專利名稱：磁性納米粘土載體固定化酶及其再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及磁性納米粘土載體固定化酶及其再生的方法。
背景技術(shù)：
固定化酶允許酶的重復(fù)或是連續(xù)使用，易于底物和產(chǎn)物的回收、易于純化，在一定、程度上改進(jìn)了生物催化劑的性能。近年來，納米材料如納米粘土作為固定化酶的載體引起了人們很大的關(guān)注，原因在于其成本低、粒徑小，且具有獨(dú)特的插層性質(zhì)；另外ー個(gè)重要原因是粘土表面的硅羥基經(jīng)過不同官能團(tuán)活化后，可作為生物大分子的附著位點(diǎn)。然而，在這些研究中存在的最大問題就是固定化酶完成催化反應(yīng)后載體很難被分離，而磁性材料的多相催化可以滿足生物催化劑的高效分離和催化過程的持續(xù)進(jìn)行，因此，磁性納米材料改性的粘土有望成為固定化酶的優(yōu)良載體材料。已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道過磁性氧化鐵/粘土納米復(fù)合材料,然而，以往的這些研究結(jié)果顯示，磁性納米顆粒往往被固定在粘土表面，那么作為固定化酶附著位點(diǎn)的硅羥基便可能會(huì)被掩蓋，這就限制了磁性納米粘土材料在固定化酶領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，所制備這些磁性納米材料的磁強(qiáng)度也非常低，不易分離，這也大大限制了其應(yīng)用。就酶固定化而言，在吸附、交聯(lián)、包埋和共價(jià)偶聯(lián)四種主要的載體固定化酶方法中，除吸附法外其它三種方法所制備的固定化酶，其載體都不能再生，隨著酶的失活而被丟棄，這就造成了環(huán)境污染、資源浪費(fèi)以及生產(chǎn)成本増加。雖然傳統(tǒng)的吸附法所制備的固定化酶其載體可以再生，但載體與酶結(jié)合不牢固、酶的損失比較嚴(yán)重，這也就限制了它的應(yīng)用。因此，設(shè)計(jì)、開發(fā)和制備可再生的載體材料就成為本課題的研究重點(diǎn)之一，目前有關(guān)這方面的工作罕有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供ー種磁性納米粒子對(duì)粘土表面影響較小的磁性納米粘土載體固定化酶。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供該磁性納米粘土載體固定化酶的制備方法。本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供該磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法。為解決上述問題，本發(fā)明所述的磁性納米粘土載體固定化酶，包括固定對(duì)象為糖化酶和相應(yīng)固定化酶的載體，并以共價(jià)偶聯(lián)法為固定化方法制成，其特征在于所述載體為磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料,該磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成，且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。所述磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料是指首先將FeCl3 · 6H20以I :2(Tl :50的料液重量體積比溶解于こニ醇中形成澄清溶液；然后將NaAc、聚こニ醇加入到所述澄清溶液中，其次將鹽酸活化的納米粘土加入到所述澄清溶液中，超聲分散I飛h，得到混合液；最后將所述混合液加入到聚四氟こ烯襯里的不銹鋼反應(yīng)釜中，維持16(T210°C反應(yīng)5 24h即得；其中所述NaAc與所述澄清溶液的重量體積比為I :7 1 18 ;所述聚こニ醇與所述澄清溶液的重量體積比為I :2(Tl :50 ;所述鹽酸活化的納米粘土與所述澄清溶液的重量體積比為I :60 1 :150。
所述鹽酸活化的納米粘土是指將納米粘土按I :2(T30的料液重量體積比放入濃度為廣3 M的HCl溶液中，在2(T40°C溫度下超聲0.5 2 h進(jìn)行活化后，經(jīng)離心分離并洗滌至上清液呈中性，再離心分離后得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)真空干燥至恒重后研磨、過3(T60Mm篩子即得。如上所述的磁性納米粘土載體固定化酶，其特征在于所述納米粘土為凹凸棒、高嶺土、蒙脫土中的任意ー種。如上所述的磁性納米粘土載體固定化酶的制備方法，包括以下步驟
