一種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoDⅠ啟動(dòng)子的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoDⅠ啟動(dòng)子，其核心啟動(dòng)子（-108至94）包含如SEQID所示的DNA序列，其長度為202bp。本發(fā)明根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)牛MyoDⅠ基因啟動(dòng)子具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性，并利用這一特性設(shè)計(jì)了一種骨骼肌特異性表達(dá)啟動(dòng)子載體，該啟動(dòng)子可以在轉(zhuǎn)基因牛的培育中應(yīng)用。該啟動(dòng)子載體具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性，而在除骨骼肌外的多種細(xì)胞中均無啟動(dòng)活性，可見該啟動(dòng)子在骨髂肌中特異性地啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。
【專利說明】—種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoD I啟動(dòng)子
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoD I啟動(dòng)子。
【背景技術(shù)】
[0002]真核生物基因表達(dá)的時(shí)間和水平嚴(yán)格按照發(fā)育順序進(jìn)行。某些特定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)由轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合于調(diào)控區(qū)相關(guān)元件，成為轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵步驟，并最終導(dǎo)致基因的時(shí)間和空間表達(dá)。編碼組織特異蛋白的基因嚴(yán)格按照組織特異性和發(fā)育階段性表達(dá)，為基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了很好的研究|吳式。在特異聞效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，獲得能廣泛應(yīng)用的特異性啟動(dòng)子非常重要。但啟動(dòng)子的特異性由多個(gè)調(diào)控元件控制，在不同種類和不同發(fā)育時(shí)期起關(guān)鍵作用的調(diào)控元件并不相同，調(diào)控元件和反式作用因子之間的相互作用也十分復(fù)雜。因此要使外源基因能夠在動(dòng)物組織中特異高效地表達(dá)，必須構(gòu)建一個(gè)可以特異高效表達(dá)的動(dòng)物表達(dá)載體，其中啟動(dòng)子的選擇是重要的條件之一。
[0003]MyoD I是生肌決定因子MRFs基因家族所編碼4種肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子中的I種，是控制骨骼肌生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與肌肉生長和肉質(zhì)有著密切的關(guān)系，利用其基因調(diào)控區(qū)的相關(guān)元件構(gòu)建骨骼肌特異性表達(dá)載體是一種有效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一 種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoD I啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子載體具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性， 而在除骨骼肌外的多種細(xì)胞中無啟動(dòng)活性，說明該啟動(dòng)子能在骨髂肌中特異性地啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。
[0005]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoD I啟動(dòng)子，其核心啟動(dòng)子(-108至94)包含如SEQ ID所示的DNA序列，其長度為202bp。
[0006]所采用重組核酸序列含有上述的啟動(dòng)子或其片段，這樣就可以使位于啟動(dòng)子下游的目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)，作為分析、開發(fā)、改造骨骼肌特性的研究模型。還可以利用已有的分子生物學(xué)操作技術(shù)獲得包含目的基因的重組核酸，通過顯微注射等基因?qū)爰夹g(shù)獲得轉(zhuǎn)基因胚胎，用于建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。重組核酸序列中的目的基因，含有提高肌肉品質(zhì)基因，這樣就可以在獲得骨骼肌特異性啟動(dòng)特性之外，提高該重組核酸序列的性能，為轉(zhuǎn)基因牛的培養(yǎng)提供更多的功能性方向，增加其附加產(chǎn)值，提高肉品營養(yǎng)價(jià)值。
[0007]本發(fā)明主要通過報(bào)告基因分析確定該啟動(dòng)子的啟動(dòng)特征。首先構(gòu)建無啟動(dòng)子綠色熒光蛋白載體，為保證報(bào)告基因正確翻譯，在綠色熒光蛋白基因上游插入內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。然后通過PCR或者片段捕獲等技術(shù)獲得骨骼肌中特異性表達(dá)的MyoD I啟動(dòng)子，長度為202bp，插入內(nèi)部核糖體位點(diǎn)上游，得到啟動(dòng)子報(bào)告基因分析載體。質(zhì)粒去內(nèi)毒素后，轉(zhuǎn)染C2C12小鼠成肌細(xì)胞系，同時(shí)轉(zhuǎn)染牛原代腎上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞為對(duì)照，轉(zhuǎn)染24h后更換含牛血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基至成肌細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞分化融合，48h后用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，分析啟動(dòng)子特性。[0008]1、牛MyoD I啟動(dòng)子全長的克隆及序列分析
