專利名稱：用酶從甜菊苷中制備甜菊醇的方法
用酶從甜菊苷中制備甜菊醇的方法發(fā)明概沭本發(fā)明涉及一種通過(guò)使用含有果膠酶的可商購(gòu)的酶混合物CYTOLASE PCL5 使糖苷殘基從甜菊苷中裂解而生產(chǎn)甜菊醇的方法。在一些優(yōu)選的方法中，反應(yīng)在酵母的存在下進(jìn)行。
背景技術(shù)：
Stevia rebaudiana (甜葉菊)含有甜味化合物，即甜菊苷(stevioside)和萊荀迪苷A(rebaudioside A),它們主要被用作無(wú)卡路里的甜味劑。甜菊醇(steviol)是這些化合物的苷元衍生物。甜菊醇可用于改善認(rèn)知功能；參見(jiàn)例如WO 2009/071277 (DSM IP ASSETS,B. V.)。 從甜菊苷中生產(chǎn)甜菊醇很困難。甜菊苷的酸水解很麻煩，因?yàn)樵谒嵝詶l件下，所制的甜菊醇重排變?yōu)楫愄鹁沾?。甚至已有多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)不能通過(guò)這種方法得到甜菊醇(Kohda等 1976 Phytochemistry 15 :981-983.)。Ogawa等1980 ；Tetrahedron 36 :2641-2648描述了一種使用高碘酸鈉使甜菊苷裂解來(lái)生產(chǎn)甜菊醇的替代方法。然而，該方法需要高度稀釋的體系和大量過(guò)量(約> IOmol當(dāng)量)的昂貴的高碘酸鈉來(lái)實(shí)現(xiàn)有用的產(chǎn)率。因此，對(duì)于生產(chǎn)大量甜菊醇來(lái)說(shuō)，該方法不經(jīng)濟(jì)。下列文獻(xiàn)描述了幾種基于酶的方法Bridel 等 1931 Bull. Soc. Chimie Biol. 13 :781-96 指出，甜菊苷不能通過(guò)多種“發(fā)酵產(chǎn)物”(例如苦杏仁酶、鼠李糖化酶、AspergiIIus niger (黑曲霉)或浸軟和風(fēng)干底層的發(fā)酵酵母)來(lái)水解。作者利用來(lái)自蝸牛(Helix pomatia)的淀粉酶制劑獲得了成功。然而，他們從每只動(dòng)物中得到“僅O. 5cm3的純的消化液”，因而不適合大規(guī)模生產(chǎn)。Mosettig等1955 J. Org. Chem. 20 =884-899也通過(guò)利用蝸牛的酶制劑(被稱為“酶汁”和“干制劑”)使用葡糖苷的酶促水解來(lái)制備少量(小于O. 5克)的甜菊醇。沒(méi)有給出酶的進(jìn)一步特征。Khoda等在前述文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)了其他作者利用粗制的橘皮苷酶從甜菊苷中產(chǎn)生甜菊醇，但重復(fù)該方法時(shí)，得到萊苞迪苷B和葡萄糖，而不是期望的甜菊醇。Ruddat 等 1965 Arch.Biochem. Biophys. 110 :496-499 ；Gianfagna 等 1983Phytochemistry 22(2) :427-430 ；以及 Pezzuto 等 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 2475-2482均描述了使用多種可商購(gòu)的果膠酶(分別為來(lái)自Rohm & Haas的"Pectinol59L";來(lái)自 Corning Biosystems 的"Pectinol 50L";來(lái)自 Rohm & Haas 的"PectinolAC")的過(guò)程。Davis 等，1992 Phytopathology 82 :1244-50 報(bào)導(dǎo)了，" Pectinol 59L"不再是可商購(gòu)的，并且不清楚其他果膠酶是否仍有售。需要一種從甜菊苷中生產(chǎn)甜菊醇的有效方法,并且該方法適于商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)
發(fā)明內(nèi)容
業(yè)已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的可商購(gòu)的酶制劑(CYTOLASE PCL5 )能使甜菊苷裂解以產(chǎn)生甜菊醇，并且可以被用在高效的、商業(yè)上可行的方法中。因而，本發(fā)明的一個(gè)方面是一種生產(chǎn)甜菊醇的方法，該方法包括a)使甜菊苷與CYTOLASE PCL5 酶制劑接觸，并且b)回收甜菊醇。同樣業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在裂解期間釋放的糖(葡萄糖)可抑制上述酶促反應(yīng)。因此，優(yōu)選地，上述反應(yīng)在酵母的存在下進(jìn)行。酵母可以除去所產(chǎn)生的葡萄糖，從而使酶促反應(yīng)可以不受阻礙地進(jìn)行。因此，本發(fā)明的另一方面是一種生產(chǎn)甜菊醇的方法，該方法包括a)在活酵母培養(yǎng)物的存在下，使甜菊苷與CYTOLASE PCL5 酶制劑接觸，并且b)回收甜菊醇。


