專利名稱：鲇生長激素與穿腸膜肽tat融合蛋白及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種saGH-TAT重組融合蛋白，還涉及一種saGH-TAT重組融合蛋白的制備方法，還涉及一種表達(dá)saGH-TAT重組融合蛋白的基因工程菌，還涉及一種saGH-TAT重組融合蛋白在促進(jìn)魚類生長中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生長激素(Growth Hormone, GH)是一類由中腺垂體細(xì)胞分泌的單鏈肽類素,本質(zhì)是蛋白質(zhì)。GH廣泛存在于脊椎動(dòng)物(哺乳綱，鳥綱，爬行綱，魚綱等)中，在多種重要的內(nèi)分泌調(diào)控活動(dòng)中起著重要的作用，尤其表現(xiàn)在促進(jìn)魚體快速生長上，由于在魚類養(yǎng)殖業(yè)上的廣泛前景，因而從其被發(fā)現(xiàn)開始一直成為研究的熱點(diǎn)。大量生長激素可以通過重組生長激素基因工程菌發(fā)酵而獲得。魚類生長激素基因在大腸桿菌中的表達(dá)，最早是由Sakine在1985年完成的，誘導(dǎo)表達(dá)的生長激素蛋白產(chǎn)物占·細(xì)胞總蛋白的15%。隨后，虹鱒、鮭、羅非魚等的生長激素也在大腸桿菌中相繼獲得表達(dá)。有兩類方法推動(dòng)著魚類生長激素基因體外表達(dá)向應(yīng)用發(fā)展其一是表達(dá)效率的提高，根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子和已知的草魚生長激素氨基酸序列，人工合成草魚生長激素cDNA,并構(gòu)建表達(dá)載體pET-GH，轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，在T7啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，通過誘導(dǎo)，獲得的草魚生長激素表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白量的40%其二是采用可作為餌料的表達(dá)系統(tǒng)Kawata等構(gòu)建另一類表達(dá)載體pQSGl,在藻類(Agmenellum quadruplicatum)中表達(dá)重組的鮭魚生長激素，表達(dá)量占細(xì)胞蛋白含量的O. 1%。Tsai構(gòu)建了重組金槍魚生長激素cDNA的桿狀病毒載體ρΗΜ，在多聚角蛋白啟動(dòng)子的調(diào)控下，在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白的2%-8%新型表達(dá)載體的研制和應(yīng)用，可以獲得更高表達(dá)量的外源蛋白。酵母是單細(xì)胞低等真核生物，它不僅具備原核細(xì)胞增殖快、易培養(yǎng)、便于基因工程操作等特性，同時(shí)又具有真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后加工的功能和重組蛋白正確折疊的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，加之酵母粉本身就是非常好的單細(xì)胞蛋白餌料添加劑，富含各種必需的氨基酸、維生素。因此，以酵母作為生長激素的表達(dá)宿主菌，在生產(chǎn)中更具有價(jià)值！啤酒酵母首先被用來作為外源基因的表達(dá)宿主菌，但在大量表達(dá)外源蛋白時(shí)，性狀不夠穩(wěn)定，質(zhì)粒易于丟失，不適合高密度培養(yǎng)。甲醇營養(yǎng)性酵母(Pichia pastoris)，又稱畢赤酵母，可利用烷烴類化合物來生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白，成熟的大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)建立。生長激素直接投喂給魚苗，可以促進(jìn)魚體的生長，表明生長激素多肽可以活性成分的形式進(jìn)入魚體。研究發(fā)現(xiàn)，魚類小腸上皮細(xì)胞可以通過胞飲作用吸收大分子并轉(zhuǎn)移進(jìn)入血液循環(huán)。給虹鱒投喂重組鮭魚生長激素，虹鱒的體重和體長明顯高于對照。通過熒光標(biāo)記生長激素進(jìn)一步確證，虹鱒的后腸是吸收生長激素的部位。在生長激素通過胃和腸道前部時(shí)，其中大部分被降解，余下的小部分到達(dá)后腸并進(jìn)入血液循環(huán)。當(dāng)生長激素以抗酸多聚物包被后投喂魚，魚體血液中的生長激素水平以及魚的生長速度都明顯提高。鯉科魚類與鮭科魚類不同的是沒有胃，灌喂不同魚同樣濃度的辣根過氧化物酶，發(fā)現(xiàn)鯉魚血漿中的辣根過氧化物酶是虹鱒血漿的1000倍。所以生長激素在投喂給鯉科魚類時(shí)，可以有更多的生長激素蛋白分子到達(dá)后腸而被吸收。近年來發(fā)現(xiàn)有一些小分子的多肽可以介導(dǎo)外源物質(zhì)穿過細(xì)胞膜，這種小分子多肽被稱之為細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPP)。