用軟件分析最有最大啟動(dòng)子活性的牛MyoD I啟動(dòng)子區(qū)域，設(shè)定為Pl片段，用在線軟件設(shè)計(jì)特異性引物由生物工程有限公司合成；從牛背部最長肌組織提取組織DNA ;采用基因組PCR步移技術(shù)擴(kuò)增出MyoD I的啟動(dòng)子；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增引物；對(duì)應(yīng)物進(jìn)行純化；送生物公司進(jìn)行序列分析。
[0009]2、牛MyoD I啟動(dòng)子全長報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
將提純后的目的基因和PGL3 — Basic進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建含有MyoD I啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒PGL3 — MyoD 1-Pl,并對(duì)其進(jìn)行篩選和鑒定。
[0010]3、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)報(bào)告質(zhì)粒MyoD I啟動(dòng)子的活性
將MyoD I啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒和PRL-TK共轉(zhuǎn)染到牛前脂肪細(xì)胞中，24h后裂解細(xì)胞，并收集裂解液進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)4、牛MyoD I核心啟動(dòng)子區(qū)的定位
(I)MyoD 1-Pl的5’端截短載體的構(gòu)建以及MyoD I核心啟動(dòng)子區(qū)的初步鑒定。
[0011]設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)MyoD I — Pl 5’端進(jìn)行截短，并構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒以檢測(cè)其啟動(dòng)活性。截短片段分別命名為P2、P3。構(gòu)建重組報(bào)告質(zhì)粒PGL3 MyoD 1-P2、PGL3-MyoD 1-P3，并進(jìn)行篩選，鑒定。然后對(duì)其進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。
[0012](2)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)道質(zhì)粒(pGL3_啟動(dòng)子)和內(nèi)參質(zhì)粒PRL-TK共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，并檢測(cè)熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)活性。
[0013](3)將缺失突變載體按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)后，測(cè)定熒光素酶表達(dá)活性`，并觀察不同缺失突變體對(duì)熒光素酶表達(dá)活性的影響。以上實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。
[0014](4)通過對(duì)缺失載體啟動(dòng)子活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，初步定位核心啟動(dòng)子的位置。
[0015]5、對(duì)核心啟動(dòng)子測(cè)序并進(jìn)行功能分析
將pGL3-啟動(dòng)子與PRL-TK共轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞系、小鼠脂肪細(xì)胞及原代小鼠乳腺細(xì)胞等10種細(xì)胞中，進(jìn)行表達(dá)特異性驗(yàn)證。由于采用了上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)牛MyoD I基因啟動(dòng)子具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性，并利用這一特性設(shè)計(jì)了一種骨骼肌特異性表達(dá)啟動(dòng)子載體，該啟動(dòng)子可以在轉(zhuǎn)基因牛的培育中應(yīng)用。該啟動(dòng)子載體具有骨骼肌特異性啟動(dòng)特性，而在除骨骼肌外的多種細(xì)胞中均無啟動(dòng)活性，可見該啟動(dòng)子在骨髂肌中特異性地啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，能夠滿足目的基因在骨骼肌中特異性表達(dá)的要求，為轉(zhuǎn)基因載體提供了一種重要的元件。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]附圖1為本發(fā)明核心啟動(dòng)子的電泳圖譜；
附圖2為確認(rèn)本發(fā)明核心啟動(dòng)子的技術(shù)路線框圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]本發(fā)明的實(shí)施例:針對(duì)牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoD I啟動(dòng)子，設(shè)計(jì)上游引物CTCCCTGCTCTGTTCCTATT,下游引物AAACTTGCTGCTGTTCTGG，通過PCR擴(kuò)增，克隆核心啟動(dòng)子(-108至94)包含如SEQ ID所示的DNA序列，其長度為202bp。[0018]核心啟動(dòng)子的序列號(hào)為:CTCCCTGCTC TGTTCCTATT GGCCTCGGGCGCCCCCGCCT
CTAGCCGCTA GCTCGGGCTC GGGGGCCCTT AGGCTACTAC GGGATAAATA GCCCTGGGAGCCTGGTGTGA
AAGTAGGGGT GGGGAGGCCC CAGGGCGCTG CCGCGGCTCT CCTCAGGACC GGGGAGGGTGGGACTGCTGGGGCTCCAGAA CAGCAGCAAG TT`
【權(quán)利要求】
1.一種牛骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoD I啟動(dòng)子，其特征在于:其核心啟動(dòng)子(-108至 94)包含如SEQ ID所示的DNA序列，其長度為202bp。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK103509794SQ201210219237
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月29日
【發(fā)明者】許厚強(qiáng), 李飛, 陳偉, 陳祥 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)