專利名稱：利用酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的酵母工程菌，本發(fā)明還涉及該工程菌的制備方法以及應(yīng)用該工程菌生產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
*雙果糖酐III (Difructose anhydride, DFAIII)是一種新型的非還原性雙糖，在自然界中少量存在于菊苣、菊芋等植物中，少量出現(xiàn)于蜂蜜、咖啡等的加工過程中。其相對甜度為蔗糖的52%，而熱量值卻只有蔗糖的1/15(0. 263kcal/g);性質(zhì)十分穩(wěn)定，74%相對濕度下不吸濕，比蔗糖更難吸濕，具有取代傳統(tǒng)甜味劑蔗糖的潛能。雙果糖酐III對熱和酸十分穩(wěn)定，在一般食品加工條件下，幾乎不會出現(xiàn)褐變或分解現(xiàn)象，能耐硬糖生產(chǎn)時的高溫熬煮而不褐變。同時，雙果糖酐III還具有良好的功能特性，如在消化道不吸收，且不產(chǎn)生能量，可作為一個甜味劑被用作減肥輔助治療；作為一種增歧因子，可促進腸道微生物的生長，明顯改善排便、利尿功能；作為促進礦物質(zhì)元素吸收的功能性糖，可使得Ca、Mg、Zn、Cu等礦物質(zhì)元素被人體吸收利用的程度大大提高，增進骨骼生長；在抗齲齒方面，其性質(zhì)可與木糖醇、山梨醇相媲美，不被誘發(fā)蛀牙的口腔鏈球菌利用，也不產(chǎn)酸。這些優(yōu)點使其在食品、保健、醫(yī)療領(lǐng)域中有廣闊的應(yīng)用前景。然而，雙果糖酐III在自然界的含量極低，天然提取分離成本高，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)的需求，而化學(xué)催化法有許多不利因素，例如形成許多副產(chǎn)物和化學(xué)污染物，而形成的許多副產(chǎn)物又使純化步驟變得復(fù)雜。而生物法制備雙果糖酐III的原料是菊糖，其來源廣泛，價格低廉，轉(zhuǎn)化率高，可達75%以上，屬于天然產(chǎn)品，符合消費者追求天然產(chǎn)品的消費心理，因此采用生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)雙果糖酐III成為研究的熱點。自1973年Uchiyama I首次從產(chǎn)脲節(jié)桿菌中發(fā)現(xiàn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶(Inulinfructotransferase, IFTase, EC 2. 4. I. 93),用生物轉(zhuǎn)化法制備雙果糖酐III的研究已經(jīng)有30余年的歷史，然而國內(nèi)除本課題組篩得一株IFTase生產(chǎn)菌株并對其進行相關(guān)研究夕卜，國內(nèi)仍無相關(guān)研究報道。國外關(guān)于菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的分子生物學(xué)研究始于1997年，Sakurai等人率先將ArtAroAacter sp. H65-7的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到了首個菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因開放閱讀框，并將其酶活由初始野生菌的胞外80 U/mL提高到胞內(nèi)酶活170 U/mL。迄今為止僅有5株菌實現(xiàn)了 IFTase的原核表達系統(tǒng)的活性表達，分別為 Arthrobacter sp. H65—7、Arthrobacter sp. A~6> Arthrobacter globiformisCll-I^ Arthrobacter sp.^ Bacillus 5/ . Snu_70 并且僅 A globiformis Cll-I菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶在胞外有酶活檢出，且酶活很低(1.5 U/mL)文獻Haraguchi K，Mori S，Hayashi K. Cloning of inulin fructotransferase (DFA Ill-Producing) gene fromArthrobacter globiformis Cll-I [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2000，89: 590-595.，其他該酶原核表達幾乎都為胞內(nèi)表達，這使IFTase酶的后期純化工藝較為繁瑣。同時，基因在原核表達中由于多為胞內(nèi)表達，信號肽序列存在不能被有效識別并切割的問題，據(jù)推斷這也是該酶原核表達活性較低的原因之一。此外，大腸桿菌是原核生物，其表達過程常產(chǎn)生毒素，其安全性存在一定問題。
畢赤酵母基因表達系統(tǒng)經(jīng)過近十年發(fā)展，已基本成為較完善的外源基因表達系統(tǒng)，具有易于高密度發(fā)酵，表達基因穩(wěn)定整合在宿主基因組中，能使產(chǎn)物有效分泌，培養(yǎng)方便經(jīng)濟等特點。與大腸桿菌相比能夠進行蛋白的翻譯后修飾加工，包括信號肽加工、蛋白質(zhì)折、二硫鍵形成、糖基化修飾等，可有效解決一些蛋白原核表達信號肽識別問題及胞內(nèi)包涵體形成問題，并在一定程度上能增加酶的穩(wěn)定性，也具有更高的安全性。目前，美國FDA已能評價來自該系統(tǒng)的基因工程產(chǎn)品，最近來自該系統(tǒng)的Gphelon制劑已獲得FDA批準(zhǔn)，所以該系統(tǒng)被認(rèn)為是安全的。同時，畢赤酵母表達系統(tǒng)可以采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵，僅提供酵母生長所需營養(yǎng)即可高密度發(fā)酵，細(xì)胞干重可達100 g/L。此外，酵母細(xì)胞自身分泌的蛋白很少，可有效簡化分離純化工藝。本發(fā)明首次實現(xiàn)了菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因在酵母中的分泌表達，獲得能發(fā)酵生產(chǎn)具有較高安全性及生物活性的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的工程菌，具有重要的理論意義，為國內(nèi)外菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的真核表達進行了成功初探。同時本發(fā)明也具有實際應(yīng)用價值，為菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶及功能性甜味劑DFA III工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)及應(yīng)用潛力，也為功能性甜味劑的開發(fā)和研究提供廣闊空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供構(gòu)建菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酵母工程菌的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種利用酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的方法，步驟為