⑴將磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料以I :4(Tl :80的料液重量體積比浸泡在ニ甲苯溶液中2 4h，使其充分溶脹，然后在攪拌下將Y-氨基丙基三こ氧基硅烷加入到所述ニ甲苯溶液中；在9(T130°C下油浴加熱回流，且隊(duì)保護(hù)下反應(yīng)6 15h，反應(yīng)結(jié)束后こ醇洗滌三次，經(jīng)磁分離后得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)真空干燥至恒重，得到改性的磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料，記為Fe3O4O粘土-NH2 ;其中所述Y-氨基丙基三こ氧基硅烷與所述ニ甲苯溶液的重量體積比為I :8 1 12 ；
⑵在質(zhì)量濃度為2 10%的戊ニ醛溶液中加入所述Fe3O4O粘土-NH2,于室溫下反應(yīng)2 8h ；然后進(jìn)行磁分離，得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)蒸餾水洗滌數(shù)次去除未反應(yīng)的戊ニ醛；最后用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌沉淀物，并將該沉淀物記作Fe3O4O粘土 -GA ;所述Fe3O4O粘土 -NH2與所述戊ニ醛溶液的重量體積比為I :30飛0 ；
⑶將所述Fe3O4O粘土 -GA載體按I :10 20的料液重量體積比加入到濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液中，在2(T40°C反應(yīng)2 8小時(shí)進(jìn)行酶的固定化；固定化后經(jīng)離心分離并經(jīng)濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌兩次后，即得固定化酶；
⑷所述固定化酶放置在在4°C下保存即可。如上所述的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經(jīng)數(shù)次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶；
②在所述失活的固定化酶中加入其重量5 10倍的丙酮/こ醇超聲半小吋，然后在8(Tl00°C下煮沸20 60分鐘，得到預(yù)處理的載體；所述預(yù)處理的載體用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌數(shù)次后，按I :30飛0的料液重量體積比加入到質(zhì)量濃度為2 10%的戊ニ醛溶液或環(huán)氧氯丙烷溶液中，于室溫下反應(yīng)2 8h，即得再生載體；
③所述再生載體用濃度為50mM、pH值為5.5的醋酸緩沖溶液洗滌數(shù)次后，然后加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. fO. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液，采用搖床在2(T40°C空氣浴固定化2 8 h，即完成酶的再次固定化；所述再生載體與所述糖化酶醋酸緩沖液的重量體積比為I :10 20。用下述制備方法代替所述步驟②在所述失活的固定化酶中加入其重量1(T20倍、且濃度為0. 5^10 mg/ml的Cu2+/Zn2+離子，室溫下震蕩0. 5飛h后，經(jīng)離心分離即得再生載體。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)
I、由于本發(fā)明采用溶劑熱法制備納米磁性粘土，因此，磁性納米粒子對(duì)粘土表面影響較小，且所制備的磁性納米粘土具有較高磁強(qiáng)度。2、由于本發(fā)明考慮到酶是ー種蛋白質(zhì)，其是由氨基酸組成，因此，其側(cè)鏈以及端基有大量的反應(yīng)性基團(tuán)(如氨基、羧基、巰基以及咪唑基等)，因而固定化酶失活后，以共價(jià)鍵連接的載體還可以再生，載體再生方法簡(jiǎn)單易行，并具有廣譜適用性。3、由于本發(fā)明采用溶劑熱法制備納米磁性粘土，因此，磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料相對(duì)于以往的研究而言在特定位點(diǎn)改性粘土可以減少外界材料對(duì)粘土本身性能的影響，并具有較高的磁強(qiáng)度使其易與反應(yīng)液分離。
4、由于本發(fā)明中用到的固定化酶載體具有磁性，并且考慮到酶是ー種蛋白質(zhì)，其是由氨基酸組成，其側(cè)鏈以及端基有大量的反應(yīng)性基團(tuán)(如氨基、羧基、巰基以及咪唑基等)，因此，本發(fā)明固定化酶不僅在于可以對(duì)共價(jià)鍵結(jié)合的載體進(jìn)行再生，而且在于它的易于回收和循環(huán)使用。固定化酶重復(fù)使用性能的測(cè)試方法如下磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料和再生載體固定化的糖化酶催化水解淀粉后被回收，用醋酸緩沖溶液(50 mM, pH= 5.5)洗滌三次，再次進(jìn)入新一輪的催化反應(yīng)。