專利名稱：用于檢測ERCC1mRNA的核酸檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生命科學和生物技術領域，特別是ー種基因檢測試劑盒，采用探針實時熒光定量PCR技術，能夠?qū)θ祟惙切〖毎伟?NSCLC)中的ERCCl表達水平進行檢測，可有效的節(jié)約檢測時間，提聞檢測精度。
背景技術：
肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的腫瘤之一，其中約80%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。非小細胞肺癌的治療要根據(jù)肺癌的臨床分期來進 行。對I、II、IIIA期主要以手術切除為主，_轉(zhuǎn)移顯著者，于壬龍前可輔以化療或放療。但是由于其癌細胞生長分裂較慢，擴散轉(zhuǎn)移相對較晩；現(xiàn)今又缺乏有效的早期診斷手段，初診時約75%的患者失去了第一次手術機會，即確診時多已不能進行手術治療，僅能通過化療或放療緩解。而晚期NSCLC目前仍以聯(lián)合化療為主，但5年生存率不到15%。因而早發(fā)現(xiàn)、早診斷是爭取良好預后的關鍵所在。ERCCl基因位于染色體19ql3. 2-13. 3編碼ー種含有297個氨基酸的蛋白質(zhì)，參與DNA鏈的切割和損傷修復，其表達產(chǎn)物與DNA修復酶缺乏互補基因F(XPF)形成緊密的異ニ聚體(ERCC1 — XPF)，具有損傷識別和切除5’端的雙重作用，在核苷酸切除修復(nucleotide excision repair,NER)中起到限速或調(diào)節(jié)的重要作用。其活性的高低可反映整個NER修復活性的水平。在ー些腫瘤細胞中，ERCCl，XPB，XPD等核苷酸切除修復因子mRNA表達顯著降低，提示核苷酸剪切修復能力的降低，導致細胞發(fā)生癌變的幾率増加。有報道I一III期NSCLC患者手術標本ERCCl的表達水平與生存期存在一定的關系①I期NSCLC患者存在ERCCl高表達，是術后預后良好的獨立指標。②ERCCl表達對I期和II 一III期NSCLC術后生存具有雙重效應=ERCCl高表達減少了術后腫瘤復發(fā)的危險但同時對DDP耐藥，I期NSCLC術后ERCCl高表達發(fā)揮更多的是其保護的一面，而II 一III期以鉬類耐藥或抵抗為主。因而，ERCCl表達水平對于后期的用藥有著極其重要的指導作用。在實際應用中，用于檢測ERCCl表達的方法主要為免疫組化，盡管該法原理簡單，但是試驗過程過于繁瑣，需要的試劑種類繁多，且試驗結果需要經(jīng)驗豐富的專家來判讀，判讀結果存在較大的主觀性，一定程度上限制了該法的應用。正是因為免疫組化法存在這些問題，才促使我們探索新的方法來檢測ERCCl表達水平。實時熒光定量PCR法具有較高的靈敏度和特異性，而且能對PCR進行實時在線檢測，反應ERCCl在組織中的初始含量，試驗節(jié)約了大量的檢測時間，還避免了遺留污染的發(fā)生。常見的方法有SYBR GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBRGreenI由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本研究采用實時熒光PCR技術結合Taqman探針法應用于ERCCl基因檢測
發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術中檢測ERCCl的不足，本發(fā)明設計了檢測內(nèi)參/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術檢測ERCCl基因。通過調(diào)整兩個基因的引物探針濃度及比例，優(yōu)化PCR的反應體系和反應條件，開發(fā)了ー種用于檢測ERCCl mRNA的核酸檢測試劑盒。用于檢測ERCClmRNA的核酸檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品；其特征在于檢測體系PCR反應液包括PCR緩沖液、d NTP、Mg2+、檢測用上下游引物ERCCl-F/ERCCl-R 和探針 ERC Cl-Probe、參照用上下游引物 Actin-F/Actin-R 探針 Actin-Probe ;其中，ERCCl-F GGGAATTTGGCGACGTAATTCERCCl-R GCGGAGGCTGAGGAACAG ERCCl-Probe :FAM-TATGTGCTGGGCCAGAGCACCTGTG_TAMRAActin-F TGAGCGAGGCTACAGCTTActin-R TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin-Probe FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA 進ー步地，檢測用上下游引物和探針的比例優(yōu)選為ERCC1-F ERCCl-R ERCCl-Probe 的摩爾比為 2 : 2 : I。參照用上下游引物和探針的比例優(yōu)選為Actin-F : Actin-R : Actin-Probe的摩爾比為2:2:1。所述陽性對照品為含有ERCCl基因組的溶液；所述陰性對照品為無ERCCl基因組的溶液。RNA提取液可用商業(yè)產(chǎn)品QIAGEN RNeasy FFPE Kit石蠟RNA抽提試劑盒替代。使用本發(fā)明的試劑盒，將實時熒光PCR技術結合采用Tapman探針，可以對ERCClmRNA進行檢測，檢測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節(jié)約檢測時間。利用雙標準曲線法，將檢測結果與正常人的表達水平(0. 55)相比，能衡量受測者體內(nèi)ERCCl基因表達水平是否正常，該方法是ー種新型的用于評價患者ERCCl表達水平的方法，也有助于患者的后期治療方案的確定。由于引入了“正常人”替代了原有的單純個體檢測，不但能夠?qū)κ軠y者體內(nèi)ERCCl基因表達量進行檢測，同時還能夠與正常水平進行比較，指導后期用藥，可用于輔助臨床上乳腺癌的早期診斷、早期預防及高危人群的篩選。