在整篇說(shuō)明書(shū)中，化合物名稱后面出現(xiàn)的數(shù)字指的是下列圖中所描述的化合物。圖I顯示了萊苞迪苷A和甜菊苷的水解。圖2顯示了通過(guò)Helix pomatia酶和果膠酶使甜菊苷水解。" CYTOLASE PCL5"是可商購(gòu)自DSM Food Specialties,Delft,The Netherlands的酶制劑。其為從選定的Aspergillus niger的GRAS株中得到的酶的混合物,包括果膠酶和半纖維素酶。其通常被用于生產(chǎn)具有低含量半乳糖醛酸的果汁和用于使水果汁制品澄清，也有其他用途的報(bào)導(dǎo) 其β -D-葡萄糖苷酶活性可用于制造葡萄酒和香檳(參見(jiàn)W01998/38316) 其β -吡喃葡萄糖苷酶和α -鼠李糖苷酶活性可用于水解類固醇糖苷以生產(chǎn)去葡萄糖去鼠李糖假葉樹(shù)素(desglucodesrhamnoruscin,見(jiàn) US 6,911,325)。"酵母"指的是 Saccharomyces cerevisceae、Saccharomyces pastorianus、或可以使用已知的技術(shù)用于大規(guī)模發(fā)酵的其他酵母菌種，前提是該酵母能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇。該反應(yīng)所用的甜菊苷起始物料不需要以提純或分離的形式存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，它們以包含甜菊苷的植物提取物的形式存在，例如Stevia sp.提取物，更優(yōu)選地以Stevia rebaudiana提取物的形式存在。提取物中也可能存在不可裂解的甜菊苷組分。優(yōu)選的Stevia提取物包含較高濃度的甜菊苷和較低濃度的不可裂解的甜菊苷(例如萊苞迪苷A)，其隨反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)程積聚，使得該方法不太高效。提取物中甜菊苷的優(yōu)選濃度為占所有甜菊苷的至少50%，優(yōu)選> 90重量％。高含量的甜菊苷可以很容易地購(gòu)買到。不完全清楚的是哪種酶適合介導(dǎo)使糖從甜菊苷中裂解以生產(chǎn)甜菊醇的反應(yīng)。例如，一些果膠酶適合，但其他的不適合；類似的，一些β -葡糖苷酸酶適合，而其他的不適合。因此，研究了多種酶和酶混合物以確定其適用性。在多個(gè)所測(cè)的樣品中，一些沒(méi)有產(chǎn)生反應(yīng)，甚至在培育4天之后。通過(guò)下列酶獲得至少部分成功來(lái)自Helix pomatia 的 β -葡聚糖酶(FLUKA 49103)；來(lái)自Helix pomatia 的 H-3 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA G8885)；來(lái)自Helix pomatia 的 H-2 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA G0876)；來(lái)自Helix pomatia 的 HP-2 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA 7017)；
來(lái)自Aspergillus niger 的果膠酶(SIGMA PS4716)；來(lái)自Aspergillus aculeatus 的果膠酶(SIGMA P2611)；來(lái)自Helix pomatia 的 H-1 型硫酸酯酶(SIGMA S9626)；CYTOLASE PCL5 (DSM)在多種酶中，發(fā)現(xiàn)CYTOLASE PCL5 具有良好的活性并且是可商購(gòu)的，因而是本發(fā)明優(yōu)選的酶。此外，注意到，該酶是通過(guò)裂解的葡萄糖的產(chǎn)生進(jìn)行反饋抑制的，而不被甜菊醇(其不是可水溶的)抑制。因此，盡管可以在其他反應(yīng)物不存在的情況下通過(guò)用甜菊苷培育CYTOLASE PCL5 小規(guī)模生產(chǎn)甜菊醇，但對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，由于葡萄糖的累積，這不是最優(yōu)選的方法。
