專(zhuān)利名稱(chēng)：α-葡聚糖酶和工程菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明涉及蛋白純化和基因工程領(lǐng)域，更具體地，涉及一種細(xì)麗毛殼a-葡聚糖酶的純化工藝，一種細(xì)麗毛殼a-葡聚糖酶的基因克隆和基因工程菌的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
a -葡聚糖是一種由a -D吡喃葡萄糖單體通過(guò)(1_6)，(1_3)等糖苷鍵形式連接而成的多糖，多為右旋糖苷。不同類(lèi)型糖苷鍵所占比例隨不同的a-葡聚糖而變化。在醫(yī)藥工業(yè)中，分子量20KD，40KD，70KD的低聚a -葡聚糖是優(yōu)良的血漿代用品，在臨床上用于治療失血性休克等，具有增加血容量，改善微循環(huán)等作用。a -葡聚糖是許多致病鏈球菌胞外多糖的重要成分，與齲齒的發(fā)生，致病菌的粘附，能量代謝，抵抗抗菌類(lèi)藥物滲透等過(guò)程息息相關(guān)。在制糖工業(yè)中，a -葡聚糖是微生物(如腸膜明串珠菌，鏈球菌屬等)在感染甘蔗的過(guò)程中形成的。這些微生物能夠分泌葡聚糖蔗糖酶，催化蔗糖生成葡萄糖并聚合而成a-葡聚糖。在蔗汁中葡聚糖濃度可高達(dá)1%，嚴(yán)重的會(huì)生成白色的固體狀物質(zhì)(俗稱(chēng)“蔗飯”)。a-葡聚糖的存在嚴(yán)重影響從糖汁澄清到糖的精煉等一系列工藝流程。例如糖分的直接損失；虛高糖分旋光度造成物料衡算的困難，進(jìn)而影響生產(chǎn)；嚴(yán)重增加糖液的粘度致使澄清，過(guò)濾和輸送等過(guò)程困難；與蔗糖共結(jié)晶致使產(chǎn)品純度不高；糖晶異常，適用性差，無(wú)法在飲料等高端領(lǐng)域中使用等。a-葡聚糖酶是可降解a-葡聚糖成低聚葡聚糖或葡萄糖的一類(lèi)酶的總稱(chēng)。a-葡聚糖酶的應(yīng)用主要集中在生產(chǎn)藥用低聚右旋糖酐，增強(qiáng)抗菌類(lèi)藥物的療效，預(yù)防牙菌斑的形成，防止蔗糖轉(zhuǎn)化為a-葡聚糖，從而緩解a-葡聚糖在制糖過(guò)程中的負(fù)面影響等方面。a -葡聚糖酶普遍存在于微生物中，具有多種類(lèi)型和功能，部分品種已實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。其中青霉，毛殼菌等真菌來(lái)源的a-葡聚糖酶被認(rèn)為是工業(yè)適用性狀最好最高效的。諾維信，杰能科和Sankyo等公司已經(jīng)開(kāi)發(fā)了 a -葡聚糖酶酶制劑產(chǎn)品并且進(jìn)行了大量的應(yīng)用研究。為了滿(mǎn)足我國(guó)制糖行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求，實(shí)現(xiàn)制糖工藝的清潔，節(jié)能和環(huán)保，a -葡聚糖酶的研究開(kāi)發(fā)亟待進(jìn)行。基于現(xiàn)有的a -葡聚糖酶研究，毛殼菌來(lái)源的a -葡聚糖酶的應(yīng)用效果最為理想，但是在蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中一直沒(méi)有相關(guān)的序列報(bào)道。因此，獲取毛殼菌來(lái)源a-葡聚糖酶的基因或是蛋白序列，才有可能構(gòu)建基因工程菌，為該酶的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
在對(duì)a -葡聚糖酶的研究過(guò)程中，本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)細(xì)麗毛殼(chaetomiumgracile)具有很好的葡聚糖酶活性。通過(guò)蛋白純化技術(shù)，成功分離得到一種電泳純的a-葡聚糖酶。通過(guò)基因克隆技術(shù)，成功克隆到一種a-葡聚糖酶基因。測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)該a-葡聚糖酶基因尚未被NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，為一新發(fā)現(xiàn)的基因。因此，本發(fā)明的目的之一在于提供細(xì)麗毛殼來(lái)源的一種a -葡聚糖酶的分離純化方法；目的之二是提供細(xì)麗毛殼來(lái)源的一種a-葡聚糖酶的基因；目的之三是提供包括該a -葡聚糖酶的表達(dá)載體和利用該載體構(gòu)建的重組基因工程菌株。本發(fā)明蛋白純化采用的技術(shù)方案是采用Potato dextran培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)麗毛殼的產(chǎn)酶發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，收集發(fā)酵液上清，硫酸銨沉淀，透析，DEAE-sepharose fast flow陰離子交換柱層析，SDS-PAGE檢測(cè)。本發(fā)明基因克隆采用的技術(shù)方案是提取細(xì)麗毛殼的基因組，根據(jù)a-葡聚糖酶的保守序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到細(xì)麗毛殼葡聚糖酶的部分序列，再根據(jù)該序列設(shè)計(jì)數(shù)對(duì)特異性引物，應(yīng)用基因走讀技術(shù)，擴(kuò)增得到兩側(cè)序列。