經(jīng)十次反應(yīng)周期完成后，磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料和再生載體固定化糖化酶的殘留活力都接近于60%。其活力的損失主要是由于使用過程中吸附到載體表面的部分酶蛋白分子脫落，以及催化過程中部分酶蛋白變性所致。顯然，將酶固定在磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料上増加了它的操作穩(wěn)定性。此外，可再生載體固定化酶優(yōu)良的可重復(fù)性進(jìn)一步證明了載體再生戰(zhàn)略的可行性。5、通過對(duì)磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料進(jìn)行透射電鏡測(cè)試(FEI Tecnai G20)，可以看出平均粒徑為150 nm的Fe3O4附著在層狀高嶺土的不同位置，歸納起來有三種不同結(jié)構(gòu)的Fe3O4O高嶺土納米復(fù)合材料，也就是說，F(xiàn)e3O4納米粒子可以固定在粘土層狀結(jié)構(gòu)的邊緣和表面，或是插入兩層之間(參見圖I)。6、通過對(duì)磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料進(jìn)行VSM測(cè)試(LAKESH0RE-7304，USA),在室溫下Fe3O4O粘土復(fù)合材料具有超順磁性的特性，由于其具有很高的磁效應(yīng)，因而對(duì)于外部磁場(chǎng)有很快的磁響應(yīng)，這也說明納米復(fù)合材料的飽和磁強(qiáng)度已經(jīng)足夠滿足固定化酶的需求。此外，可以看出純Fe3O4納米粒子的飽和磁強(qiáng)度出現(xiàn)在88. 97 emu/g。然而由于粘土的存在，F(xiàn)e3O4O高嶺土納米復(fù)合材料的磁飽和強(qiáng)度降低到38. 56 emu/g, Fe3O4OATP下降到40. 85 emu/g,這基本上與Fe3O4在納米復(fù)合材料中的比例相一致。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)ー步詳細(xì)的說明。圖I為本發(fā)明中Fe3O4O高嶺土納米復(fù)合材料的投射電鏡照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I 磁性納米粘土載體固定化酶，包括固定對(duì)象為糖化酶和相應(yīng)固定化酶的載體，并以共價(jià)偶聯(lián)法為固定化方法制成。載體為磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料，該磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成,且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。其中磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料是指首先將FeCl3 6H20以I :20的料液重量體積比(kg/L)溶解于こニ醇中形成澄清溶液；然后將NaAc、聚こニ醇加入到澄清溶液中，其次將鹽酸活化的納米粘土加入到澄清溶液中，超聲分散(40kHz) lh，得到混合液；最后將混合液加入到聚四氟こ烯襯里的不銹鋼反應(yīng)釜中，維持160°C反應(yīng)24h即得。NaAc與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :7 ;聚こニ醇與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :20 ;鹽酸活化的納米粘土與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :60。鹽酸活化的納米粘土是指將納米粘土按I :20的料液重量體積比放入濃度為I M、的HCl溶液中，在20°C溫度下超聲(40kHz)2 h進(jìn)行活化，以去除粘土表面殘留的碳和鈉離子?；罨瓿珊?，經(jīng)離心分離(4000轉(zhuǎn)/min)并用蒸餾水反復(fù)洗滌至上清液呈中性，再離心分離(4000轉(zhuǎn)/min)后得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)真空干燥(50°C，24小吋)至恒重后研磨、過30Mm篩子即得。實(shí)施例2 磁性納米粘土載體固定化酶，包括固定對(duì)象為糖化酶和相應(yīng)固定化酶的載體，并以共價(jià)偶聯(lián)法為固定化方法制成。載體為磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料，該磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成,且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。