專利名稱：一種微生物轉(zhuǎn)化苯甲酰甲酸乙酯制備(s)-(+)-扁桃酸乙酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC No. 2266為生物催化劑，生物催化苯甲酰甲酸乙酯制備(S)-(+)_扁桃酸乙酯的方法。
背景技術(shù)：
(S)_(+)_ 扁桃酸乙酯(Ethyl (S)-(+)_mandelate)，CAS 登錄號(hào)13704-09-1，分子式CltlH12O3，分子量180. 2。它是一種重要的手性藥物中間體，可以廣泛地用于合成手性酸，手性醇，手性胺類化合物，手性氨基醇和手性硫醇等。(S)-(+)_扁桃酸乙酯水解后制備的(s)-(+)-扁桃酸在醫(yī)藥工業(yè)中可用于頭孢羥唑、血管擴(kuò)張藥環(huán)扁桃酸酯、滴眼藥羥芐唑等的中間體，也可作防腐劑。(S) - (+)-扁桃酸乙酯的合成途徑主要有化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法。在化學(xué)催化劑或生物催化劑的作用下，還原苯甲酰甲酸乙酯可以獲得(S)-(+)_扁桃酸乙酯。采用化學(xué)法不對(duì)稱還原苯甲酰甲酸乙酯需要在價(jià)格昂貴的手性催化劑的催化下才能完成。化學(xué)還原過(guò)程中手性催化劑價(jià)格昂貴、制備過(guò)程繁瑣。采用含有羰基還原酶的微生物細(xì)胞為生物催化劑不對(duì)稱還原苯甲酰甲酸乙酯具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性好、成本低廉的特點(diǎn)。生物轉(zhuǎn)化過(guò)程可以在不同的反應(yīng)體系中進(jìn)行。最為傳統(tǒng)的反應(yīng)體系是水相體系，在水相體系中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化微生物的催化活性較高，但是有機(jī)底物濃度過(guò)高時(shí)生物轉(zhuǎn)化效率會(huì)急劇下降。為了解決高底物濃度對(duì)細(xì)胞催化活性的抑制作用，采用生物相容性好的有機(jī)溶劑用于生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，在生物相容性較好的有機(jī)溶劑中微生物能夠保持較好地催化活性，有機(jī)底物能夠很好地分散于反應(yīng)溶劑中，從而避免底物和產(chǎn)物在反應(yīng)溶劑中局部濃度不均一而導(dǎo)致催化效率降低的現(xiàn)象。也可以采用水/有機(jī)溶劑兩相體系作為反應(yīng)介質(zhì)，可以確保微生物在水溶液中具有良好的生物學(xué)活性。底物和產(chǎn)物在有機(jī)介質(zhì)中具有較大的溶解度，有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的分離提取。采用固定化細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化可以較大程度保護(hù)細(xì)胞的催化活性，同時(shí)有利于產(chǎn)物的分離提取，有利于微生物細(xì)胞的重復(fù)利用，提高生產(chǎn)效率。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC No. 2266為生物催化劑，生物催化苯甲酰甲酸乙酯制備(S)-(+)_扁桃酸乙酯的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是—種苯甲酰甲酸乙酯微生物轉(zhuǎn)化制備(S)_(+)_扁桃酸乙酯的方法，所述方法包括以苯甲酸甲酸乙酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266在發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，在水和正己烷兩相體系中，于2(T35°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 120小時(shí)，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述(S)-(+)_扁桃酸乙酯；所述水和正己烷兩相體系中，水與正己烷體積比為1:0. 2飛(優(yōu)選1:1)，在所述水和正己烷兩相體系中，底物苯甲酰甲酸乙酯的初始濃度為l 200mmol/L (優(yōu)選5 50mmol/L)。
本發(fā)明中所用的菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCCNo. 2266是從杭州西湖啤酒廠附近的土壤中篩選得到的，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期2007年11月26日，已在CN101230319A中披露。該菌株菌落特征在瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出乳白色、有光澤、平坦、邊緣整齊、濕潤(rùn)、表面光滑，質(zhì)地均勻的菌落形態(tài)。所述含酶菌體細(xì)胞可直接以發(fā)酵液形式參與反應(yīng)，也可經(jīng)過(guò)濾后以濕菌體細(xì)胞形式參與反應(yīng)，或者經(jīng)固定化之后作為生物催化劑參與反應(yīng)。優(yōu)選的，所述含酶菌體細(xì)胞經(jīng)固定化之后作為生物催化劑，其用量為每L水和正己烷兩相體系中含有的生物催化劑相當(dāng)于以包埋法將I. (Γ4. Og (以干重計(jì))的含酶菌體細(xì)胞固定化后再經(jīng)增殖培養(yǎng)16 72小時(shí)獲得的固定化細(xì)胞顆粒。