分析兩側(cè)序列，再設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增得到a-葡聚糖酶的完整基因序列(如SEQ ID NO: I所示，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列如SEQ IDNI:2所示)。當(dāng)然，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，本發(fā)明的a-葡聚糖酶基因還可以是編碼由序列表中SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的其他核苷酸序列；而本發(fā)明的a -葡聚糖酶不僅僅是具有序列表中SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，還可以是將序列2中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)，比如在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，如與載體編碼的氨基酸融合、不影響序列的修飾形式上的差異等情況。本發(fā)明提供的包括a -葡聚糖酶基因的核苷酸序列的表達(dá)載體是用常規(guī)方法將本發(fā)明的a-葡聚糖酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成，該載體可以是市 售的質(zhì)粒、粘粒、卩遼菌體或病毒載體等，如pUC, pBluescript (Stratagene), pET (Novagen,Inc.，Madison, ffis)，PQE (Qiagen)，pREP, pSE420 和 pLEX(Invitrogen)，但不限于這些載體。較佳的是將PCR擴(kuò)增到的a -葡聚糖酶基因產(chǎn)物和表達(dá)載體pPIC9K連接得到重組質(zhì)粒。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)化體，是將包含本發(fā)明的a-葡聚糖酶基因核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主微生物，如感受態(tài)畢赤酵母KM71或GS115中得到基因工程菌。其中，該宿主細(xì)胞可以為原核、真核微生物或昆蟲(chóng)等。較佳的是畢赤酵母，得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體為上述的基因工程菌株。本發(fā)明提供的a-葡聚糖酶重組菌株可用于a-葡聚糖的水解。在醫(yī)藥領(lǐng)域，a-葡聚糖酶可用于藥用低聚葡聚糖的生產(chǎn)；或者用來(lái)增強(qiáng)抗生素類(lèi)藥物的療效；此外，a -葡聚糖酶與腫瘤專(zhuān)一性抗體結(jié)合后還可作為與葡聚糖耦合藥物的靶標(biāo)，定向治療癌癥。在口腔疾病防治中，a-葡聚糖酶可以與氟化鈉等藥物配合使用，既減少了氟化物的毒性，又可以起到良好的抑制牙菌斑發(fā)生，預(yù)防齲齒的作用。在制糖工業(yè)中，a-葡聚糖酶可以將a -葡聚糖轉(zhuǎn)化為小分子的寡糖或是單糖，減少糖液粘度，加速沉降，縮短蒸煮時(shí)間，提高糖產(chǎn)量和質(zhì)量。這種酶法處理工藝對(duì)于實(shí)現(xiàn)制糖工業(yè)的清潔，低碳，環(huán)保具有重要意義。
具體實(shí)施例方式為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行。本申請(qǐng)所采用的蛋白質(zhì)純化技術(shù)主要有蛋白質(zhì)的柱層析分離技術(shù)等。本申請(qǐng)所采用的基因操作技術(shù)主要有基因克隆和基因的真核表達(dá)技術(shù)等。在本發(fā)明的實(shí)施例中使用的畢赤酵母Pichia patoris KM71、Pichia patorisGS115及pPIC9K載體均購(gòu)自Novagen公司，引物均由英俊(invitrogen)公司合成。本發(fā)明所指a -葡聚糖酶活測(cè)定方法以a -葡聚糖dextran 2000為底物。
本發(fā)明所指a-葡聚糖酶活測(cè)定方法的國(guó)際酶活單位的定義為在本測(cè)定條件下，每分鐘水解a -葡聚糖產(chǎn)生I U mol還原糖(以葡萄糖計(jì))所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(IU)。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，Potato dextran 培養(yǎng)基的配方如下10% potato, I % peptone, 0. I % KH2P04,
0.05% MgS04 7H20,1 % Dextran T2000, pH natural。Luria Bertani 培養(yǎng)基的配方如下I trptone,0. 5 % yeast extract, I %Nacl ；BMGY培養(yǎng)基的配方如下1*% yeast extract, 2% peptone, IOOmM K3PO4, pH 7.0，