(1)以金黃節(jié)桿菌ClrtAroAacteraurescens)SW,. 001為出發(fā)菌株,PCR法獲得菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因，通過雙酶切構(gòu)建重組載體X-IFTase ；
所述重組載體 X-IFTase 為pPIC9K - IFTase、pPIC9 - IFTase、pPICZaA/B/C-IFTase 或 pGAPZaA/B/C - IFTase ；
(2)將重組載體X-IFTase經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，并篩選鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，即構(gòu)建得到產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酵母工程菌；
所述畢赤酵母菌株是GS115、X-33、KM71或SMD1168 ；
(3)工程菌液體發(fā)酵生產(chǎn)活性菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶。將菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酵母工程菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達，發(fā)酵上清液與菊糖進行反應(yīng)HPLC法檢測雙果糖酐III生成情況以進行菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶活性鑒定，表明獲得的酵母工程菌具有分泌生產(chǎn)具有活性的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的能力；
重組菌單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基28-30°C、280 rpm培養(yǎng)至0D_=2_6，離心收集菌體用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體使0D_=1左右，雙層紗布封口 30°C、280 rpm搖瓶發(fā)酵，每24h向培養(yǎng)基添加100%甲醇至終濃度為0. 5%-1. 0%。獲得的4 mg/mL G418-YPD陽性重組菌株60h發(fā)酵液產(chǎn)活性菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶粗酶活為 10. 3U/mL。步驟(I)中所述菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因為菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶全基因或根據(jù)酵母密碼子偏好性改造的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因。步驟(2)中所述重組載體線性化利用Sac I或Sal I進行酶切。
步驟(2)中所述轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株細(xì)胞的方法采用電擊轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化。步驟(3)中所述工程菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基是BMGY/BMMY、BMG/BMM或YPD。從金黃節(jié)桿菌ClrtAroAacterSK8. 001提取菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因組DNA，用特異性引物PCR的方法擴增獲得不包含信號肽部分的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因，將該基因以EcoRl和I作為酶切位點構(gòu)建表達載體，重組載體經(jīng)過雙酶切及基因測序鑒定，轉(zhuǎn)化入酵母感受態(tài)細(xì)胞，通過組氨酸缺陷及抗性篩選及PCR驗證獲得陽性克隆，然后，利用甲醇誘導(dǎo)分泌表達菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶，從而實現(xiàn)菊糖為新型功能性甜味劑雙果糖酐III的酶法制備，具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)前景。該金黃節(jié)桿HArthrobacter aurescens) SK8. 001 在中國專利200810196709.8 “一株產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的菌株和用該酶生產(chǎn)雙果糖酐III的方法”中進行了保藏和公開，保藏編號為CCTCC NO M 208120。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明實現(xiàn)了菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的酵母分泌表達，獲得具有活 性的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶，對于新型功能性甜味劑雙果糖酐III的酶法工業(yè)化生產(chǎn)具有廣泛的應(yīng)用前景和意義。


圖I重組質(zhì)粒pPPIC9K_IFTase的構(gòu)建示意圖。用于酵母生產(chǎn)IFTase的PPIC9K-IFTase表達載體圖
圖2重組酵母誘導(dǎo)表達粗酶液SDS-PAGE。酵母重組菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)各時間點的上清SDS-PAGE 圖。圖3重組菌IFTase粗酶活性檢測的HPLC圖譜。HPLC法檢測重組菌IFTase粗酶活性(a)雙果糖酐III標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜；(b)重組酵母發(fā)酵上清液與菊糖反應(yīng)后的HPLC圖譜。圖4重組菌生產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵上清液酶活及菌體生長情況。