然而，根據(jù)本發(fā)明業(yè)已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)酵母在最高40°C下發(fā)酵，直到葡萄糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，幾乎能使酶活性恢復(fù)到最初的活性。該方法可以擴(kuò)大至適合大規(guī)模生產(chǎn)甜菊醇的工業(yè)水平，這是迄今為止都不可能的。因此，本發(fā)明的另一方面是用于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)甜菊醇的方法，該方法包括在酵母發(fā)酵的條件下，使甜菊苷或萊苞迪苷與CYTOLASE PCL5⑧接觸，然后回收所產(chǎn)生的甜菊醇。如果需要，在發(fā)酵步驟之后，剩余甜菊苷(例如存在于Stevia提取物中)的任選的進(jìn)一步酶促水解可用于增大甜菊醇的量。因?yàn)樵撁钢苿┰谳^高的溫度下比酵母培養(yǎng)物穩(wěn)定，所以酶促水解可以在比用于培養(yǎng)酵母的溫度更高的溫度下進(jìn)行。例如，該溫度可以高于400C，優(yōu)選為約40-60°C，更優(yōu)選為約55°C。底物對(duì)酶的潛在抑制可以通過(guò)連續(xù)加入Stevia提取物而避免，因而保持甜菊苷的濃度在較低的水平。因此，本發(fā)明的另一方面是—種用于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)甜菊醇的方法,該方法包括a)在發(fā)酵的條件下，為甜菊苷和CYTOLASE PCL5 提供酵母培養(yǎng)物，以產(chǎn)生包含甜菊醇的培養(yǎng)基；并且b)在培養(yǎng)基中、在升高的溫度條件下水解至少部分剩余的甜菊苷，以產(chǎn)生富含甜
菊醇的培養(yǎng)基。富含甜菊醇的培養(yǎng)基可以原樣使用，或者任選地，可以分離出甜菊醇并提純(如果需要的話)。Stevia提取物的水解和葡萄糖的發(fā)酵可以同時(shí)進(jìn)行，但由于酵母的tmax = 40°C,在40°C下總的水解速率比按順序的水解和發(fā)酵時(shí)的速率低。酶的組合根據(jù)本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，CYTOLASE PCL5 (或來(lái)自Aspergillus niger的果膠酶(SIGMA PS4716)或來(lái)自 Aspergillus aculeatus 的果膠酶(SIGMA P2611))與選自由下列酶組成的組中的第二酶制劑組合來(lái)自Helix pomatia 的 H-3 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA G8885)；來(lái)自Helix pomatia 的 H-2 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA G0876)；來(lái)自Helix pomatia 的 HP-2 型 β -葡糖苷酸酶(SIGMA 7017)；來(lái)自Helix pomatia 的 H-1 型硫酸酯酶(SIGMA S9626)；與使用單一的酶制劑相比，該組合可以更有效地使甜菊苷水解。如圖2所示，來(lái)自Helix pomatia(葡萄園蝸牛)的酶使甜菊苷⑴快速裂解為甜茶苷(5)，然后進(jìn)一步緩慢裂解為甜菊單苷(6)和甜菊醇葡糖苷酯(7)的混合物，隨后緩慢裂解為最終的甜菊醇(3)。不論酶主要包含硫酸酯酶還是葡糖苷酸酶活性，均觀察到這種模式。活性的果膠酶和Cytolase使甜菊苷(I)緩慢裂解為甜茶苷(5)，然后較快速地水解為6/7，最終裂解為甜菊醇(3)。CYTOLASE PCL5 和活性的果膠酶通過(guò)類似的活性使甜菊苷(I)裂解為甜菊醇。CYTOLASE PCL5 被用于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，因?yàn)檫@種酶可用于食品生產(chǎn)并且易于從DSM得到。發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用一種酶相比，來(lái)自Helix pomatia的酶與果膠酶或CYTOLASEPCL5 的混合物使甜菊苷更快地裂解并且需要更少量的酶。