1.34% YNB, 4X 10_5% biotin, I % glycerol ；BMMY培養(yǎng)基的配方如下1*% yeast extract, 2% peptone, IOOmM K3PO4, pH 7.0，I. 34% YNB,4X 10_5% biotin,0. 5% methanol ；YPD 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的配方如下1 yeast extraction, 2 % peptone, I %glucose ；MD 固體培養(yǎng)基配方如下1. 34 % YNB,4X10_5% biotin, 2 % glucose, I. 5 %agar o在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，酶活測(cè)定的方法如下 取15ml試管按下面的反應(yīng)順序進(jìn)行操作，在反應(yīng)過(guò)程中，從加入底物(吸取前搖勻)(4. 5)開(kāi)始，向每支試管中加入試劑的時(shí)間間隔要絕對(duì)一致，50°C水解IOmin.反應(yīng)步驟及試劑,溶液用量見(jiàn)下表
—試樣I空白
加底物1.8ml, 50°C預(yù)熱3min 加酶液200^150。。水解IOmin
加入DNS試劑3ml ~50°C水解 IOmin^
加入DNS試劑3ml加酶液200W
混合
_.沸水浴中10 min后迅速冷卻
_空白調(diào)零540nm下測(cè)定_國(guó)際酶活單位的定義在本測(cè)定條件下，每分鐘水解a -葡聚糖產(chǎn)生I ii mol還原糖(以葡萄糖計(jì))所需酶量定義為一個(gè)酶活力單位(IU)。酶活計(jì)算公式酶活=(測(cè)得光吸收在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上對(duì)應(yīng)的葡萄糖濃度umol/yl) X (反應(yīng)體積200 yl) X (稀釋倍數(shù))/ (酶量20 yl) / (反應(yīng)時(shí)間IOmin)如果酶活力單位定義為在本測(cè)定條件下，每分鐘水解a -葡聚糖產(chǎn)生I ii g還原糖(以葡萄糖計(jì))所需酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。則酶活計(jì)算公式酶活=(測(cè)得光吸收在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上對(duì)應(yīng)的葡萄糖濃度umol/ UlX 180g/mol) X (反應(yīng)體積200 yl) X (稀釋倍數(shù))/ (酶量20 yl)バ反應(yīng)時(shí)間IOmin)那么與國(guó)際單位IU的換算關(guān)系為IU = 180 X IU ( U g/ml. min)在本發(fā)明的下述實(shí)施例中使用的原始細(xì)麗毛殼購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào) CGMCC 為3. 3783。本發(fā)明的下述實(shí)施例中細(xì)麗毛殼a-葡聚糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)，基因克隆等研究的技術(shù)路線(xiàn)如圖所示，具體過(guò)程見(jiàn)下述實(shí)施例。實(shí)施例I、細(xì)麗毛殼a -葡聚糖酶的發(fā)酵和分離純化
I. I細(xì)麗毛殼a -葡聚糖酶的7L發(fā)酵罐培養(yǎng)接種細(xì)麗毛殼至固體Potato dextran培養(yǎng)基上,28°C _30°C培養(yǎng)7-10天至產(chǎn)生大量的孢子。接種孢子懸液至液體Potato dextran培養(yǎng)基中進(jìn)ー步的活化培養(yǎng)2-3天。按照10%的接種量，將活化好的種子液接種裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐，并在28°C發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵期間實(shí)時(shí)監(jiān)控發(fā)酵液的PH，溶氧，以及酶活表達(dá)等情況。3-5天產(chǎn)酶達(dá)到峰值，
停止培養(yǎng)。I. 2細(xì)麗毛殼a -葡聚糖酶的分離純化將培養(yǎng)好的發(fā)酵液在4°C，IOOOOrpm離心5min。收集上清液，加入硫酸銨至飽和度為80%，4°C靜置沉淀4-12小吋。4°C，12000rpm離心15min收集沉淀，用去離子水溶解后于透析袋中透析充分去除硫酸銨。得到的透析液用于DEAE-sepharose fast flow陰離子交換柱層析分離。收集buffer洗脫組分的活峰進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，可以得到具有活性的單條帶，蛋白純度達(dá)到90%以上。電泳檢測(cè)圖見(jiàn)附圖
