專利名稱：一種重金屬抗性菌在強(qiáng)化蕈菌富集土壤重金屬上的應(yīng)用及制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到重金屬抗性菌株maiiussp.) CQ4在強(qiáng)化蕈菌富集土壌重金屬上的應(yīng)用，以及利用該菌株制備的制劑。
背景技術(shù)：
目前我國受重金屬污染的農(nóng)田土壤面積約2500X 104hm2，每年被重金屬污染的糧食多達(dá)1200X IO4噸，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過100億元。重金屬污染是土壤各種污染中修復(fù)治理難度最大的，土壌重金屬可經(jīng)食物鏈層層富集傳遞直到人，嚴(yán)重威脅人類健康。為實(shí)現(xiàn)我國社會的可持續(xù)發(fā)展，保障公民食品安全，有效地去除土壌中的重金屬成為我國科技領(lǐng)域ー項(xiàng)十分迫切的任務(wù)；
傳統(tǒng)的物理和化學(xué)工程法拔除土壌重金屬污染耗費(fèi)大且破壞土壤結(jié)構(gòu)，因此近年來生物修復(fù)土壌重金屬污染成為國際國內(nèi)重點(diǎn)發(fā)展的新技術(shù)，主要側(cè)重在植物修復(fù)技術(shù)、植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)；
作為土壤生態(tài)環(huán)境中的重要組成因子，土壌微生物能代謝產(chǎn)生許多低分子有機(jī)酸、活性有機(jī)物，在土壌生態(tài)環(huán)境中可參與成土作用、促進(jìn)礦物溶解、改變根際土壤理化性質(zhì)、促進(jìn)植物對養(yǎng)分的吸收，同時(shí)還能促進(jìn)土壤中重金屬的溶解，有助于植物對重金屬的吸收和清除。近幾年土壌中重金屬抗性微生物在重金屬污染生物修復(fù)中的強(qiáng)化輔助作用越來越得至帽內(nèi)外同行的認(rèn)同和興趣，迅速形成了當(dāng)前的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對目前我國嚴(yán)峻的重金屬污染的實(shí)際問題和需要，提供一株具有重金屬抗性并能強(qiáng)化蕈菌富集土壌重金屬的微生物新菌種及其制成的菌劑。利用該制劑能有效提高土壌重金屬有效態(tài)含量并增產(chǎn)蕈菌生物量，同時(shí)促進(jìn)蕈菌對重金屬Pb，Cu和Cd的富集的提高，屬于環(huán)境微生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域。技術(shù)方案
本發(fā)明提供一株具有重金屬抗性并能強(qiáng)化蕈菌富集土壌重金屬的微生物新菌種及其制成的菌劑。其主要生物學(xué)特性為革蘭氏陽性菌，細(xì)胞呈直桿狀，O. 5 I. 5 μ mX 2. 2 7. 3 μ m，常以成對或鏈狀排列，具圓端或方端，以周生鞭毛運(yùn)動。芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，能抗許多不良環(huán)境。好氧或兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，具發(fā)酵或呼吸代謝類型。菌落白色大型，中有一色淺圏，邊緣向周圍延展成波紋狀，菌落中部較厚，不透明，邊緣延展部分較薄，無色透明。接觸酶為陽性，水解淀粉，硝酸鹽還原，L-阿拉伯糖和D-木糖不產(chǎn)酸，不利用檸檬酸，形成吲哚、溶菌酶不敏感；
芽孢桿菌重金屬抗性菌株制成的菌劑，是通過以下方法制備
(1)挑取所述的重金屬抗性菌iBacillussp.) CQ4的單菌落,接種于試管斜面；
(2)將重金屬抗性菌(Bacillussp.) CQ4的斜面種接種于LB培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期；
(3)將上述培養(yǎng)好的菌液按10-15%體積接種量轉(zhuǎn)入種子罐，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。種子罐所用的培養(yǎng)基是SMS培養(yǎng)基。SMS培養(yǎng)基的配方是sucrose, 1%; (NH4)2SO4, 0.1%;K2HPO4, O. 2%; MgSO4, O. 05%; NaCl，O. 01%; yeast extract, 0. 05%; CaCO3, 0. 05%; pH7. 2 ；