許多CPP都是來源于某些直接與宿主細(xì)胞相互作用的病毒結(jié)構(gòu)蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transductiondomains，PTD)?，F(xiàn)在研究最多、應(yīng)用范圍最廣的細(xì)胞穿膜肽來源于人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的轉(zhuǎn)錄激活因子(Trans-activating transcriptional activator, Tat)。Tat 蛋白中存在3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，分別是位于N-端的酸性區(qū)，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之間的DNA結(jié)合區(qū)，該區(qū)域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之間的堿性區(qū)，是主要的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，參與Tat蛋白的細(xì)胞內(nèi)化作用。Tat蛋白共有86個(gè)氨基酸，是HIV復(fù)制所必需的調(diào)節(jié)因子。Schwarze發(fā)現(xiàn)位于Tat蛋白中第47_57位之間的11個(gè)氨基酸YGRKKRRQRRR不僅能夠獨(dú)立穿過細(xì)胞膜，而且其穿 膜效率比全長的Tat蛋白還要高。這段多肽即是TAT穿膜肽。不管是單獨(dú)的TAT穿膜肽，或者是攜帶其他大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、寡聚核苷酸或脂質(zhì)體等，在穿膜時(shí)都可以表現(xiàn)出較高的穿膜活性。在攜帶外源物質(zhì)穿膜時(shí)，TAT介導(dǎo)的穿膜似乎與其要攜帶的分子大小無關(guān)，100KD的蛋白質(zhì)、40nm大小的納米顆粒、甚至200nm大小的脂質(zhì)體都可以經(jīng)TAT運(yùn)載入細(xì)胞內(nèi)。而且，以這種方式運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)體甚至可以在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)Ih后仍然可保持結(jié)構(gòu)的完整性。相反的，沒有與TAT穿膜肽連接的物質(zhì)在與細(xì)胞共同孵育時(shí)均不能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。TAT穿膜肽的序列中由于有6個(gè)精氨酸和2個(gè)賴氨酸殘基，因此是帶有高度正電荷的多肽。以不帶電荷的丙氨酸替代其中的任何一個(gè)堿性氨基酸殘基都會(huì)使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸殘基時(shí)穿膜活性則不會(huì)發(fā)生改變。這說明TAT穿膜肽所帶的正電荷是其穿膜功能所必需的，因此推測這些正電荷很可能是能夠與真核細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生強(qiáng)的靜電作用，從而介導(dǎo)了穿膜過程。對TAT穿膜肽的親和性分析發(fā)現(xiàn)，它能夠與許多細(xì)胞膜表面的陰離子通過靜電作用強(qiáng)烈地結(jié)合，與之結(jié)合的細(xì)胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸豐富的多肽可以穿過細(xì)胞膜，而其他氨基酸如賴氨酸、組氨酸等豐富的多肽卻不具有此功能。然而，由精氨酸組成的支鏈聚合物與直鏈聚合物具有同樣的穿膜效率。此外，研究發(fā)現(xiàn)TAT穿膜肽不會(huì)因?yàn)槭中越Y(jié)構(gòu)的改變而影響其穿膜活性，其手性分子與自然結(jié)構(gòu)具有相同的穿膜活性。這說明這種細(xì)胞穿膜肽很可能不依賴于特定的結(jié)合位點(diǎn)。然而，多肽的長度是影響穿膜效率的重要因素。穿膜效率與精氨酸的個(gè)數(shù)有關(guān)，含有6個(gè)或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5個(gè)精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15個(gè)氨基酸時(shí)，穿膜效率會(huì)隨著多肽大小的增加而增強(qiáng)。大于15個(gè)氨基酸的多肽雖然也可具有穿膜活性，但其效率卻會(huì)明顯減小。盡管對于TAT穿膜肽的穿膜功能研究的比較多，但是到目前為止，關(guān)于TAT穿膜肽進(jìn)入細(xì)胞的分子機(jī)制還沒有完全研究清楚。