專利名稱：Pcr結(jié)合核酸探針斑點雜交技術(shù)檢測病料中i型馬立克氏病病毒感染的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交技術(shù)檢測病料中I型馬立克氏病病毒感染，屬于獸醫(yī)微生物學領(lǐng)域分子生物技術(shù)。
背景技術(shù)：
目前，在規(guī)模化養(yǎng)禽業(yè)和養(yǎng)豬業(yè)，病毒的多重感染是普遍性的問題，也是臨床發(fā)病的真正原因。但是，對多種病毒的病原學檢測對養(yǎng)殖場來說是一個困難問題。這是因為，很難對多個個體的不同病料同時做不同病毒的分離培養(yǎng)?，F(xiàn)代分子生物學技術(shù)PCR和核酸探針斑點分子雜交技術(shù)有助于解決這一問題。在一切條件完美時，PCR的靈敏度非常高。但在實際應(yīng)用時，常常出現(xiàn)假陽性和假陰性問題。如，有時PCR產(chǎn)生的DNA條帶雖染大小與預(yù)期的一樣，但測序結(jié)果表明，卻是一種無關(guān)核酸。此外，由于技術(shù)性原因，PCR的可重復(fù)性也較差，特別是其靈敏度的可重復(fù)性較差，常常PCR產(chǎn)物在電泳時看不到核酸條帶。這是因為， PCR產(chǎn)物電泳時，如果加入的DNA量小于50pg，則很難看到條帶。用特異性核酸探針做斑點分子雜交，其特異性較穩(wěn)定，其檢測靈敏度可達Ipg的同源核酸。但如果病毒感染量小時， 在ι μ g病料樣品的總DNA中，特異性病毒的核酸可能不足lpg，因而也檢測不出來。如過將PCR和斑點雜交結(jié)合起來，則既能確定PCR產(chǎn)物的特異性，也能提高PCR產(chǎn)物的檢出靈敏度。但如果再結(jié)合斑點雜交，則只要Ipg就可顯現(xiàn)陽性了。而且，電泳顯示的條帶，并不代表是特異的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服PCR在實際應(yīng)用時，常常出現(xiàn)假陽性和假陰性問題；用特異性核酸探針做斑點分子雜交，但如果病毒感染量小時，在1 μ g病料樣品的總DNA中，特異性病毒的核酸可能不足lpg，因而也檢測不出來這些不足，而將PCR和斑點雜交結(jié)合起來， 則既能確定PCR產(chǎn)物的特異性，也能提高PCR產(chǎn)物的檢出靈敏度。但如果再結(jié)合斑點雜交， 則只要Ipg就可顯現(xiàn)陽性了。先將疑是病毒感染的肉雞樣品DNA用針對可疑病毒的特異性引物PCR擴增后，再對PCR的產(chǎn)物用該病毒的特異性核酸探針做斑點雜交，不僅能顯示PCR 產(chǎn)物的特異性，也大大提高了檢出率。A發(fā)明的詳細描述1本發(fā)明主要步驟(1)病料的收集及樣品DNA的制備取因患病引起不同臨床表現(xiàn)的動物、病死動物的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。按常規(guī)方法提取組織DNA，溶解于適量TE緩沖液制備成為樣品DNA。
(2)擴增樣品中可疑病毒的特異性核酸片段設(shè)計可疑病毒特異性引物(F2/R》擴增出樣品DNA可疑病毒特異性核酸片段(樣品PCR擴增的片段大小長于探針)，如

圖1所示。用于擴增樣品的引物(F2/R2)序列必須在探針標記用引物(F1/R1)序列之外，即被標記探針DNA序列之外；其擴增的產(chǎn)物長于標記探針DNA序列。(3)地高辛PCR法標記病毒核酸探針制備及特異性及敏感性的測定利用已知病毒基因組DNA克隆用于標記病毒核酸探針。設(shè)計引物(F1/R1)采用地高辛PCR法標記技術(shù)，進行地高辛標記制備探針，將純化的病毒的特異性DNA片段作為標記 DNA探針的模板，探針標記方法按以上試劑盒操作說明書進行。(4)各樣品及其相應(yīng)PCR產(chǎn)物用標記的病毒核酸探針進行斑點雜交檢測。2本發(fā)明的具體描述(以雞貧血病病毒為例)(1)病料的收集及樣品DNA的制備取疑似雞貧血病病毒(CAV)感染引起不同雞群臨床表現(xiàn)的雞、死雞的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。對組織樣品，各取0.02g研磨，加入0.5mL DNA抽提緩沖液 (IOOmmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-Cl, pH 8. 0,0. 25mmol/L EDTA，pH 8. 0,0. 5% SDS)和終濃度為100yg/mL的蛋白酶K，55°C消化過夜。次日，按常規(guī)方法(J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、t.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南第二版.科學出版社， 1996)提取組織DNA，溶解于適量TE緩沖液(加適量核糖核酸酶)中，即為樣品DNA。同時提取無特異性病原(SPF)雞相應(yīng)組織的DNA作陰性對照。(2)樣品DNA針對CAV的特異性核酸片段的擴增利用提取的樣品DNA分別用設(shè)計的一對引物CAV-vpl_F2和CAV_vpl-R2擴增出樣品DNA的特異性核酸片段(樣品1-12)，片段長度及引物序列如表1所示，樣品PCR擴增的片段大小長于探針，如圖1所示。表1 樣品PCR所用的弓丨物序列