(4)將達(dá)到對數(shù)生長期的種子液按10-15%的接種量接種與生產(chǎn)罐中培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用的培養(yǎng)基配方與種子罐ー樣；
(5)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0.8-1. 5，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為30°C，全程培養(yǎng)時(shí)間為48-72小吋，結(jié)束后菌體10億個/ml。發(fā)酵完 成后，培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型。有益效果
使用該方法分離的抗重金屬Pb ,Cu和Cd并強(qiáng)化蕈菌富集土壌重金屬Pb ,Cu和Cd的微生物菌株具有生產(chǎn)成本低，使用方便，促富集效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在實(shí)際的生物修復(fù)土壌重金屬污染中大規(guī)模的使用。該發(fā)明對實(shí)現(xiàn)我國社會的可持續(xù)發(fā)展，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保障公民食品安全，有效地去除土壌中的重金屬具有重要的現(xiàn)實(shí)意義；
本發(fā)明提供ー種重金屬抗性菌sp.) CQ4,田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對照相比，芽孢桿菌CQ4菌株對重金屬Pb，Cu和Cd的活化能力分別提高了 23. 21%，51. 02 %和30.51 %，同時(shí)蕈菌的生物量提高了 49. 56%，總Pb，Cu和Cd的富集量分別達(dá)到原來的2. 02，2. 13 和 I. 83 倍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
采集菌際重金屬污染土壌及其他植物根際與非根際污染土壌。準(zhǔn)確稱取I g土壤樣品，在生理鹽水中連續(xù)稀釋，震蕩，靜置。取靜置后上層的澄清液，再根據(jù)污染土壌的所含的重金屬種類分別涂布于分別含有Pb，Cu和Cd的SLP培養(yǎng)基。重金屬Pb，Cu和Cd分別用200mg 1-1 Pb (Pb (NO3) 2)，50 mg 1-1 Cu (Cu (NO3) 2)和 50mg 1-1 Cd (Cd (NO3) 2)。SLP 培養(yǎng)基的配方是sucrose, 1%; (NH4)2SO4, O. 1%; K2HPO4, O. 05%; MgSO4, O. 05%; NaCl, O. 01%;yeast extract, 0. 05%; pH 7.2。平板在30°C下培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，挑選不同形態(tài)的菌落于如前所述的含重金屬培養(yǎng)基上反復(fù)劃線純化，將生長快，菌落規(guī)則，傳代穩(wěn)定的單菌落重點(diǎn)純化。利用平板稀釋法檢測這些菌株對所有這三種重金屬抗性及最高耐受值，經(jīng)過反復(fù)篩選，得到同時(shí)抗 800 mg/ 1-1 Pb，200mg /1-1 Cu 和 200mg/ 1-1 Cd 的菌株--CQ4。其中所有的分離步驟都使用SLP培養(yǎng)基，因?yàn)檫@種低磷培養(yǎng)基可以有效避免重金屬鹽類的沉淀。其主要生物學(xué)特性為革蘭氏陽性菌，細(xì)胞呈直桿狀，O. 5 I. 5 μ mX 2. 2 7. 3 μ m，常以成對或鏈狀排列，具圓端或方端，以周生鞭毛運(yùn)動。芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，能抗許多不良環(huán)境。好氧或兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，具發(fā)酵或呼吸代謝類型。菌落白色大型，中有一色淺圈，邊緣向周圍延展成波紋狀，菌落中部較厚，不透明，邊緣延展部分較薄，無色透明。接觸酶為陽性，水解淀粉，硝酸鹽還原，L-阿拉伯糖和D-木糖不產(chǎn)酸，不利用檸檬酸，形成吲哚、溶菌酶不敏感；