Helix pomatia酶使第一水解步驟裂解地更快。果膠酶和CYTOLASE PCL5 使后面的水解步驟更快地進(jìn)行。因此，本發(fā)明的另一方面是一種特別優(yōu)選的酶組合，其為CYTOLASE PCL5 和來(lái)自 Helix pomatia 的葡糖苷酸酶 HP2 Sigma G701 7;以及CYTOLASE PCL5 和來(lái)自 Helix pomatia 的 H-2 型葡糖苷酸酶 SIGMA G0876。下面所描述的實(shí)施例能更好地說(shuō)明本發(fā)明。評(píng)估各種酶和酶制劑(被統(tǒng)稱為"酶")使甜菊苷和萊苞迪苷A裂解以生產(chǎn)甜菊醇的能力。50mg Stevia提取物RV140-54(19%萊苞迪苷A，19%甜菊苷[w% ])在5ml pH為4. I的緩沖溶液(O. lmol/1 H3P04+Na0H)中溶解，50 μ I酶溶液或IOmg凍干粉；40°C (remI)。結(jié)果顯示在下面的表I中。表I酶的評(píng)估
酶/來(lái)源甜菊醇的形成
纖維素酶OnozukaR-IO4d無(wú)反應(yīng)
Merck 102321
纖維素酶A:spergillus niger4d無(wú)反應(yīng)
FLUKA 22178
β-葡聚糖酶來(lái)自Helix pomatia 7d少量形成 FLUKA 49103β-葡萄糖苷酶來(lái)自杏仁FLUKA4d無(wú)反應(yīng) 49290
β-葡萄糖昔酶m'ger 4d無(wú)反應(yīng) FLUKA 49291
οι-葡萄糖苷酶V型來(lái)自大米 4d無(wú)反應(yīng) SIGMA G9259
β-葡糖苷酸酶Η-3型Helix4d完全形成
pomatia SIGMA G888權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)甜菊醇的方法，其包括使甜菊苷與CYTOLASE PCL5 酶制劑接觸，并且回收甜菊醇。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述甜菊苷存在于植物提取物中。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述植物提取物是Steviasp.提取物。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述Stevia提取物包含大量甜菊苷。
5.如權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述使甜菊苷與CYTOLASEPCL5⑧酶制劑接觸的步驟在培養(yǎng)基中活酵母培養(yǎng)物的存在下、在能在培養(yǎng)基中產(chǎn)生甜菊醇的條件下進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括在升高的溫度條件下在培養(yǎng)基中使至少部分剩余的甜菊苷水解，以產(chǎn)生富含甜菊醇的培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述CYTOLASEPCL5 酶制劑還包含來(lái)自Aspergillus sp.的果膠酶。
8.一種酶制劑，其選自由下列組成的組 a)CYTOLASE PCL5 和來(lái)自 Helix pomatia 的葡糖苷酸酶 HP2 Sigma G7017 ； b)CYTOLASE PCL5 和來(lái)自 Helix pomatia 的 H_2 型葡糖苷酸酶 SIGMA G0876 ;以及 c)來(lái)自Helixpomatia 的酶與果膠酶或 CYTOLASE PCL5 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過(guò)使用含有果膠酶的可商購(gòu)的酶混合物CYTOLASE PCL5使糖苷殘基從甜菊苷中裂解而生產(chǎn)甜菊醇的方法。在一些優(yōu)選的方法中，反應(yīng)在酵母培養(yǎng)物的存在下進(jìn)行。還描述了Helix pomatia酶與CYTOLASE PCL5的組合。
文檔編號(hào)C12P15/00GK102712940SQ201180006633
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日
發(fā)明者克利斯托弗·維瑞里 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司