早期研究認(rèn)為是通過直接轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制穿過細(xì)胞膜，且是不依賴于能量的，但最近的研究也有與這一觀點(diǎn)不同的結(jié)果。盡管其進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制還沒有完全研究透徹。盡管TAT穿膜肽的應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛，但利用TAT攜帶魚的生長素跨腸膜并顯著提高魚的產(chǎn)量國內(nèi)外還沒有報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種SaGH-TAT融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ IDNO. 2所示。該融合蛋白能夠增強(qiáng)鹽水的耐受能力，比表達(dá)的saGH蛋白在耐滲透壓的能力上更強(qiáng)，可以穿過腸細(xì)胞膜而進(jìn)入血液中，使GH可以不經(jīng)注射而直接進(jìn)入血液中，通過血液在魚體內(nèi)的循環(huán)，使其融合蛋白到達(dá)不同的組織，增加了 GH的利用效率，同時(shí)也提高了藥效。本發(fā)明的目的是在于提供了一種大腸桿菌基因工程菌株，大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21 (DE3) pET-22b(+)-saGH-TAT, ΓοπιρΤ hsdSB (rB mB0 gal dcm(DE3)，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012126，該菌株能表達(dá)saGH-TAT的融合蛋白，其能顯著促進(jìn)魚體生長，效率
高,安全性好。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種融合蛋白saGH-TAT的制備方法，該方法可應(yīng)用于大規(guī)模的養(yǎng)殖業(yè)中，表達(dá)量大，操作簡單，成本低。 本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種大腸桿菌基因工程菌株在促進(jìn)硬骨魚體(鲇魚、黃顙魚、羅非魚、鯉魚、草魚)生長中的應(yīng)用，能夠高效利用生長激素添加劑并且快速提高魚體增重。本發(fā)明還有一個(gè)目的是在于提供了一種分離重組的鲇生長激素與穿腸膜肽融合蛋白在增強(qiáng)羅非魚耐高滲透壓海水的研究中的應(yīng)用。為了達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，本發(fā)明利用大腸桿菌表達(dá)TAT跨膜域和saGH的融合蛋白，意在促進(jìn)鲇科魚類的生長。通過基因工程生產(chǎn)的saGH-TAT融合蛋白可以作為魚類養(yǎng)殖中的促生長劑，能夠顯著提高對魚體的生長速率。本發(fā)明另一個(gè)創(chuàng)新之處在于，將TAT穿膜肽和saGH融合表達(dá)，由于TAT穿膜肽可以攜帶外源蛋白穿過細(xì)胞膜，因此將saGH-TAT經(jīng)口投喂魚后該融合蛋白可以穿過腸細(xì)胞膜而進(jìn)入血液中，使GH (Growth Hormone, GH)可以不經(jīng)注射而直接進(jìn)入血液中，通過血液在魚體內(nèi)的循環(huán)，使其融合蛋白到達(dá)不同的組織，增加了 GH的利用效率，同時(shí)也提高了藥效。TAT穿膜肽目前還沒有直接應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，但其獨(dú)特的穿膜效率十分具有吸引力。而且本發(fā)明公開的基因工程菌株的構(gòu)建方法可以應(yīng)用于大規(guī)模的養(yǎng)殖業(yè)中，表達(dá)量大，操作簡單，成本低。一種融合蛋白saGH-TAT的制備方法，其步驟是A、鲇生長激素基因的制備首先切取已處死的鲇(人工養(yǎng)殖南方大口鲇)頭部洗凈備用，用刀從口劈開頭部，使上頜部和下頜部分開，在上頜部的腹面有一長管狀的骨骼為鲇副蝶骨，將刀橫擱在副蝶骨的一端，用錘輕敲刀背兩至三下，刀口深度約為2-3mm，副蝶骨的另一端同法敲擊，然后將刀口輕輕扭動(dòng)，就可以將副蝶骨扭下，便可獲得完整的腦垂體。根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的鲇科魚類GH的序列(GenBank:AY157496. I)設(shè)計(jì)PCR引物，以上述腦垂體提取的RNA作為模板反轉(zhuǎn)出cDNA, PCR擴(kuò)增目的基因silurus asotus growthhormone gene (saGH)，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pMD18_T(購自Takara公司)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取單菌落用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序。