實(shí)施例2取實(shí)施例I中所述的重金屬抗性菌(Bacillus sp.) CQ4的單菌落,接種于試管斜面。將抗重金屬Pb，Cu和Cd并強(qiáng)化蕈菌富集土壤重金屬Pb，Cu和Cd的(Bacillus sp.) CQ4的斜面種接種于LB培養(yǎng)基搖瓶中。LB培養(yǎng)基(g/Ι)配方如下蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7. 0-7. 2。恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將上述培養(yǎng)好的菌液按10-15%體積接種量轉(zhuǎn)入已經(jīng)121°C高壓濕熱滅菌并冷卻至35°C左右的種子罐，種子罐所用的培養(yǎng)基是 SMS 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的配方是(sucrose, 1%; (NH4)2SO4, O. 1%; K2HPO4, O. 2%; MgSO4,
O.05%; NaCl, O. 01%; yeast extract, O. 05%; CaCO3, O. 05%; pH 7.2)。繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期。培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:1. 5，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為30°C。將達(dá)到對數(shù)生長期的種子液按10-15%的接種量，接種于生產(chǎn)罐中培養(yǎng)。生產(chǎn)罐所用的培養(yǎng)基配方與種子罐一祥。生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0. 8-1. 5，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為30°C，全程培養(yǎng)時(shí)間為48-72小吋，結(jié)束后菌體10億個/ml。發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接作為強(qiáng)化蕈菌富集的液體劑； 應(yīng)用例I
檢測菌株對重金屬Pb，Cu和Cd的活化能力。實(shí)驗(yàn)研究用土收集于四川大學(xué)本實(shí)驗(yàn)室Pb-Cu-Cd人工污染實(shí)驗(yàn)土壤，在本實(shí)驗(yàn)之前，該土壤已作為實(shí)驗(yàn)用土，供蕈菌修復(fù)研究使用過一次，而后一直放置于大棚中達(dá)十個月之久，以固定平衡重金屬，實(shí)現(xiàn)對天然污染土壌的更好模擬。土壤過100目篩，經(jīng)連續(xù)三天121°C高溫滅菌I h以消除土壌原有微生物影響。取在SLP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，長至對數(shù)晩期的菌液，經(jīng)6000 rpm離心10 min,無菌雙蒸水洗滌兩次，離心重懸，制成約IO9 cfu πιΓ1的菌懸液。以I ml菌懸液接種10 g前面滅菌好的污染土壌，室溫下培養(yǎng)10 d，然后直接加入100 ml去離子水以提取土壌中活化態(tài)的Pb，Cu和Cd。土壤懸液先經(jīng)10000 rpm離心10 min，上清經(jīng)微孔濾膜過濾后，加入兩滴濃HNO3(GR)以防止金屬沉淀和抑制微生物生長。濾液中的Pb，Cu和Cd濃度通過火焰原子分光光度計(jì)(VARIAN，SpectrAA-220Fs)進(jìn)行測定。對照為不加抗性菌。室溫下培養(yǎng)10 d后，與對照相比，重金屬Pb，Cu和Cd的活化能力達(dá)到到原來的6. 48，6. 29和5. 72倍，主要是因?yàn)橥寥乐兄亟饘倏剐跃煞置谏锉砻婊钚詣?，有機(jī)酸和產(chǎn)生鐵載體等，進(jìn)而活化重金屬，増加土壌中金屬的生物可利用性；
表I. CQ4對土壤中重金屬的活化能力(mg/kg)
IPb ]Cu [Cd 對照 11.46 31. 46 2. 72 CQ4 174. 12]l97. 51 [l5. 55
應(yīng)用例2
用盆栽實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其對蕈菌生物量的增強(qiáng)效應(yīng)。每ー盆含有7. O kg如上所述非滅菌污染土壤和I. O kg蕈菌菌袋。用于土壤接種的細(xì)菌采用SMS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。制備IO9 cfuπιΓ1的菌懸液，在種植蕈菌的時(shí)候，每盆噴灑IOml菌懸液進(jìn)行接種。對照組用10 ml無菌去離子水接種。用大棚控制蕈菌的生長條件，為盡量消除不同位置對盆栽實(shí)驗(yàn)的影響，不同處理的盆栽完全按照隨機(jī)排列。同時(shí)，為保證結(jié)果的可靠性，每ー處理設(shè)置三個重復(fù)。在將要開傘的時(shí)候，從土中小心拔出子實(shí)體，先用O. 01 M EDTA多次清洗，再用去離子水清洗，以去除表面非特異結(jié)合的金屬元素。洗浄后的子實(shí)體在80°C下烘干，測定其干重。與對照相比，噴施抗性菌的蕈菌，其生物量提高了 98. 18% ；