其中磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料是指首先將FeCl3 6H20以I :50的料液重量體積比(kg/L)溶解于こニ醇中形成澄清溶液；然后將NaAc、聚こニ醇加入到澄清溶液中，其次將鹽酸活化的納米粘土加入到澄清溶液中，超聲分散(40kHz) 5h，得到混合液；最后將混合液加入到聚四氟こ烯襯里的不銹鋼反應(yīng)釜中，維持210°C反應(yīng)5h即得。NaAc與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :18 ;聚こニ醇與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :50 ;鹽酸活化的納米粘土與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :150。鹽酸活化的納米粘土是指將納米粘土按I :30的料液重量體積比放入濃度為3 M的HCl溶液中，在40°C溫度下超聲(40kHz)0.5 h進(jìn)行活化，以去除粘土表面殘留的碳和鈉離子?；罨瓿珊?，經(jīng)離心分離(4000轉(zhuǎn)/min)并用蒸餾水反復(fù)洗滌至上清液呈中性，再離心分離(4000轉(zhuǎn)/min)后得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)真空干燥(50°C，24小吋)至恒重后研磨、過60Mm篩子即得。實(shí)施例3 磁性納米粘土載體固定化酶,包括固定對(duì)象為糖化酶和相應(yīng)固定化酶的載體，并以共價(jià)偶聯(lián)法為固定化方法制成。載體為磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料，該磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成,且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。其中磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料是指首先將FeCl3 6H20以I :35的料液重量體積比(kg/L)溶解于こニ醇中形成澄清溶液；然后將NaAc、聚こニ醇加入到澄清溶液中，其次將鹽酸活化的納米粘土加入到澄清溶液中，超聲分散(40kHz)3 h，得到混合液；最后將混合液加入到聚四氟こ烯襯里的不銹鋼反應(yīng)釜中，維持185°C反應(yīng)15h即得。NaAc與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :12 ;聚こニ醇與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :35 ;鹽酸活化的納米粘土與澄清溶液的重量體積比(kg/L)為I :110。鹽酸活化的納米粘土是指將納米粘土按I :26的料液重量體積比放入濃度為2 M的HCl溶液中，在30°C溫度下超聲分散(40kHz)l h進(jìn)行活化，以去除粘土表面殘留的碳和鈉離子?；罨瓿珊螅?jīng)離心分離(4000轉(zhuǎn)/min)并用蒸餾水反復(fù)洗滌至上清液呈中性，再離心分離(4000轉(zhuǎn)/min)后得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)真空干燥(40°C，48小吋)至恒重后研磨、過45Mm篩子即得。上述實(shí)施例廣3中的納米粘土為凹凸棒、高嶺土、蒙脫土中的任意ー種。實(shí)施例4 上述實(shí)施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的制備方法，包括以下步驟
⑴將磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料以I :40的料液重量體積比(kg/L)浸泡在ニ甲苯溶液中2h，使其充分溶脹，然后在攪拌下將Y-氨基丙基三こ氧基硅烷加入到ニ甲苯溶液中；在90°C下油浴加熱回流，且N2保護(hù)下反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后こ醇洗滌三次，經(jīng)磁鐵將其分離后得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)真空干燥(40°C，48小吋)至恒重，得到改性的磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料，記為Fe3O4O粘土 -NH2。該Fe3O4O粘土 -NH2通過Vario EL元素分析儀測(cè)出(C、H和N)元素的含量，結(jié)果得到Fe3O4O粘土和Fe3O4O凹凸棒表面接上氨基的含量分別為0. 6mmol/g 和 0.9 mmol/g。其中Y-氨基丙基三こ氧基硅烷與ニ甲苯溶液的重量體積比(kg/L)為I :8。