圖I是陽性檢測結果示意圖；圖2是陰性檢測結果示意圖。
具體實施例方式實施例I本發(fā)明的用于檢測ERCClmRNA的核酸檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液；RNA 提取液QIAGEN RNeasy FFPE Kit。檢測體系PCR 反應液THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(2X )、ERCC1 引物各 0. 8uM、ERCCl-probe (探針)0. 4uM ;Actin 引物各 0. 8uM、Actin-probe (探針)0. 4uM ;其中，ERCCl-F GGGAATTTGGCGACGTAATTCERCCl-R GCGGAGGCTGAGGAACAGERCCl-Probe FAM-TATGTGCTGGGCCAGAGCACCTGTG-TAMRAActin-F TGAGCGAGGCTACAGCTTActin-R TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin-Probe FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ；陽性對照品含ERCCI基因組溶液； 陰性對照品不含ERCCl基因組溶液。實施例2本發(fā)明試劑盒的使用方法(I)抽提石蠟切片中的組織RNA:切去組織或者石蠟片樣本于I. 5ml離心管中(刮拭);加入Iml組織透明液,振蕩混勻后13000rpm離心Imin ;去除上清加入500ml組織透明液振蕩混勻后13000rpm離心Imin ;去除上清,加入Iml無水こ醇振蕩混勻后13000rpm離心Imin;去除上清后至于37度金屬浴IOmin (開蓋)，直至液體干燥；參考QIAGEN RNeasyFFPE Kit石蠟RNA抽提試劑盒說明書，提取樣本RNA。(2)參考T0Y0B0公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA反轉(zhuǎn)為 cDNA。(3)試劑配置按檢測人份數(shù)配置檢測體系PCR反應液各X ul，每人份23ul分裝X=23ul反應液X (8份內(nèi)參(標準曲線)+8份目的基因(標準曲線)+n份標本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白対照)。(4)加樣加入檢測體系PCR反應液中2ulcDNA ;陽性對照和陰性對照直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2ul生理鹽水或不加任何物質(zhì)。(5)檢測檢測在實時熒光PCR儀上進行，可用儀器包括ABI7300，7500 (美國Applied Biosystems 公司)等。反應條件95°C預變性 Imin ；95°C 15s, 58°C 35sec 40 個循環(huán)，突光信號于58°C 35sec時米集。(6)結果判斷將閾值線調(diào)整至背景信號及陰性擴增線以上，系統(tǒng)根據(jù)標準曲線和CT值自動計算出拷貝數(shù)。按照以下公式進行計算
權利要求
1.用于檢測ERCClmRNA的核酸檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品；其特征在于 檢測體系PCR反應液包括PCR緩沖液、d NTP、Mg2+、檢測用上下游引物ERCCl-F /ERCCl-R 和探針 ERCCl-Probe、參照用上下游引物 Actin-F/ Actin-R 探針 Actin-Probe ;其中，ERCCl-F GGGAATTTGGCGACGTAATTCERCCl-R GCGGAGGCTGAGGAACAGERCCl-Probe FAM-TATGTGCTGGGCCAGAGCACCTGTG-TAMRAActin-F TGAGCGAGGCTACAGCTT Actin-R TCCTTGATGTCGCGCACGATTTActin-Probe FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA
2.如權利要求I所述的核酸檢測試劑盒，其特征在于ERCCl-F ERCCl-R ERCCl-Probe 的摩爾比為 2 : 2 : I。
3.如權利要求I所述的核酸檢測試劑盒，其特征在于Actin-F: Actin-R :Actin-Probe 的摩爾比為 2 : 2 : I。
4.如權利要求I所述的核酸檢測試劑盒，其特征在于所述陽性對照品為含有ERCCl基因組的溶液；所述陰性對照品為無ERCCl基因組的溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測ERCC1mRNA的核酸檢測試劑盒，包括紅細胞裂解液、RNA提取液、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品；其特征在于，檢測體系PCR反應液包括PCR緩沖液、dNTP、Mg2+、檢測用上下游引物ERCC1-F/ERCC1-R和探針ERCC1-Probe、參照用上下游引物Actin-F/Actin-R探針Actin-Probe；其中，ERCC1-FGGGAATTTGGCGACGTAATTC；ERCC1-RGCGGAGGCTGAGGAACAG；ERCC1-ProbeFAM-TATGTGCTGGGCCAGAGCACCTGTG-TAMRA；Actin-FTGAGCGAGGCTACAGCTT；Actin-RTCCTTGATGTCGCGCACGATTT；Actin-ProbeFAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA。
文檔編號C12Q1/68GK102758011SQ20121018943
公開日2012年10月31日 申請日期2012年6月11日 優(yōu)先權日2012年6月11日
發(fā)明者周曉犢, 徐建成, 方國偉, 王淑一 申請人:合肥艾迪康臨床檢驗所有限公司