得到的陽性克隆子即為包含saGH基因的大腸桿菌，用于基因的擴(kuò)增和保藏。B.通過重疊延伸PCR的方法將TAT 33bp堿基連入saGH的3’端構(gòu)成saGH_TAT，將PCR產(chǎn)物組裝入pMD18-T載體，得到重組載體pMD18-T-saGH-TAT，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 JM109 (recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44,relAl, Δ (lac-proAB)/F’ [traD36, proAB+, lac Iq, IacZ Δ M15],購自novagen公司),挑取單菌落用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序。得到的陽性克隆子即為包含saGH-TAT的大腸桿菌，用于基因的擴(kuò)增和保藏。
C.融合基因的制備及表達(dá)載體的構(gòu)建首先雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-saGH-TAT和質(zhì)粒pET_22b ( + )(購自novagen公司，amp1")，膠回收含saGH-TAT基因的片段和開環(huán)pET-22a ( + )片段，16°C連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài) E. coli BL21 CF-, ompT, hsdS (rBB-mB —)，gal, dcm (DE3))中，所得到的陽性克隆子是本發(fā)明涉及的saGH-TAT融合基因的大腸桿菌，命名為 BL21 (DE3 ) pET-22b (+) -saGH-TAT。D.基因工程菌的制備將質(zhì)粒pET_22a ( + ) -saGH-TAT轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21(DE3) CF-, ompT，hsdS (rBB-mB —)，gal, dcm (DE3))中，PCR 鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠表達(dá)saGH-TAT的大腸桿菌基因工程菌株BL21 (DE3)pET-22b (+)-saGH-TAT,申請人已于2012年4月20將該菌送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，地址中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)=CCTCC NO M 2012126，分類命名大腸桿菌BL21(DE3)pET-22b (+) -saGH-TAT,F^ompT hsdSB (rB_mB0 gal dcm(DE3) ,Escherichia coli B L21(DE3) pET_22b (+) -saGH-TAT, F ompT hsdSB (rB mB) gal dcm (DE3)。一種大腸桿菌基因工程菌株BL21 (DE3)pET_22b(+)-saGH-TAT，能夠在常規(guī)的大腸桿菌培養(yǎng)基中生長，并具有氨芐抗性，代謝正常，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后能大量分泌saGH-TAT蛋白。E.基因工程融合蛋白的制備將上述基因工程菌轉(zhuǎn)接到2XYT培養(yǎng)基中，融合蛋白saGH-TAT以包涵體的形式高效表達(dá)。獲得了基因工程融合蛋白saGH-TAT的大腸桿菌基因工程菌株后經(jīng)過破碎純化后能夠簡單的與各種飼料混合，直接口服投喂，促進(jìn)魚體生長。一種大腸桿菌基因工程菌株在促進(jìn)硬骨魚體(鲇魚、黃顙魚、羅非魚、鯉魚、草魚)生長中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是I.促生長實(shí)驗(yàn)選取形體相似的羅非魚苗(Oreochromis Niloticus),隨機(jī)分成11組,每組20尾，放入80cmX60cmX20cm的飼養(yǎng)盆中，水溫恒定25°C.每天換一次水。在實(shí)驗(yàn)處理之前讓其在飼養(yǎng)盆中適應(yīng)I周時(shí)間。11組處理如下I)非處理組； 2) O. 7% (w/v)生理鹽水腹腔注射組；3) 5 μ g/g 體重 saGH-TAT 腹腔注射組；4) I μ g/g體重GH-TAT腹腔注射組；5)0. I μ g/g 體重 GH-TAT 腹腔注射組；6) 5 μ g/g體重saGH腹腔注射組；7) I μ g/g體重GH腹腔注射組；8)0. I μ g/g體重GH腹腔注射組；
9) I μ g/g 體重 saGH 口服組；10) I μ g/g 體重 saGH-TAT 口服組；11)0. 7%生理鹽水口服組。每周測體長、體重,處理六周。另外，設(shè)定三組口服實(shí)驗(yàn)分別按照體重的10%比例投喂飼料，重組蛋白包封量為