I。實(shí)施例2、細(xì)麗毛殼a -葡聚糖酶基因的克降2. I、提取細(xì)麗毛殼的基因組和mRNA細(xì)麗毛殼在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上生長(zhǎng)三天，收集菌體，采用真菌核酸的快速提取方法提取基因組。DNA提取的具體步驟如下I)從培養(yǎng)皿上刮取菌體或.抽濾收獲菌體，放入研缽中，加入液氮后研磨成粉末。2)將粉末轉(zhuǎn)移至5ml的離心管中，向離心管中加入一定量的DNA抽提液(Tris-HCl (pH 7. 5)0. 2M, NaCl 0. 5M, EDTA 0. 01M, SDS 1% )，振蕩使其混合均勻。3)加入與抽提液等體積的酚+氯仿+異戊醇(體積比25 24 I)，在振蕩器上劇烈振蕩 3_6min, 7000rpm、4°C離心 5_6min。4)轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管，加入等體積的氯仿+異戊醇(體積24 : I),混勻后7000rpm, 4°C,離心 5_6min。5)將上清液轉(zhuǎn)移到一新離心管，向該離心管中加入2. 5倍體積的無(wú)水こ醇(加入IOu I 0. IM的醋酸鈉有利于DNA沉淀)，-20°C放置0.5h。取出離心管，lOOOOrpm，4°C，離心lOmin，棄上清液，60°C烘箱干燥lOmin，加入適量的雙蒸水溶解沉淀即得到DNA，于_20°C保存?zhèn)溆谩＜?xì)麗毛殼mRNA的提取和RT-PCR的操作嚴(yán)格按照Takara公司的RNA抽提試劑盒以及MLV反轉(zhuǎn)錄酶的說(shuō)明進(jìn)行。2. 2、兼并引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)真菌a-葡聚糖酶的保守序列，設(shè)計(jì)出擴(kuò)增a-葡聚糖酶基因的兩對(duì)兼并引物，兼并引物序列如下
權(quán)利要求
1.一種a-葡聚糖酶的基因，是下列核苷酸序列之一 .1)其為序列表中SEQID NO 1所不的喊基序列； .2)編碼由序列表中SEQID NO :2所不的氣基酸序列或其無(wú)義突變序列組成的蛋白質(zhì)。
2.一種a-葡聚糖酶，其是序列表中SEQ ID NO :2所示氨基酸序列或其無(wú)義突變序列組成的蛋白質(zhì)。
3.包括權(quán)利要求I所述的a-葡聚糖酶基因的核苷酸序列的表達(dá)載體。
4.一種高效表達(dá)a-葡聚糖酶的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株表達(dá)a -葡聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示或?yàn)槠錈o(wú)義突變序列。
5.如權(quán)利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，編碼所述a-葡聚糖酶的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
6.如權(quán)利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，編碼所述a-葡聚糖酶的基因位于重組質(zhì)粒上或整合在染色體上。
7.如權(quán)利要求4所述的基因工程菌株，其是將權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主微生物中得到的基因工程菌株。
8.如權(quán)利要求7所述的基因工程菌株，其特征在于，該宿主微生物為畢赤酵母GS115，得到的基因工程菌株為畢赤酵母GS115-dex。
9.如權(quán)利要求4或5所述的a-葡聚糖酶基因工程菌株可用于水解a-葡聚糖的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的a-葡聚糖酶能夠?qū)㈤L(zhǎng)鏈的a-葡聚糖降解成低聚a-葡聚糖，異麥芽糖，或是葡萄糖，從而在醫(yī)藥，口腔衛(wèi)生，制糖工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域獲得應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種全新α-葡聚糖酶的基因序列以及氨基酸序列，提供了含有其基因序列的表達(dá)載體和含有該表達(dá)載體的基因工程重組菌株，提供了從細(xì)麗毛殼中分離純化一種α-葡聚糖酶的方法。本發(fā)明提供的細(xì)麗毛殼α-葡聚糖酶基因序列是首次報(bào)道，為進(jìn)一步的研究和開(kāi)發(fā)該酶奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組菌株產(chǎn)生的α-葡聚糖酶為分泌型的胞外可溶性蛋白，簡(jiǎn)化了后續(xù)的提取和純化工藝，有利于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，填補(bǔ)我國(guó)在α-葡聚糖酶開(kāi)發(fā)方面的空白。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102703480SQ201210151938
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月10日
發(fā)明者王赟, 王風(fēng)清, 章曉慶, 趙迎春 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)魯花生物技術(shù)研究所, 寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司