所述生物催化劑(固定化細(xì)胞顆粒)制備方法如下將釀酒酵母菌株CGMCCNo. 2266發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌體濃度為3. (TlO. Og/L的發(fā)酵液與等體積質(zhì)量濃度f(wàn) 5%的海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻得到混合液，將混合液逐滴滴入足量質(zhì)量濃度為2. 5^4. 0%的氯化 鈣溶液中，連續(xù)攪拌得到固定化懸浮液，放置于35 38°C條件下固化，得到的固定化顆粒用無(wú)菌生理鹽水洗滌后，分散于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)16 72h獲得增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒，即為生物催化劑。所述的固定化細(xì)胞顆粒的直徑可通過(guò)注射器的針頭尺寸來(lái)控制，推薦為l、mm，最優(yōu)選2mm。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下葡萄糖26 32g/L，酵母粉2 4g/L，硫酸銨T6g/L，無(wú)水MgSO4 O. 2 O. 4g/L, K2HPO4 · 3H20 O. 5 I. 5g/L, KH2PO4O. 6 I. 5g/L, pH 自然，溶劑為水。所述分離純化方法如下將轉(zhuǎn)化液過(guò)濾除去生物催化劑，濾液靜置分層后得到正己烷層，將正己烷減壓蒸餾，分離得到產(chǎn)物(S)-(+)_扁桃酸乙酯。在包埋處理過(guò)程中，海藻酸鈉的濃度推薦為1飛％，最優(yōu)選2%。本發(fā)明所述的應(yīng)用可按如下方法獲得發(fā)酵液(I)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CGMCC No. 2266菌體接種到斜面培養(yǎng)基，26 35°C培養(yǎng)4飛天得到斜面培養(yǎng)的菌體；所述的斜面培養(yǎng)基組成如下麥芽汁5 15g/L，酵母粉2 4g/L，蛋白胨4 6g/L，葡萄糖7 12g/L，瓊脂15 25g/L，自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20min，滅囷后冷卻制成斜面；(2)種子培養(yǎng)從斜面培養(yǎng)基取一環(huán)菌體轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基，26 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為15(T200r/min，培養(yǎng)18 26h得種子液；所述的種子培養(yǎng)基組成如下葡萄糖26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無(wú)水 MgSO4 O. 2 O. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 005 I. 5g/L，KH2PO4
O.6^1. 5g/L,自然pH值，溶劑為水；121°C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻，即得種子培養(yǎng)基；(3)發(fā)酵培養(yǎng)取種子液，以1(Γ20%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為26 35°C，搖床轉(zhuǎn)速為15(T200r/min，培養(yǎng)18 30h得到發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成同種子培養(yǎng)基。具體推薦按照如下步驟獲得生物催化劑將前面所得到的發(fā)酵液與等體積2%的海藻酸鈉溶液相混合，所述的發(fā)酵液菌體濃度為4. 30g/L，攪拌均勻得到混合液，將混合液逐滴滴入質(zhì)量濃度為3. 5%的氯化鈣溶液中，連續(xù)攪拌，含有菌體的海藻酸鈉混合液固化形成凝膠珠固定化顆粒，將得到的固定化懸浮液放置于37°C條件下固化，得到的固定化顆粒用無(wú)菌生理鹽水洗滌，獲得固定化細(xì)胞顆粒；得到的固定化細(xì)胞顆粒分散于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)24h，得到增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒，以增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒為生物催化劑。具體推薦所述的方法為以增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒作為生物催化劑，以苯甲酰甲酸乙酯為底物，在水和正己烷兩相體系(體積比I: I)中，于30°C、180r/min條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)72h，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到產(chǎn)物(S)-(+)_扁桃酸乙酯；所述的分離純化可采用如下步驟將轉(zhuǎn)化液過(guò)濾除去固定化細(xì)胞顆粒，將反應(yīng)液靜置分層后得到正己烷層。將正己烷減壓蒸餾，分離得到產(chǎn)物(S)_(+)_扁桃酸乙酯。在水和正己烷中，底物苯甲酰甲酸乙酯的初始濃度為廣200. Ommol/L,每L水和正己烷兩相體系中含有的生物催化劑相當(dāng)于以包埋法將O. 