5μ g/g體重。2.耐滲透壓實(shí)驗(yàn)羅非魚先在淡水中喂養(yǎng)，轉(zhuǎn)入海水之前3天停止給魚喂食。大小相似的魚隨機(jī)分 組(2 - 3g)，保證所有實(shí)驗(yàn)組中魚體生長狀況相似。純化的saGH和saGH-TAT溶于自來水中。I)正常魚體對海水海水滲透壓耐受力將羅非魚隨機(jī)分成10組，每組5條，將魚放入不同濃度的海水(O, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75，85，100%)中，統(tǒng)計(jì)不同大小的羅非魚開始死亡時(shí)間和完全死亡時(shí)間。2)鲇生長激素(saGH和saGH-TAT)對海水存活力的影響將羅非魚隨機(jī)分成4組，每組20條，分別用濃度為2mg/L的saGH，saGH-TAT, BSA水溶液浸泡羅非魚苗2小時(shí)和24小時(shí)后，直接將羅非魚轉(zhuǎn)到60%的海水中。統(tǒng)計(jì)2小時(shí)和24小時(shí)浸泡羅非魚苗后在海水中魚苗的存活率。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果I.本發(fā)明制備saGH-TAT融合蛋白能夠增強(qiáng)鹽水的耐受能力，比表達(dá)的saGH蛋白在耐滲透壓的能力上更強(qiáng)，可以穿過腸細(xì)胞膜而進(jìn)入血液中，使GH可以不經(jīng)注射而直接進(jìn)入血液中，通過血液在魚體內(nèi)的循環(huán)，使其融合蛋白到達(dá)不同的組織，增加了 GH的利用效率，同時(shí)也提高了藥效。2. 口服添加生長激素(saGH-TAT)飼料，能夠顯著提升魚體增長速率，相比于現(xiàn)有的單純添加生長激素(saGH)，能夠減少至少80%的蛋白用量，節(jié)約生產(chǎn)成本。3.本發(fā)明提供的融合蛋白saGH-TAT的制備方法，該方法可應(yīng)用于大規(guī)模的養(yǎng)殖業(yè)中，表達(dá)量大，操作簡單，成本低。


圖I為鲇腦垂體RNA瓊脂糖凝膠電泳圖提取的RNA為3條帶，自上而下分別為28S，18S和5S。圖2-1為一種RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果示意圖泳道I :DL2000Marker;泳道2-3: RT-PCR產(chǎn)物；泳道4 :陰性對照。獲得了大小570bp左右的條帶。圖2-2 為一種質(zhì)粒 pET22b (+) -saGH-TAT 構(gòu)建圖譜將獲得的saGH基因片段連入pMD18T載體中后用PCR將TAT序列連入saGH 3’端，然后連入表達(dá)載體pET22b(+)中。圖3 為一種 pET22b (+) -saGH/saGH-TAT PCR 及酶切鑒定示意圖單酶切或雙酶切以及PCR鑒定都能看到目的條帶。
Ml: DIO, 000 ;泳道 I :pET22b (+)-saGH 質(zhì)粒泳道;2 :pET22b (+)-saGH 質(zhì)粒 NdeI 單酶切；泳道3: pET22b (+) -saGH 質(zhì)粒 Ndel/Xhol 雙酶切；泳道 4: pET22b (+) -saGH 質(zhì)粒Ndel/PstI雙酶切；泳道5: saGH PCR擴(kuò)增產(chǎn)物泳道6: pET22b (+) -saGH-TAT質(zhì)粒；泳道7:pET22b (+)-saGH-TAT 質(zhì)粒 NdeI 單酶切；泳道 8 :pET22b (+)-saGH-TAT 質(zhì)粒 Ndel/Xhol 雙酶；泳道 9:pET22b(+)-saGH-TAT 質(zhì)粒 Ndel/PstI 雙酶切泳道 10:saGH_TAT PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M2 D2000 圖 4 為一種 BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH-TAT 在大腸桿菌中的表達(dá) SDS-PAGE 圖在22kd處和20KD處分別由目的蛋白saGH-TAT和saGH表達(dá)。泳道I:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(116. O, 66. 2，45. O, 35. O, 25. O, 18. 4，14. 4)；泳道2:BL21(DE3)/pET22b (+)未誘導(dǎo)；泳道 3: ImM IPTG 誘導(dǎo) BL21 (DE3)/pET22b (+)4 小時(shí)菌體；泳道4: ImM IPTG誘導(dǎo)BL21 (DE3) /pET22b (+) 4小時(shí)上清；泳道5: ImM IPTG誘導(dǎo)BL21 (DE3) /pET22b (+) 4 小時(shí)沉淀；泳道 6: BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 未誘導(dǎo)；泳道 7: ImM·IPTG 誘導(dǎo) BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 4 小時(shí)菌體；泳道 8: ImM