陽性重組質(zhì)粒pCold-SUMO-dCap轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌大腸桿菌ArcticExpressEscherichia coli (購(gòu)自Invitrogen公司)感受態(tài)細(xì)胞,挑選生長(zhǎng)良好的單菌落,接入含 IOOmg / L氨芐青霉素的2mL LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)10h，菌液PCR鑒定。將鑒定為陽性的培養(yǎng)物(即重組大腸桿菌Artic Exp. E. coli / pCold-Sumo-dCap)按1:100接種于含IOOmg / L氨芐青霉素的IOOmL LB液體培養(yǎng)基，37°C 180r / min振蕩培養(yǎng)至OD6tltlnm約0.6，取出培養(yǎng)物冷卻至15°C，再靜置30min，加入適量IPTG至終濃度為0. 4mM,15°C 180r/min振蕩培養(yǎng)20 24h。離心收集菌體沉淀，加5mL的菌體重懸緩沖液(20mM Tris-HCl ρΗ7·9，0·5Μ NaCl)重懸菌體沉淀，冰上靜置30min，超聲破碎菌體，超聲破碎后產(chǎn)物12000r/min離心20min，收集上清。將上清進(jìn)行Ni-NTA樹脂親和柱層析，加入30mL雜蛋白洗脫緩沖液A (20mMTris-HCl pH7.9，0. 5M NaCl，20mM咪唑)洗去部分雜蛋白，再加入4mL雜蛋白洗脫緩沖液B(20mM Tris-HCl pH7. 9,0. 5M NaCl，80mM咪唑)洗去其它雜蛋白，最后用3mL蛋白洗脫緩沖液(20mM Tris-HCl pH7. 9,0. 5M NaCl,200mM Imidazole 咪唑)洗脫得到 SUMO-dCap 融合蛋白，質(zhì)量濃度約I. 2mg/mL。結(jié)果顯示構(gòu)建成功的pCold-SUMO-dCap質(zhì)粒能夠高效表達(dá)去NLS的Cap蛋白，并且可溶性的SUMO-dCap融合蛋白表達(dá)量高，經(jīng)過NI-NTA樹脂親和柱層析后純化后，可以得到純度較高的SUMO-dCap融合蛋白(圖3)。Western blot分析表明SUMO-dCap融合蛋白具有很好的反應(yīng)原性(圖4)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.ー種利用pCold-sumo表達(dá)載體高效表達(dá)PCV 2 Cap蛋白的方法,其特征在于包括以下步驟 (1)抽提PCV2病毒的DNA;根據(jù)PCV 2 0RF2的序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增得到PCV2去核定位信號(hào)肽的Cap蛋白的基因片段； (2)將步驟(I)擴(kuò)增得到的基因片段連接到pCold-SUMO質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold-SUMO-dCap ； (3)將重組質(zhì)粒pCold-SUMO-dCap 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 ArticExpress Escherichia coli,得到重組大腸桿菌Artic Exp. E. coli / pCold-Sumo-dCap ;然后對(duì)重組大腸桿菌Artic Exp.E. coli / pCold-Sumo-dCap低溫誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后得到可溶性的sumo_dCap融合蛋白； 步驟(I)所述的引物，其序列為引物 Pl :5，-ATCAGGATCCAATGGCATCTTCAACACCCG-3> ；引物 P2 :5’ -ATCACTGCAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTT-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用pCold-sumo表達(dá)載體高效表達(dá)PCV2 Cap蛋白的方法，其特征在于步驟(2)所述的將步驟(I)擴(kuò)增得到的基因片段連接到pCoId-SUMO質(zhì)粒中，是將擴(kuò)增片段插入到pCold-SUMO質(zhì)粒的BamHI與PstI克隆位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用pCold-sumo表達(dá)載體高效表達(dá)PCV2 Cap蛋白的方法，其特征在于步驟(3)所述的低溫為15°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用pCold-sumo表達(dá)載體高效表達(dá)PCV2 Cap蛋白的方法，其特征在于步驟(3)所述的純化是用NI-NTA樹脂純化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用pCold-sumo表達(dá)載體高效表達(dá)PCV 2 Cap蛋白的方法，該方法包括以下步驟抽提PCV 2病毒的DNA，擴(kuò)增得到PCV 2去核定位信號(hào)肽的Cap蛋白的基因片段；將擴(kuò)增片段連接到pCold-SUMO質(zhì)粒中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold-SUMO-dCap；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ArcticExpress Escherichia coli，然后低溫誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后得到可溶性的sumo-dCap融合蛋白。本發(fā)明的方法能成功克服PCV 2 Cap蛋白在大腸埃希菌中不表達(dá)或是表達(dá)量極低的難題；本發(fā)明方法所表達(dá)的Cap蛋白主要以可溶性形式存在、純化方法簡(jiǎn)單可行、純化效果很好、具有很好的免疫學(xué)反應(yīng)原性，可以應(yīng)用于流行病學(xué)診斷方法的建立及疫苗的研究。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102839189SQ20121024863
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者樊惠英, 廖明, 陳春麗, 葉昱, 張 杰 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)