⑵在質(zhì)量濃度為2%的戊ニ醛溶液中加入Fe3O4O粘土 -NH2,于室溫下反應(yīng)2h ;然后經(jīng)磁鐵將其分離，得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)蒸餾水洗滌數(shù)次去除未反應(yīng)的戊ニ醛；最后用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌沉淀物，并將該沉淀物記作Fe3O4O粘土 -GA。Fe3O4O粘土 -NH2與戊ニ醛溶液的重量體積比(kg/L)為I :30。⑶將Fe3O4O粘土 -GA載體按I :10的料液重量體積比(kg/L)加入到濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液中，在20°C反應(yīng)2小時(shí)進(jìn)行酶的固定化；固定化后經(jīng)磁鐵將其分離并經(jīng)濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌兩次后，即得固定化酶。反應(yīng)后的溶液和洗滌液合并，用來測(cè)定未固定的酶蛋白含量。⑷固定化酶放置在在4°C下保存即可。實(shí)施例5 上述實(shí)施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的制備方法，包括以下步驟
⑴將磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料以I :80的料液重量體積比(kg/L)浸泡在ニ甲苯溶液中4h，使其充分溶脹，然后在攪拌下將Y-氨基丙基三こ氧基硅烷加入到ニ甲苯溶液中；在130°C下油浴加熱回流，且隊(duì)保護(hù)下反應(yīng)15h，反應(yīng)結(jié)束后こ醇洗滌三次，經(jīng)磁鐵將其分離后得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)真空干燥(40°C，48小吋)至恒重，得到改性的磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料，記為Fe3O4O粘土 -NH2。該Fe3O4O粘土 -NH2通過Vario EL元素分析儀測(cè)出(C、H和N)元素的含量，結(jié)果得到Fe3O4O粘土和Fe3O4O凹凸棒表面接上氨基的含量分別為0. 8 mmol/g 和 1.2 mmol/g。其中Y-氨基丙基三こ氧基硅烷與ニ甲苯溶液的重量體積比(kg/L)為I :12。⑵在質(zhì)量濃度為10%的戊ニ醛溶液中加入Fe3O4O粘土 -NH2,于室溫下反應(yīng)8h ;然后經(jīng)磁鐵將其分離，得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)蒸餾水洗滌數(shù)次去除未反應(yīng)的戊二醛；最后用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌沉淀物，并將該沉淀物記作Fe3O4O粘土 -GA。Fe3O4O粘土 -NH2與戊ニ醛溶液的重量體積比(kg/L)為I :60。⑶將Fe3O4O粘土 -GA載體按I :20的料液重量體積比(kg/L)加入到濃度為50mM、 pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液中，在40°C反應(yīng)8小時(shí)進(jìn)行酶的固定化；固定化后經(jīng)磁鐵將其分離并經(jīng)濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌兩次后，即得固定化酶。反應(yīng)后的溶液和洗滌液合并，用來測(cè)定未固定的酶蛋白含量。
⑷固定化酶放置在在4°C下保存即可。實(shí)施例6 上述實(shí)施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的制備方法，包括以下步驟
⑴將磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料以I :60的料液重量體積比(kg/L)浸泡在ニ甲苯溶液中3h，使其充分溶脹，然后在攪拌下將Y-氨基丙基三こ氧基硅烷加入到ニ甲苯溶液中；在110°C下油浴加熱回流，且隊(duì)保護(hù)下反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后こ醇洗滌三次，經(jīng)磁鐵將其分離后得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)真空干燥(40°C，48小吋)至恒重，得到改性的磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料，記為Fe3O4O粘土 -NH2。該Fe3O4O粘土 -NH2通過Vario EL元素分析儀測(cè)出(C、H和N)元素的含量，結(jié)果得到Fe3O4O粘土和Fe3O4O凹凸棒表面接上氨基的含量分別為0. 7 mmo I /g ネロ I. I mmol/g。其中Y-氨基丙基三こ氧基硅烷與ニ甲苯溶液的重量體積比(kg/L)為I :10。