330L菌體濃度為4. 3g/L的發(fā)酵液制成固定化細(xì)胞顆粒在發(fā)酵培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)24小時(shí)后獲得的增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒。得到的(S)_(+)_扁桃酸乙酯純品用氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)確定產(chǎn)物的純度和分子量。摩爾轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物(S)_(+)_扁桃酸乙酯對(duì)映體過(guò)剩值(ee%)的確定 采用安捷倫7820氣相色譜儀分析檢測(cè)。色譜柱為手性柱，型號(hào)為ChiralCYCL0DEX-B (O. 25mmX30mX0. 25μπι)，載氣為氮?dú)猓魉贋閘ml/min。手性柱可以檢測(cè)到(R)-(-)_扁桃酸乙酯和(S)-(+)_扁桃酸乙酯兩種對(duì)映體的含量，進(jìn)一步計(jì)算出反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率和(S)-(+)_扁桃酸乙酯的對(duì)映體過(guò)剩值(ee%)。過(guò)濾得到的固定化細(xì)胞顆?？芍貜?fù)使用于微生物轉(zhuǎn)化制備(S)_(+)_扁桃酸乙酯的反應(yīng)。本發(fā)明采用固定化細(xì)胞在水和正己烷兩相體系中催化苯甲酰甲酸乙酯轉(zhuǎn)化制備(S)-⑴-扁桃酸乙酯，為(s)-(+)-扁桃酸乙酯的制備提供了一條經(jīng)濟(jì)有效的合成途徑。利用本發(fā)明方法生產(chǎn)的(S)-(+)_扁桃酸乙酯對(duì)映體過(guò)剩值大于99. 0%，底物摩爾轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到99. 0%，產(chǎn)品純度達(dá)到98. 0%，固定化細(xì)胞顆?？梢灾貜?fù)利用9次。本發(fā)明微生物轉(zhuǎn)化法制備(S)_(+)_扁桃酸乙酯具有以下優(yōu)點(diǎn)①生產(chǎn)所用的菌株安全無(wú)毒。②固定化細(xì)胞作為生物催化劑有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的分離提取。③固定化細(xì)胞作為生物催化劑有利于實(shí)現(xiàn)催化劑的重復(fù)利用，節(jié)約成本。④生產(chǎn)操作簡(jiǎn)便，生物轉(zhuǎn)化率較高。⑤生物催化劑比化學(xué)催化劑成本低廉。⑥不受季節(jié)影響，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。⑦環(huán)境友好，反應(yīng)條件溫和，常溫常壓下即可順利進(jìn)行轉(zhuǎn)化。⑧正己烷可以溶解大量的底物和產(chǎn)物，可以降低有機(jī)底物和產(chǎn)物對(duì)生物催化反應(yīng)過(guò)程的抑制作用，提高底物的轉(zhuǎn)化量，提高生物轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)效率。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :斜面培養(yǎng)將CGMCC No. 2266菌種接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)4 6天。所述斜面培養(yǎng)基組成如下麥芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂20g/L，自然PH值，溶劑為水，121°C滅菌20min，滅菌后冷卻制成斜面。種子培養(yǎng)和發(fā)酵種子和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用液體培養(yǎng)基，成分為葡萄糖30g/L，酵母粉 3g/L，硫酸銨 5g/L，無(wú)水 MgSO4 O. 25g/L，K2HPO4 · 3H20 lg/L，KH2PO4 lg/L，自然 pH值，溶劑為水；121°C滅菌20分鐘，滅菌后冷卻。用接種針從斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌體接種在含有IOOml液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得種子液。將種子液以10%的接種量接種于含有IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的條件下培養(yǎng)24h獲得發(fā)酵液，用獲得的發(fā)酵液用于菌體的固定化。將菌體干重為430mg的IOOml發(fā)酵液與等體積的濃度為2%的海藻酸鈉溶液混合制成混合液，將混合液裝入注射器中，滴入3. 5%CaCl2溶液(IOOOml)中形成固定化顆粒，形成的固定化顆粒直徑為2mm，于37°C固化30min，得到的固定化顆粒用無(wú)菌生理鹽水洗滌，洗去過(guò)量的鈣離子和未捕獲的細(xì)胞，將獲得的固定化細(xì)胞顆粒繼續(xù)在發(fā)酵培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng) 72h。將增殖培養(yǎng)好的固定化細(xì)胞顆粒分別加入到8瓶含有5. 5mmol苯甲酰甲酸乙酯的水和正己烷體積比分別為5:1,4:1,3:1,2:1,1:1,1:2,13^P 1:4的300ml兩相反應(yīng)體系中，30°C、180r/min的條件下進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化72h，結(jié)果如表I所示。