專利名稱：楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2在催化合成苯丙素糖苷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用，尤其涉及一種楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2在催化合成苯丙素糖苷中的應(yīng)用；屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物天然成分中有一類苯環(huán)和3個直鏈碳連在一起為單位的化合物，統(tǒng)稱為苯丙素(Phenylpropanoids)。例如芥子醇、芥子醛、松柏醇、松柏醛、芥子酸、阿魏酸、咖啡酸等等。許多苯丙素的糖苷是中草藥的有效成分，在抗氧化、解肝毒、止哮喘、防腫瘤等方面有重要藥用價值。在醫(yī)藥工業(yè)或化學(xué)工業(yè)，獲得苯丙素糖苷的途徑主要有兩種從植物中提取和化學(xué)合成。由于在植物中這些天然產(chǎn)物含量很低，提取量非常有限，純度難以保證，并且提取過程復(fù)雜。如果用化學(xué)方法合成，也有過程復(fù)雜、成本高、環(huán)境污染等缺點。相比之下，生物酶法合成糖苷化合物則具有效率高、成本低、環(huán)境清潔等優(yōu)點。植物體內(nèi)有一類酶，被稱為糖基轉(zhuǎn)移酶，它們專門負(fù)責(zé)植物體眾多化合物的糖基化修飾，即催化某些化合物形成相應(yīng)的糖苷(或糖酯)。糖基化是一種普遍的生理現(xiàn)象，是植物細(xì)胞維持代謝平衡的主要機(jī)制之一，在維持植物正常生長發(fā)育、應(yīng)對環(huán)境壓力等方面具有重要的作用(Lim et al，2004 ;王軍等，2009)。到目前為止，生物界存在的糖基轉(zhuǎn)移酶按照催化的底物性質(zhì)和序列相關(guān)性可以分為94個家族。其中家族I (GTl)的酶所催化的底物是一些親脂性的小分子化合物，在其-0H、-C00H、-NH2、-SH或C-C基團(tuán)上能催化結(jié)合上一個或多個糖基(Bowles et al. 2005)。但是，針對苯丙素化合物的糖苷合成，至今還沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶。在醫(yī)藥工業(yè)、化學(xué)工業(yè)以及生物技術(shù)等領(lǐng)域，也沒有利用糖基轉(zhuǎn)移酶催化苯丙素糖苷合成的先例。楊樹是我國重要的經(jīng)濟(jì)樹種和生態(tài)防護(hù)林樹種。隨著楊樹基因組測序計劃的完成，楊樹中功能基因的克隆和功能基因組學(xué)的研究被大大推進(jìn)(尹佟明等，2010)。雖然有研究報道楊樹中存在大約800多種不同的糖基轉(zhuǎn)移酶，其中能夠催化小分子化合物糖苷形成的糖基轉(zhuǎn)移酶占多數(shù)(Geisler-Lee等，2006)，但是經(jīng)過檢索，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶在催化合成苯丙素糖苷中的應(yīng)用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
(I)本發(fā)明的目的針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2在催化合成苯丙素糖苷中的應(yīng)用。(2)實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案本發(fā)明所述的楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2在催化合成苯丙素糖苷中的應(yīng)用。其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。該糖基轉(zhuǎn)移酶是通過糖基轉(zhuǎn)移酶基因PtGT2在大腸桿菌中表達(dá)和純化后獲得的。糖基轉(zhuǎn)移酶基因PtGT2是通過RT-PCR方法從楊樹中克隆的。所述苯丙素是指芥子醇、芥子醛、松柏醇、松柏醛、芥子酸或阿魏酸。將糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2與這些苯丙素之一放于反應(yīng)管中，按實施例2中所指出的條件進(jìn)行酶促反應(yīng)，即可催化合成相應(yīng)的苯丙素糖苷。(3)本發(fā)明實施后帶來的有益效果本發(fā)明是在國內(nèi)外首次證明楊樹的糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2可以催化多種苯丙素化合物生成其糖苷物質(zhì)。本發(fā)明的公開為體外利用酶催化方法合成這些苯丙素物質(zhì)的糖苷物提供了可行的方法。用提取方法或化學(xué)合成方法獲得苯丙素糖苷物不僅效率低，而且缺乏專一性。而用糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2催化方法則可以高效、專一性的合成芥子醇、芥子醛、松柏醇、松柏醛、芥子酸或阿魏酸相對應(yīng)的的糖苷(見附圖I至附圖7)。本發(fā)明實施后將為苯丙素糖苷合成工業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益。