IPTG 誘導(dǎo) BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 4 小時(shí)上清；泳道 9: ImM IPTG 誘導(dǎo) BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 4 小時(shí)沉淀；泳道10:純化saGH蛋白；泳道11: BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH-TAT未誘導(dǎo)；泳道 12: ImM IPTG 誘導(dǎo) BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH-TAT 4 小時(shí)菌體；泳道 13: ImM IPTG誘導(dǎo) BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT 4 小時(shí)上清；泳道 14 lmM IPTG 誘導(dǎo) BL21(DE3)/pET22b (+) -saGH-TAT 4 小時(shí)沉淀；泳道 15:純化 saGH-TAT 蛋白。圖5為一種兔抗saGH IgG純化SDS-PAGE示意圖獲得了大小為55kd的蛋白條帶。泳道I:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)泳道2:純化IgG泳道3:兔抗血清圖6為一種蛋白質(zhì)印跡分析圖獲得了單一免疫印跡條帶。泳道I :saGH泳道2: saGH-TAT泳道3:空菌體圖7為一種鲇鰓膜受體與GH結(jié)合曲線示意8為一種鲇鰓膜受體與GH-TAT結(jié)合曲線示意9為一種鲇腸膜受體與saGH/saGH-ΤΑΤ結(jié)合曲線示意10為一種鲇肝膜受體與saGH/saGH-ΤΑΤ結(jié)合曲線示意11為一種GH與活性或非活性受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)示意12為一種魚體重增長柱形圖示意13為一種4周后魚體重增長柱形示意14為8種常見淡水魚GH親緣關(guān)系圖
具體實(shí)施例方式本實(shí)驗(yàn)所涉及的分子生物學(xué)方法為常規(guī)方法，為本領(lǐng)域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳細(xì)闡述的請參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾等主編。實(shí)施例I :制備鲇生長激素基因，其步驟是I. I鲇腦垂體RNA的提取 按照TIANGEN RNA提取試劑盒操作，稍作改動(dòng)，具體步驟如下 取樣剪開魚頭骨,用鑷子取出腦垂體,重約IOOmg ；
將腦垂體放入加有Iml的TRNzol的Eppendorf管中，用勻衆(zhòng)棒搗碎；將勻漿樣品在20°C放置5min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離；40C 12000rpm 離心 IOmin,取上清；加入O. 2ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15秒，室溫(20_25°C，以下相同)放置3分鐘；40C 12000rpm離心15min，樣品會(huì)分成三層黃色的有機(jī)相，中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中，把水相(約600 μ I)轉(zhuǎn)移到新的離心管中。在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20min ；
4°C 12000rpm離心IOmin,去上清。離心前RNA沉淀經(jīng)常是看不見的，離心后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀；加入Iml 75% (V/V)乙醇(DEPC處理過的水配制)洗滌、沉淀。每使用Iml TRNzol至少Iml 75%乙醇對沉淀進(jìn)行洗滌；40C 5000rpm離心3min，倒出液體，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出；室溫放置晾干(2_3min)，加入30μ lRNase-free ddH20,反復(fù)吹打、混勻，充分溶解 RNA。L2RNA 檢測將提取的RNA與Loading Buffer混勻后在I. 5% (Μ/V)的瓊脂糖凝膠，I X TAE電泳緩沖液，5V/cm的條件下電泳30min，紫外燈下觀察RNA提取情況。RNA提取結(jié)果如圖I。saGH克隆結(jié)果用鲇垂體提取總RNA作為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)后，獲得了預(yù)期為570bp的DNA片段，如圖2所示。鲇生長激素(saGH) cDNA合成；根據(jù)Toyobo公司RT-PCR試劑盒方法進(jìn)行RNA熱變性
0]igo{dT)2C)(10 pmol/pl)I μ
提取 RNA11 μ!