表2. CQ4菌株對蕈菌生物量(干重)的影響
權(quán)利要求
1.ー種重金屬抗性菌，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陽性的芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)的CQ4菌株，其主要生物學(xué)特性為細(xì)胞呈直桿狀，O. 5 I. 5 μ mX 2. 2 7.3μπι，常以成對或鏈狀排列，具圓端或方端，以周生鞭毛運(yùn)動；芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，能抗許多不良環(huán)境；好氧或兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，具發(fā)酵或呼吸代謝類型；菌落白色大型，中有一色淺圈，邊緣向周圍延展成波紋狀，菌落中部較厚，不透明，邊緣延展部分較薄，無色透明；接觸酶為陽性，水解淀粉，硝酸鹽還原，L-阿拉伯糖和D-木糖不產(chǎn)酸，不利用檸檬酸，形成吲哚、溶菌酶不敏感。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的芽孢桿菌重金屬抗性菌株制成的菌劑，其特征在于，具體制備エ藝如下 (1)挑取所述的重金屬抗性菌{Bacillussp.) CQ4的單菌落,接種于試管斜面； (2)將重金屬抗性菌(Pacillussp.) CQ4的斜面種接種于LB培養(yǎng)基搖瓶中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期； (3)將上述培養(yǎng)好的菌液按10-15%體積接種量轉(zhuǎn)入種子罐，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期；種子罐所用的培養(yǎng)基是SMS培養(yǎng)基；SMS培養(yǎng)基的配方是sucrose，1%; (NH4)2SO4, 0.1%;K2HPO4j O. 2%; MgSO4, 0.05%; NaClj 0.01%; yeast extract, 0.05%; CaCO3, 0.05%; pH7. 2 ； (4)將達(dá)到對數(shù)生長期的種子液按10-15%的接種量接種與生產(chǎn)罐中培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用的培養(yǎng)基配方與種子罐ー樣； (5)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:0.8-1. 5，攪拌速度為200轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為30°C，全程培養(yǎng)時(shí)間為48-72小時(shí)，結(jié)束后菌體10億個/ml ;發(fā)酵完成后，培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型。
3.如權(quán)利要求I所述的重金屬抗性菌{Bacillussp.) CQ4在強(qiáng)化蕈菌富集土壤重金屬上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一株具有重金屬抗性并能強(qiáng)化蕈菌富集土壤重金屬的微生物新菌種---芽孢桿菌(Bacillussp.)CQ4及其菌劑，屬于環(huán)境微生物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所篩選到的菌株制劑能夠活化土壤中重金屬Pb,Cu和Cd，并有效的能促進(jìn)蕈菌本身的生長,以及增加蕈菌體內(nèi)富集重金屬Pb,Cu和Cd的濃度。本發(fā)明針對目前工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題和需求，具有廣闊的市場前景。
文檔編號C12N1/20GK102676440SQ201210211058
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者徐恒, 曹艷茹, 陳正鎖 申請人:四川大學(xué)