⑵在質(zhì)量濃度為6%的戊ニ醛溶液中加入Fe3O4O粘土 -NH2,于室溫下反應(yīng)5h ;然后經(jīng)磁鐵將其分離，得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)蒸餾水洗滌數(shù)次去除未反應(yīng)的戊ニ醛；最后用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌沉淀物，并將該沉淀物記作Fe3O4O粘土 -GA。Fe3O4O粘土 -NH2與戊ニ醛溶液的重量體積比(kg/L)為I :40。⑶將Fe3O4O粘土 -GA載體按I :15的料液重量體積比(kg/L)加入到濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液中，在30°C反應(yīng)5小時(shí)進(jìn)行酶的固定化；固定化后經(jīng)磁鐵將其分離并經(jīng)濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌兩次后，即得固定化酶。反應(yīng)后的溶液和洗滌液合并，用來測(cè)定未固定的酶蛋白含量。⑷固定化酶放置在在4°C下保存即可。實(shí)施例7 上述實(shí)施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經(jīng)數(shù)次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量5倍的丙酮/こ醇超聲半小時(shí)，然后在80°C下煮沸60分鐘，得到預(yù)處理的載體；預(yù)處理的載體用醋酸緩沖溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數(shù)次后，按I :30的料液重量體積比(kg/L)加入到質(zhì)量濃度為2%的戊ニ醛溶液或環(huán)氧氯丙烷溶液中，于室溫下反應(yīng)2h，即得再生載體。③再生載體用醋酸緩沖溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數(shù)次后，然后加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液，采用搖床在20°C空氣浴固定化8h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩沖液的重量體積比(kg/L)為I :10。實(shí)施例8 上述實(shí)施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經(jīng)數(shù)次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量10倍的丙酮/こ醇超聲半小時(shí)，然后在100°C下煮沸20分鐘，得到預(yù)處理的載體；預(yù)處理的載體用醋酸緩沖溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數(shù)次后，按I :60的料液重量體積比(kg/L)加入到質(zhì)量濃度為10%的戊ニ醛溶液或環(huán)氧氯丙烷溶液中，于室溫下反應(yīng)8h，即得再生載體。③再生載體用醋酸緩沖溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數(shù)次后，然后加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液，采用搖床在40°C空氣浴固定化2h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩沖液的重量體積比(kg/L)為I :20。實(shí)施例9 上述實(shí)施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經(jīng)數(shù)次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量8倍的丙酮/こ醇超聲半小時(shí)，然后在90°C下煮沸40分鐘，得到預(yù)處理的載體；預(yù)處理的載體用醋酸緩沖溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數(shù)次后，按I :40的料液重量體積比(kg/L)加入到質(zhì)量濃度為6%的戊ニ醛溶液或環(huán)氧氯丙烷溶 液中，于室溫下反應(yīng)5h，即得再生載體。③再生載體用醋酸緩沖溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數(shù)次后，然后加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液，采用搖床在30°C空氣浴固定化5h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩沖液的重量體積比(kg/L)為I :15。