圖I.純化的融合蛋白GST-PtGT2用SDS-PAGE檢測。其中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；序號I泳道為GST標(biāo)簽蛋白，作為對照；序號2泳道為純化的PtGT2-GST融合蛋白，其中有一條微弱的GST帶，是一種在pGEX純化系統(tǒng)中比較常見的現(xiàn)象。圖2 (A).純化后的融合蛋白GST-PtGT2催化芥子醇形成糖苷，催化產(chǎn)物用HPLC分析。其中I為紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品；2為對照組，純化的GST標(biāo)簽蛋白與芥子醇和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無糖苷合成；3為實驗組，純化的GST-PtGT2融合蛋白與芥子醇和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標(biāo)簽蛋白的對照反應(yīng)體系多出一個明顯的峰(箭頭c所指)，即合成了紫丁香苷(芥子醇-4-0-葡萄糖苷)。圖中的a為UDP-葡萄糖，b為底物芥子醇。圖2 (B).純化后的融合蛋白GST-PtGT2催化芥子醇形成糖苷，催化產(chǎn)物用LC-MS鑒定。其中表示圖A中形成的酶催化產(chǎn)物(peak c)以及標(biāo)準(zhǔn)品紫丁香苷的質(zhì)譜圖，所用分析模式為正離子模式M+23(紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品的分子量為372. 36)。圖3 (A).純化后的融合蛋白GST-PtGT2催化松柏醇形成糖苷，催化產(chǎn)物用HPLC分析。其中I為松柏香苷標(biāo)準(zhǔn)品；2為對照組，純化的GST標(biāo)簽蛋白與松柏醇和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無糖苷合成；3為實驗組，純化的GST-PtGT2融合蛋白與松柏醇和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標(biāo)簽蛋白的對照反應(yīng)體系多出一個明顯的峰(箭頭b所指)，即合成了松柏苷。圖中的a為底物松柏醇。圖3 (B).純化后的融合蛋白GST-PtGT2催化松柏醇形成糖苷，催化產(chǎn)物用用LC-MS鑒定。其中表示圖A中酶催化產(chǎn)物(peakb)以及標(biāo)準(zhǔn)品松柏苷的質(zhì)譜圖，在相同的離子化條件下，兩者具有一致的離子碎片。圖為正離子模式，母離子峰為M+23 (松柏苷標(biāo)準(zhǔn)品的分子量為342. 35)。圖4(A).純化的融合蛋白GST-PtGT2催化芥子醛形成糖苷，催化產(chǎn)物用HPLC分析。其中I為為對照組，純化的GST標(biāo)簽蛋白與芥子醛和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無糖苷合成；2為實驗組，純化的GST-PtGT2融合蛋白與芥子醛和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標(biāo)簽蛋白的對照反應(yīng)體系多出一個明顯的峰(箭頭b所指)，即合成了芥子醛-葡萄糖苷。圖中的a為底物芥子醛。 圖4 (B).純化的融合蛋白GST_PtGT2催化芥子醛形成糖苷，催化產(chǎn)物用LC-MS鑒定。其中表示圖A中產(chǎn)物峰(peak b)的質(zhì)譜圖，正離子模式下母離子峰為M+23(芥子醛-葡萄糖苷的分子量M為370. 36)。圖5.純化的融合蛋白GST_PtGT2催化松柏醛形成糖苷，催化反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC分析。其中I為為對照組，純化的GST標(biāo)簽蛋白與松柏醛和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無糖苷合成；2為實驗組，純化的GST-PtGT2融合蛋白與松柏醛和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標(biāo)簽蛋白的對照反應(yīng)體系多出一個明顯的峰(箭頭b所指)，即合成了松柏醛-葡萄糖苷。圖中的a為底物松柏醛。圖6 (A).純化的融合蛋白GST_PtGT2催化芥子酸形成糖苷，催化產(chǎn)物用HPLC分析。其中I為為對照組，純化的GST標(biāo)簽蛋白與芥子酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無糖苷合成；2為實驗組，純化的GST-PtGT2融合蛋白與芥子酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標(biāo)簽蛋白的對照反應(yīng)體系多出一個明顯的峰(箭頭b所指)，即合成了芥子酸-葡萄糖苷。圖中的a為底物芥子酸。圖6 (B).