具體實施例方式
實施例I目的基因ift的獲得(菌落PCR法)
模板的制備取一環(huán)金黃色節(jié)桿菌ArtAroAacter aurescens SK8. 001單菌落,溶于IOOii L滅菌水中，將菌懸液-20°C冷凍lOmin，再沸水浴lOmin，室溫靜置。取上清液3 ii L作為目的基因PCR模板，以包含I和I酶切位點的下列核苷酸序列作為引物，經(jīng)PCR擴增得到不含信號肽序列的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶DNA片段，S卩i/匕基因擴增引物
上游引物 Pl :5’ -CCGGAAITCGCCGAAGGCGCGAAGG-3’，
下游引物 P2 :5’ -ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGGCGTGGGCCGA-3’，ift基因擴增體系(50 u L)
ddHaO|22 U L
模士_3u L
50uM上游引物TTI~
50tiM下游引物 IuL PremixTaiy 酶 23 y LPCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸90s，進行35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。即以金黃節(jié)桿菌Cl rtAroAacterSK8. OOl為出發(fā)菌株，PCR法獲得目的基因i/纟，其含有1233 bp，編碼有410個氨基酸的序列，核苷酸序列為SEQ ID NO :1。實施例2重組載體pPIC9K_IFTase的構(gòu)建
I、構(gòu)建pPIC9K-IFTase重組載體將實施例I的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后進行DNA回收，對回收產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和I進行雙酶切，與經(jīng)過同樣雙酶切的質(zhì)粒pPIC9K在T4連接酶的作用下過夜連接，實現(xiàn)重組載體pPIC9K-IFTase的初步構(gòu)建。2、DH5 a感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取大腸桿菌DH5 a單菌落于LB液體培養(yǎng)基，37°C、200 rpm過夜培養(yǎng)，按3%接種量接種到新的IOOmL LB培養(yǎng)基37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)，約Ih后間斷取樣，使OD6tltl=O. 35-0. 4。培養(yǎng)物冰上冷卻lh，離心棄去上清，沉淀分別用冰預(yù)冷的IOOmM MgCl2及IOOmM CaCl2懸浮洗滌細(xì)胞，最終用85mM CaCl2 (溶于15%甘油)重懸細(xì)胞，分裝獲得DH5a感受態(tài)細(xì)胞，_80°C冷凍保存?zhèn)溆谩?、重組載體pPIC9K- IFTase轉(zhuǎn)化至DH5 a中將過夜連接后的重組載體pPIC9K_IFTase轉(zhuǎn)化入DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有50 U g/ mL氨芐霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)18-24h初步獲得陽性克隆。4、重組載體的雙酶切驗證經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選得到陽性克隆分別挑取初步陽性克隆于含有50 U g/mL氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、200 rpm培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶I和I雙酶切質(zhì)粒，根據(jù)電泳后的雙酶切結(jié)果初步判斷陽性克隆。5、對初步獲得的重組載體pPIC9K-IFTase進行基因測序，結(jié)果表明pPC9K插入片段為一個含有1233 bp，編碼有410個氨基酸的序列，成功構(gòu)建重組載體pPIC9K-IFTase，其含有10503 bp，核苷酸序列為SEQ ID NO :2。實施例3菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶畢赤酵母重組菌篩選
I、畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞的制備挑取GSl 15酵母單菌落于YH)液體培養(yǎng)基30°C、200 rpm過夜培養(yǎng)，按1%接種量擴大培養(yǎng)至0D_=1. 3-1. 5，分別用冰預(yù)冷的滅菌水及IM山梨醇溶液洗滌，最終以IM山梨醇分裝獲得畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。2、重組載體pPIC9K_IFTase電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞將pPIC9K-IFTase質(zhì)粒經(jīng)I線性化后電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞(電轉(zhuǎn)化條件電壓1500 V，電容25 U F，電阻200歐，轉(zhuǎn)化時間4-10 msec)，涂布于MD平板，30°C培養(yǎng)2d至出現(xiàn)單菌落，以His缺陷型進行初步篩選可能的陽性重組菌。3、G418梯度抗性重組菌篩選將MD平板培養(yǎng)獲得的可能陽性重組菌點接種于G418 10個濃度梯度的YH)平板獲得不同拷貝數(shù)的pPIC9K-IFTase畢赤酵母重組菌，每個遺傳霉素濃度為 0,0. 25,0. 5,0. 75,1. 0,1. 5,1. 75,2. 0,3. 0,4. O mg/mL，30°C培養(yǎng) 2d 至出現(xiàn)
單菌落。4、菌落PCR法鑒定重組酵母將經(jīng)過G418抗性篩選的假定重組菌經(jīng)過Lyticase酶消化、_20°C冷凍及室溫化凍，菌體上清作為待PCR鑒定重組菌的模板，以通用引物5’AOX和3’ AOX為上下游引物進行菌落PCR，結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得陽性菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶畢赤酵母重組菌。
PCR 鑒定體系(20 ii L)
ddHa0|8ti L '
模士_I- 2u L
50 u M5’AOX 上游引物 ~07T7l50 Ii M3’AOX 下游引物一 0. 4ti L :