實(shí)施例10 上述實(shí)施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經(jīng)數(shù)次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量10倍、且濃度為0. 5mg/ml的Cu2+/Zn2+離子，室溫下震蕩0. 5h后，經(jīng)離心分離(4000轉(zhuǎn)/min)即得再生載體。③再生載體用醋酸緩沖溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數(shù)次后，然后加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液，采用搖床在20°C空氣浴固定化2h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩沖液的重量體積比(kg/L)為I :10。實(shí)施例11 上述實(shí)施例f 3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經(jīng)數(shù)次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量20倍、且濃度為10 mg/ml的Cu2+/Zn2+離子，室溫下震蕩6h后，經(jīng)離心分離(4000轉(zhuǎn)/min)即得再生載體。③再生載體用醋酸緩沖溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數(shù)次后，然后加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液，采用搖床在40°C空氣浴固定化8 h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩沖液的重量體積比(kg/L)為I :20。實(shí)施例12 上述實(shí)施例廣3的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟
①使經(jīng)數(shù)次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶。②在失活的固定化酶中加入其重量15倍、且濃度為5 mg/ml的Cu2+/Zn2+離子，室溫下震蕩3h后，經(jīng)離心分離(4000轉(zhuǎn)/min)即得再生載體。
③再生載體用醋酸緩沖溶液(50mM、pH=5. 5)洗滌數(shù)次后，然后加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液，采用搖床在30°C空氣浴固定化5h，即完成酶的再次固定化。再生載體與糖化酶醋酸緩沖液的重量體積比(kg/L)為I :15。應(yīng)該理解，這里討論的實(shí)施例和實(shí)施方案只是為了說明，對(duì)熟悉該領(lǐng)域的人可以提出各種改進(jìn)和變化 ，這些改進(jìn)和變化將包括在本申請(qǐng)的精神實(shí)質(zhì)和范圍以及所附的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.磁性納米粘土載體固定化酶，包括固定對(duì)象為糖化酶和相應(yīng)固定化酶的載體，并以共價(jià)偶聯(lián)法為固定化方法制成，其特征在于所述載體為磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料，該磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成，且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。
2.如權(quán)利要求I所述的磁性納米粘土載體固定化酶，其特征在于所述磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料是指首先將FeCl3 6H20以I :2(Tl :50的料液重量體積比溶解于こニ醇中形成澄清溶液；然后將NaAc、聚こニ醇加入到所述澄清溶液中，其次將鹽酸活化的納米粘土加入到所述澄清溶液中，超聲分散I飛h，得到混合液；最后將所述混合液加入到聚四氟こ烯襯里的不銹鋼反應(yīng)釜中，維持16(T210°C反應(yīng)5 24h即得；其中所述NaAc與所述澄清溶液的重量體積比為I :7 1 18 ;所述聚こニ醇與所述澄清溶液的重量體積比為I :2(Tl :50 ；所述鹽酸活化的納米粘土與所述澄清溶液的重量體積比為I :6(Tl :150。
3.如權(quán)利要求2所述的磁性納米粘土載體固定化酶，其特征在于所述鹽酸活化的納米粘土是指將納米粘土按I :2(T30的料液重量體積比放入濃度為廣3 M的HCl溶液中，在2(T40°C溫度下超聲0.5 2 h進(jìn)行活化后，經(jīng)離心分離并洗滌至上清液呈中性，再離心分離 后得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)真空干燥至恒重后研磨、過3(T60Mffl篩子即得。
4.如權(quán)利要求3所述的磁性納米粘土載體固定化酶，其特征在于所述納米粘土為凹凸棒、高嶺土、蒙脫土中的任意ー種。