mmmmxsmsmseimmsmsmmmsmmsmmmsss^, ' ' ι' 'rwrcwwww；.......................................................................................................................................................................................................................i ； wgwwww&gwggsggfej····;····—,aasagggfe^^
引物名稱序列片段長度(bp)
cav_w2 aggagccggtaatgaagagc
--1246
cav-i^/-r2gggcgggggttgtgaaag
wwwwscsssscssssaciwaggsgggagg gMgggagg gigggBggisgBi'i' :: 'Μ iTW^CTWWι ΜΚΜΚ ΜΚΜΦ^^ΜΦ^ ^^^^Β^κκΒΒ· ^^^^^^^淋鼎tiWWW^WW^Wm....:………W鼎》.........................................................................................................................................................................................................................！) ^ww^gg^waggsgggaggg-u—j—--Jggsgggagggg^ (3)地高辛PCR法標記病毒核酸探針1)病毒核酸探針的標記利用本發(fā)明人保存的雞貧血病毒CAV-vpl基因(李延鵬，崔治中.一株雞傳染性貧血病毒野毒株致病性及全基因組序列比較.微生物學報，2007年47卷5期)作為CAV特異性探針模板DNA用于標記CAV-vpl探針。用ft~imer5. 0軟件設(shè)計一對引物見表1 (由上海生物工程公司合成)。采用地高辛PCR法標記技術(shù)，用羅氏公司的試劑盒(PCR DIG Probe Synthesis Kit, Cat. No. 11636090910, Version December 2005)進行地高辛標記制備探針，探針標記方法按以上試劑盒操作說明書進行。
表2 =CAV病毒制備核酸探針所用的引物序列
權(quán)利要求
1.一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交檢測病料中I型馬立克氏病病毒感染的方法，其特征在于先將疑是I型馬立克氏病病毒感染的動物(已死亡動物)組織樣品DNA用針對I型馬立克氏病病毒的特異性引物PCR擴增后，再對PCR的產(chǎn)物用I型馬立克氏病病毒的特異性核酸探針做斑點雜交；檢測I型馬立克氏病病毒的探針標記的引物MDV-pp38-Fl/MDV-pp38-Rl序列為序列6/ 序列7，擴增樣品的引物MDV-vpl-F2/MDV-pp38-R2序列為序列9/序列10。
2.如權(quán)利要求1所述的一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法， 其特征在于本發(fā)明在利用PCR技術(shù)結(jié)合斑點雜交檢測樣品時，用于擴增樣品DNA的引物F2/ R2序列必須在探針標記用引物F1/R1序列之外，也就是在被標記核酸探針DNA序列之外。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交檢測病料中I型馬立克氏病病毒感染的方法。本發(fā)明將疑是I型馬立克氏病病毒感染的動物(已死亡動物)組織樣品DNA用針對I型馬立克氏病病毒的特異性引物PCR擴增后，對PCR產(chǎn)物再用該病毒特異性核酸探針做斑點雜交，不僅能顯示PCR產(chǎn)物的特異性，也大大提高了檢出率。本發(fā)明試驗結(jié)果表明，PCR結(jié)合核酸探針斑點雜交技術(shù)檢測病料中I型馬立克氏病病毒感染，可顯著提高病毒感染檢測的靈敏度和特異性。
文檔編號C12R1/93GK102559938SQ20121008155
公開日2012年7月11日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者崔治中 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學