總體枳12 μ]65°C, 5min,立即置于冰上。反應(yīng)液配置
權(quán)利要求
1.一種分離重組的基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。
2.一種分離重組的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
3.—種表達(dá)權(quán)利要求2所述蛋白的大腸桿菌基因工程菌株，其特征在于大腸桿菌{Escherichia coli)BL21(DE3)pET-22b (+) -saGH-TAT,hsdSB(rBmB)gal dcm (DE3)；CCTCC NO M2012126o
4.權(quán)利要求2所述融合蛋白的制備方法，其步驟是 A.鲇生長激素基因的制備獲取鲇頭部腦垂體，根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的鲇科魚類GH的序列設(shè)計(jì)PCR兼并引物，以上述腦垂體提取的RNA作為模板反轉(zhuǎn)出cDNA，PCR擴(kuò)增目的基因saGH，PCR產(chǎn)物通過DNA凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物并將其克隆到pMD18_T載體中，挑取單菌落用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含saGH基因的大腸桿菌，用于基因的擴(kuò)增和保藏； B.通過重疊延伸PCR的方法將TAT33bp堿基連入saGH的3’端構(gòu)成saGH-ΤΑΤ，將PCR產(chǎn)物組裝入PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取單菌落用堿裂解法小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，并進(jìn)行測序，得到的陽性克隆子即為包含saGH-TAT的大腸桿菌，用于基因的擴(kuò)增和保藏； C.融合基因的制備及表達(dá)載體的構(gòu)建首先雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-saGH-TAT和質(zhì)粒pET-22b ( + )，膠回收含saGH-TAT基因的片段和開環(huán)pET-22a ( + )片段，16°C連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E. coli中，所得到的陽性克隆子是包含saGH-TAT融合基因的大腸桿菌； D.基因工程菌的制備將步驟C中制得的質(zhì)粒pET-22a( + ) -saGH-TAT轉(zhuǎn)化到感受態(tài)BL21 (DE3)中，PCR鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，所得陽性克隆即為本發(fā)明涉及的能夠表達(dá)saGH-TAT的大腸桿菌基因工程菌株； E.基因工程融合蛋白的制備將上述基因工程菌轉(zhuǎn)接到2XYT培養(yǎng)基中，融合蛋白saGH-TAT以包涵體的形式高效表達(dá)。
5.權(quán)利要求2所述融合蛋白在促進(jìn)硬骨魚體生長中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求2所述的融合蛋白在增強(qiáng)羅非魚耐高滲透壓海水中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鲇生長激素與穿腸膜肽TAT融合蛋白及制備方法和應(yīng)用，特別是對于促進(jìn)硬骨魚類的生長和耐滲透壓上的應(yīng)用。融合蛋白的制備方法是從活鲇的腦垂體中提取RNA，然后經(jīng)過RT-PCR獲得包含編碼GH基因成熟肽的cDNA片段,將GH與TAT連接后連入表達(dá)載體pET22b(+),在大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá),獲得的純化融合蛋白通過投喂，注射或是浸泡等方式都能不同程度的提高魚體生長速率，增強(qiáng)鹽水的耐受能力。本發(fā)明相比于單純的使用GH表達(dá)蛋白應(yīng)用于魚體，效果更佳。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102899342SQ20121018843
公開日2013年1月30日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者孟小林, 徐進(jìn)平, 王健, 于京佑 申請人:武漢凱肽來生物科技有限公司