純化的融合蛋白GST_PtGT2催化芥子酸形成糖苷，催化產(chǎn)物用LC-MS鑒定。其中表示圖A中產(chǎn)物峰(peak b)質(zhì)譜圖，負(fù)離子模式下母離子峰為M-I (芥子酸-葡萄糖苷分子量M為386. 36)。圖7.純化的融合蛋白GST_PtGT2催化阿魏酸形成糖苷，催化產(chǎn)物用HPLC分析。其中I為為對照組，純化的GST標(biāo)簽蛋白與阿魏酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無糖苷合成；2為實驗組，純化的GST-PtGT2融合蛋白與阿魏酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標(biāo)簽蛋白的對照反應(yīng)體系多出一個明顯的峰(箭頭b所指)，即合成了阿魏酸-葡萄糖苷。圖中的a為底物阿魏酸。
具體實施例方式實施例I楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶基因PtGT2的克隆、原核表達(dá)與酶蛋白純化I.楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶基因PtGT2的克隆本發(fā)明涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶基因PtGT2是通過RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)從楊樹中克隆的。首先利用TRIzoI方法從毛白楊幼嫩葉片提取RNA，然后用RT-PCR方法擴(kuò)增得到該基因的編碼區(qū) cDNA。擴(kuò)增時用的一對引物是GT2-a :5’ -ATAGGATCCATGCAAAAC ACAAAACCTCA-3’ ；GT2-b :5’-ATAGAGCTC CTATGCACCTTGAGCCTTTGC-3’。RT-PCR 擴(kuò)增程序為94°C (預(yù)變性)，5min ；94°C (變性)，IOs ；55°C (退火)，15s ；72V (延伸)，2min ；35cycle ；72V (終延伸)，IOmin0回收并純化擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增獲得的目的基因PtGT2與EcoRV單酶切的中間載體pBluescript SK連接，獲得載體pBGT2，對克隆到的基因進(jìn)行測序。2. PtGT2的序列信息與特性對克隆的糖基轉(zhuǎn)移酶基因PtGT2測序后發(fā)現(xiàn)，該基因的cDNA編碼區(qū)長度為 1443bp，編碼480個氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量為52. 5KD，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。其C端有一個含44個氨基酸的PSPG盒，該盒是催化小分子化合物的糖基轉(zhuǎn)移酶共同具有的保守序列，說明克隆的基因是楊樹的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。3.楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶基因PtGT2的原核表達(dá)載體構(gòu)建在公開通用的原核表達(dá)載體PGEX-2T的基礎(chǔ)上，按照《分子克隆》(Sambrook等編著)所示的方法，對該載體進(jìn)行改造，使其多克隆位點包含BamHI和SacI。用BamHI和SacI雙酶切該表達(dá)載體，回收載體片段備用。同時用BamHI和SacI雙酶切前述載體pBGT2，回收得到目的基因片段，并將其連入上述原核表達(dá)載體中，得到楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶基因PtGT2的原核表達(dá)載體pGEX-PtGT2。4.轉(zhuǎn)化大腸桿菌、誘導(dǎo)蛋白表達(dá)及酶蛋白的純化
將上述原核表達(dá)載體pGEX_PtGT2轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XLl-Blue，PCR和酶切驗證正確后，保存菌種，此菌種用于融合蛋白(GST-PtGT2)的表達(dá)純化。在添加了氨芐青霉素(100mg/L)的2XYT液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)上述菌種，以活化該菌種。然后將過夜培養(yǎng)物按照I : 100 (過夜培養(yǎng)物新的2 X YT液體培養(yǎng)基)的比例擴(kuò)大至75ml培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl = O. 8。然后加入IPTG至O. 2mM，轉(zhuǎn)到20°C震蕩培養(yǎng)24h以誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。到時間后通過離心收集菌體。菌體加入2ml Blast Buffer (O. 5mM EDTA，750mM蔗糖，200mM Tris_HCl，PH = 8. 