5.如權(quán)利要求I所述的磁性納米粘土載體固定化酶的制備方法，包括以下步驟 ⑴將磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料以I :4(Tl :80的料液重量體積比浸泡在ニ甲苯溶液中2 4h，使其充分溶脹，然后在攪拌下將Y-氨基丙基三こ氧基硅烷加入到所述ニ甲苯溶液中；在9(T130°C下油浴加熱回流，且隊(duì)保護(hù)下反應(yīng)6 15h，反應(yīng)結(jié)束后こ醇洗滌三次，經(jīng)磁分離后得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)真空干燥至恒重，得到改性的磁性納米Fe3O4O粘土復(fù)合材料，記為Fe3O4O粘土-NH2 ;其中所述Y-氨基丙基三こ氧基硅烷與所述ニ甲苯溶液的重量體積比為I :8 1 12 ； ⑵在質(zhì)量濃度為2 10%的戊ニ醛溶液中加入所述Fe3O4O粘土-NH2,于室溫下反應(yīng)2 8h ；然后進(jìn)行磁分離，得到沉淀物，該沉淀物經(jīng)蒸餾水洗滌數(shù)次去除未反應(yīng)的戊ニ醛；最后用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌沉淀物，并將該沉淀物記作Fe3O4O粘土 -GA ;所述Fe3O4O粘土 -NH2與所述戊ニ醛溶液的重量體積比為I :30飛0 ； ⑶將所述Fe3O4O粘土 -GA載體按I :10 20的料液重量體積比加入到濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. ro. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液中，在2(T40°C反應(yīng)2 8小時(shí)進(jìn)行酶的固定化；固定化后經(jīng)離心分離并經(jīng)濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌兩次后，即得固定化酶； ⑷所述固定化酶放置在在4°C下保存即可。
6.如權(quán)利要求I所述的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，包括以下步驟 ①使經(jīng)數(shù)次使用后的固定化酶完全失活，得到失活的固定化酶； ②在所述失活的固定化酶中加入其重量5 10倍的丙酮/こ醇超聲半小吋，然后在.8(Tl00°C下煮沸20 60分鐘，得到預(yù)處理的載體；所述預(yù)處理的載體用濃度為50mM、pH值為.5.5的醋酸緩沖溶液洗滌數(shù)次后，按I :30飛0的料液重量體積比加入到質(zhì)量濃度為2 10%的戊ニ醛溶液或環(huán)氧氯丙烷溶液中，于室溫下反應(yīng)2 8h，即得再生載體；③所述再生載體用濃度為50mM、pH值為5. 5的醋酸緩沖溶液洗滌數(shù)次后，然后加入濃度為50mM、pH值為5. 5、糖化酶含量為0. f0. 6 mg的糖化酶醋酸緩沖液，采用搖床在2(T40°C空氣浴固定化2 8 h，即完成酶的再次固定化；所述再生載體與所述糖化酶醋酸緩沖液的重量體積比為I :10 20。
7.如權(quán)利要求6所述的磁性納米粘土載體固定化酶的再生的方法，其特征在于用下述制備方法代替權(quán)利要求6中所述步驟②在所述失活的固定化酶中加入其重量1(T20倍、且濃度為0.5 10 mg/ml的Cu2+/Zn2+離子，室溫下震蕩0. 5飛h后，經(jīng)離心分離即得再生載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種磁性納米粘土載體固定化酶，該固化酶包括固定對(duì)象為糖化酶和相應(yīng)固定化酶的載體，并以共價(jià)偶聯(lián)法為固定化方法制成，其特征在于所述載體為磁性納米Fe3O4@粘土復(fù)合材料，該磁性納米Fe3O4@粘土復(fù)合材料由磁性Fe3O4納米粒子和納米粘土材料組成，且磁性Fe3O4納米粒子有序地組裝在所述納米粘土上。本發(fā)明采用溶劑熱法制備了超順磁性的Fe3O4@粘土納米復(fù)合材料，經(jīng)γ-氨丙基三乙氧基硅烷對(duì)其進(jìn)行表面改性后，利用戊二醛作為偶聯(lián)劑將糖化酶共價(jià)固定于載體表面，并設(shè)計(jì)了兩種新穎的載體再生策略。再生載體固定化糖化酶后依然保持著固定化酶原有的活性、熱穩(wěn)定性以及可重復(fù)使用性等優(yōu)良性能。本發(fā)明還可適用于其它以共價(jià)偶聯(lián)法固定化酶載體的再生。
文檔編號(hào)C12N11/14GK102649954SQ20121015210
公開日2012年8月29日 申請(qǐng)日期2012年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月17日
發(fā)明者李彥鋒, 王建芝, 趙光輝, 金新亮 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)