結(jié)果表明，反應(yīng)體系中水和正己烷的配比比例對(duì)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率有影響。水的含量相對(duì)過(guò)多，對(duì)轉(zhuǎn)化率 的影響不大。而隨著反應(yīng)體系中正己烷的含量增高，生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率降低較多。反應(yīng)體系中較佳的水和正己烷的體積比為1:1。在上述8種水和正己烷體積比不同的反應(yīng)體系中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化后獲得的產(chǎn)物(S)-(+)_扁桃酸乙酯的對(duì)映體過(guò)剩值均大于99. 0%。表I :水和正己烷體積比對(duì)微生物轉(zhuǎn)化苯甲酰甲酸乙酯的影響
權(quán)利要求
1.一種微生物轉(zhuǎn)化苯甲酰甲酸乙酯制備(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法，所述方法包括以苯甲酸甲酸乙酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC No. 2266在發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，在水和正己烷兩相體系中，于2(T35°C下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 120小時(shí)，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述(S)-(+)_扁桃酸乙酯；所述水和正己烷兩相體系中，水與正己烷體積比為1:0. 2 5，在所述水和正己烷兩相體系中，底物苯甲酰甲酸乙酯的初始濃度為l 200mmOl/L。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述含酶菌體細(xì)胞經(jīng)固定化之后作為生物催化劑，其用量為每L水和正己烷兩相體系中含有的生物催化劑相當(dāng)于以包埋法將I.(Γ4. Og的含酶菌體細(xì)胞固定化后再經(jīng)增殖培養(yǎng)16 72小時(shí)獲得的固定化細(xì)胞顆粒。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述生物催化劑制備方法如下將釀酒酵母菌株CGMCC No. 2266發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌體濃度為3. (TlO. Og/L的發(fā)酵液與等體積質(zhì)量濃度Γ5%的海藻酸鈉溶液混合，攪拌均勻得到混合液，將混合液逐滴滴入質(zhì)量濃度為2. 5^4. 0%的氯化鈣溶液中，連續(xù)攪拌得到固定化懸浮液，放置于35 38°C條件下固化，得到的固定化顆粒用無(wú)菌生理鹽水洗滌后，分散于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)16 72h獲得增殖培養(yǎng)后的固定化細(xì)胞顆粒，即為生物催化劑。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下葡萄糖26 32g/L，酵母粉 2 4g/L，硫酸銨 3 6g/L，無(wú)水 MgSO4 O. 2 O. 4g/L，K2HPO4 · 3H20 O. 5 I. 5g/L，KH2PO4O.6 1.5g/L，pH自然，溶劑為水。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下將轉(zhuǎn)化液過(guò)濾除去生物催化劑，濾液靜置分層后得到正己烷層，將正己烷減壓蒸餾，分離得到產(chǎn)物(S)- (+)-扁桃酸乙酯。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266為生物催化劑，生物催化苯甲酰甲酸乙酯制備(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法。所述方法包括以苯甲酰甲酸乙酯為底物，以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266發(fā)酵獲得的含酶菌體細(xì)胞為生物催化劑，在水和正己烷兩相體系中，于20~35℃下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)8~120小時(shí)，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述(S)-(+)-扁桃酸乙酯；該微生物轉(zhuǎn)化方法反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好，產(chǎn)物光學(xué)純度高，底物轉(zhuǎn)化率高，分離純化過(guò)程簡(jiǎn)單，催化劑可重復(fù)利用，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/865GK102719496SQ20121021153
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者嚴(yán)琴英, 南穎康, 歐志敏, 謝開宇 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)