0)重懸,立即加入14ml稀釋的(1/2 X) Blast Buffer (事先添加2mg溶菌酶)，混勻后于冰上放置30min，離心收集菌體，用PBS (內(nèi)含O. 2mM的PMSF)重懸，冰上放置30min后IOOOOrpm離心20min，取上清。在上清中加入100 μ I的谷胱甘肽瓊脂糖珠子，按照pGEX蛋白純化手冊操作，最后用Elution Buffer (50mM Tris-HCl，IOmM還原型谷胱甘肽，PH = 8.0)洗脫目的蛋白。目的蛋白的純度用SDS-PAGE方法檢測，蛋白濃度按照Bradford試劑盒說明書中的方法進(jìn)行測定(用BSA作為蛋白標(biāo)準(zhǔn))。實施例2楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2催化苯丙素糖苷的合成I.苯丙素的酶催化反應(yīng)用純化到的楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2的融合蛋白(GST_PtGT2，能夠反映PtGT2的催化活性，屬于常用的做法)進(jìn)行體外的酶催化反應(yīng)，選取6種苯丙素化合物作為底物，包括松柏醇、芥子醇、松柏醛、芥子醛、芥子酸、阿魏酸。催化反應(yīng)中用UDP-葡萄糖作為糖的供體。酶促反應(yīng)體系如下
Tris-HCl100
(pH=7.0)mM
UDP-葡萄糖1.25
mM
苯丙素I
mM
糖基轉(zhuǎn)移酶I 2
Pg
dd H2Oup to
200μ1將以上混合好的反應(yīng)體系放于30°C恒溫水浴鍋中，反應(yīng)3小時。然后加入20 μ I濃度為240mg/ml的三氯乙酸終止反應(yīng)。將反應(yīng)管用液氮速凍后存放在_20°C，直到HPLC分析。2.酶催產(chǎn)物的HPLC鑒定用高效液相色譜(HPLC)分析以上的反應(yīng)混合體系，所用的儀器為島津LC-20AT，柱子為C18 (Ultimate, 4. 6 X 150mm, 5 μ m),工作站為Ver I. 21, 二極管陣列檢測器。流動相為乙腈和水(均含有O. 1%的三氟乙酸)，二元高壓梯度洗脫，其中有機(jī)相的比例分別為芥子醇、松柏醇為10% -25%，芥子醛、松柏醛為10% -47%，芥子酸10% -40%，阿魏酸10%-35%。洗脫時間為20min。上樣量為20μ1。 HPLC分析顯示，與對照(反應(yīng)體系中只含有純化的GST標(biāo)簽蛋白)相比，PtGT2融合蛋白對6種苯丙素化合物都能催化合成相應(yīng)的糖苷(見圖I 圖7)。3.酶催產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定對酶催化產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS鑒定，儀器為Surveyor MSQ,所用的流動相為乙腈和水(均含有O. I %的冰乙酸)，有機(jī)相梯度和洗脫時間同上述HPLC方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶促反應(yīng)生成的產(chǎn)物為各自苯丙素的糖苷物(附圖出示了其中的部分結(jié)果，見附圖2(B)、附圖3(B)、附圖4(B)、附圖6(B))。由此得出結(jié)論楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2可用于催化合成苯丙素的糖苷。
權(quán)利要求
1.楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2在催化合成苯丙素糖苷中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2的氨基酸序列如SEQID No. 2 所示。
3.如權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述苯丙素是芥子醇、芥子醛、松柏醇、松柏醛、芥子酸或阿魏酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種楊樹糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2在催化合成苯丙素糖苷中的應(yīng)用；其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述苯丙素是芥子醇、芥子醛、松柏醇、松柏醛、芥子酸或阿魏酸，將糖基轉(zhuǎn)移酶PtGT2與所述苯丙素任一種放于反應(yīng)管中進(jìn)行酶促反應(yīng)，即可催化合成相應(yīng)的苯丙素糖苷。本發(fā)明的公開為利用酶催化方法高效、專一性地合成這些苯丙素物質(zhì)的糖苷物提供了可行的方法，本發(fā)明實施后將為苯丙素糖苷合成工業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12N9/10GK102618603SQ20121008153
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月26日
發(fā)明者侯丙凱, 韓萍 申請人:山東大學(xué)