PremixTaiy 酶IOyL
PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min ;94°C變性Imin，53°C退火Imin，72°C延伸90s，進行35
個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。

實施例4重組菌的誘導(dǎo)表達及活性檢測
將實施例3獲得的重組菌單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基30°C、280 rpm培養(yǎng)至0D_=2_6，離心收集菌體用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體使0D_=1左右，雙層紗布封口 30°C、280 rpm搖瓶發(fā)酵，每24h向培養(yǎng)基添加100%甲醇至終濃度為0. 5%-1. 0%。不同時間收集菌體，進行SDS-PAGE鑒定蛋白及HPLC法酶活性測定。在未實行培養(yǎng)條件優(yōu)化及合適拷貝篩選條件下，獲得的4mg/mL G418-YPD陽性重組菌株發(fā)酵液粗酶活60h為10. 3U/mL。菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶活力定義在60°C、pH5. 5條件下每分鐘產(chǎn)1.0 PM雙果糖酐III所需的酶量為I個酶活力單位(U)。
權(quán)利要求
1.一種利用酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于步驟為 (1)以金黃節(jié)桿菌ClrtAroAacteraurescens)SW,. 001為出發(fā)菌株,PCR法獲得菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因，通過雙酶切構(gòu)建重組載體X-IFTase ； 所述重組載體 X-IFTase 為pPIC9K - IFTase、pPIC9 - IFTase、pPICZaA/B/C-IFTase 或 pGAPZaA/B/C - IFTase ； (2)將重組載體X-IFTase經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，并篩選鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，即構(gòu)建得到產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酵母工程菌； 所述畢赤酵母菌株是GS115、X-33、KM71或SMD1168 ； (3)工程菌液體發(fā)酵生產(chǎn)活性菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶 將菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酵母工程菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達，發(fā)酵上清液與菊糖進行反應(yīng)HPLC法 檢測雙果糖酐III生成情況以進行菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶活性鑒定，表明獲得的酵母工程菌具有分泌生產(chǎn)具有活性的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的能力； 重組菌單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基28-30°C、280 rpm培養(yǎng)至0D_=2_6，離心收集菌體用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體控制使0D_=1，雙層紗布封口 30°C、280 rpm搖瓶發(fā)酵，每24h向培養(yǎng)基添加100%甲醇至終濃度為0. 5%-1. 0% ； 獲得的4 mg/mL G418-YPD陽性重組菌株60h發(fā)酵液產(chǎn)活性菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶粗酶活為10.3U/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因為菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶全基因或根據(jù)酵母密碼子偏好性改造的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述重組載體線性化利用SacI或Sal I進行酶切。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株細(xì)胞的方法采用電擊轉(zhuǎn)化或化學(xué)轉(zhuǎn)化。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述工程菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基是BMGY/BMMY、BMG/BMM 或 YPD。
全文摘要
利用酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明步驟包括(1)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶基因(ift)的克隆，通過雙酶切構(gòu)建重組載體X-IFTase；(2)重組載體X-IFTase轉(zhuǎn)化入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞，營養(yǎng)缺陷型篩選及抗生素抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子，即得產(chǎn)菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶酵母工程菌；(3)工程菌液體發(fā)酵分泌生產(chǎn)活性菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶。本發(fā)明實現(xiàn)了菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶的酵母分泌表達，獲得具有活性的菊糖果糖轉(zhuǎn)移酶，對于新型功能性甜味劑雙果糖酐III的酶法工業(yè)化生產(chǎn)具有廣泛的應(yīng)用前景和意義。
文檔編號C12N9/10GK102653739SQ201210187069
公開日2012年9月5日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者戰(zhàn)榮榮, 江波, 沐萬孟 申請人:江南大學(xué)