專利名稱：一種雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)O1群和O139群霍亂弧菌的非診斷性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙重TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測(cè)01群和0139群霍亂弧菌的非診斷性方法。
背景技術(shù)：
霍亂是由霍亂弧菌(Vibrio cholerae)引起的ー種古老且流行廣泛的烈性腸道傳染病，曾在世界上引起多次大流行，患者的臨床癥狀多表現(xiàn)為劇烈的嘔吐，大量米湯狀排泄，會(huì)造成迅速脫水；如治療不及時(shí)，可導(dǎo)致低血容量休克、酸中毒等，甚至死亡?；魜y弧菌由意大利解剖學(xué)家Filippo Pacini在1854年首次分離，屬于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬(Vibrio),需氧或兼性厭氧菌,革蘭氏陰性,菌體短小,稍彎曲，呈弧形或逗點(diǎn)狀，菌體尾端有鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑?；魜y弧菌有多個(gè)血清型，其中能夠引起霍亂流行的主要有兩種01群和0139群。自1817年以來(lái)，7次全球范圍的霍亂大流行均是由01群霍亂弧菌所引發(fā)；1992年印度和孟加拉國(guó)首次爆發(fā)了非01群霍亂弧菌引起的霍亂流行，目前已陸續(xù)波及亞、美、歐三大洲，構(gòu)成超越國(guó)界、洲界的大流行態(tài)勢(shì)。鑒于霍亂嚴(yán)重威脅公眾的生命安全，因此快速、準(zhǔn)確和靈敏地檢測(cè)霍亂弧菌至關(guān)重要。霍亂在我國(guó)基本得到有效控制，但發(fā)生或流行的潛在威脅依然存在。傳統(tǒng)的霍亂弧菌檢測(cè)方法需要先在堿性蛋白胨培養(yǎng)液中進(jìn)行菌株培養(yǎng)后取上層培養(yǎng)物做弧菌分離鑒定，該檢測(cè)方法所需周期長(zhǎng)、工作量大，且易受環(huán)境、培養(yǎng)條件及主觀因素影響，不利于霍亂弧菌的快速診斷。因此建立ー種快速、敏感、特異的檢測(cè)方法對(duì)霍亂防治工作具有十分重要的意義。以溶血素基因(hlyA)為探針建立的熒光定量PCR檢測(cè)01群和0139群霍亂弧菌的方法，其特異度不高，且能同時(shí)檢測(cè)出非01群和非0139群霍亂弧菌。 基于SYBR Green的雙重?zé)晒釶CR方法特異性檢測(cè)01群和0139群霍亂弧菌的方法，需借助熔解曲線來(lái)區(qū)分特異性擴(kuò)增與非特異性擴(kuò)增，這使得在待檢菌株的目的擴(kuò)增片段因出現(xiàn)堿基突變而影響產(chǎn)物熔解溫度(Tm值)時(shí)將很難通過熔解曲線進(jìn)行判斷，在01群和0139群霍亂弧菌的鑒定應(yīng)用上有一定的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性好、靈敏度高的檢測(cè)01群和0139群霍亂弧菌的雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)的非診斷性方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明ー種雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)01群和0139群霍亂弧菌的非診斷性方法，該非診斷性方法包括針對(duì)01群和0139群霍亂弧菌的O抗原合成基因rfb基因設(shè)計(jì)引物和探針
權(quán)利要求
1.一種雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)Ol群和0139群霍亂弧菌的非診斷性方法，其特征在干，該非診斷性方法包括 針對(duì)01群和0139群弧霍亂弧菌的O抗原合成基因rfb基因設(shè)計(jì)引物和探針
2.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述探針Ol-P和0139-P的5’端所標(biāo)記熒光素分別為FAM和HEX，探針3’端均連接淬滅基團(tuán)；所述該淬滅基團(tuán)為BHQl非熒光淬滅基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述該非診斷性方法包括步驟 1)提取細(xì)菌染色體DNA； 2)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)，配制一定組分濃度的20μ L PCR反應(yīng)體系，混勻后短暫離心分裝到PCR管中； 3)將待測(cè)樣品加入到反應(yīng)體系中，進(jìn)行擴(kuò)增； 4)在退火階段收集熒光信號(hào)，檢測(cè)Ct值。
4.如權(quán)利要求3所述的非診斷性方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的體系組分及其體積如下
5.如權(quán)利要求3所述的非診斷性方法，其特征在于，所述01群和0139群弧霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)品制備的具體步驟包括 1)根據(jù)所設(shè)計(jì)的01群和0139群弧霍亂弧菌引物，分別擴(kuò)增01群和0139群弧霍亂弧菌全測(cè)序菌株N16961和M045的純培養(yǎng)液DNA模板； 2)按照膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段； 3)制備01群和0139群弧霍亂弧菌rfb基因克隆子； 4)提取01群和0139群弧霍亂弧菌質(zhì)粒后進(jìn)行插入片段的限制性酶切分析，取呈陽(yáng)性的酶切反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行克隆質(zhì)粒測(cè)序?qū)嶒?yàn)； 5)01群和0139群弧霍亂弧菌質(zhì)粒DNA的濃度換算為拷貝數(shù)后，將質(zhì)粒稀釋成若干個(gè)濃度梯度備用。
6.如權(quán)利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述01群和0139群弧霍亂弧菌全測(cè)序菌株N16961和M045的純培養(yǎng)液DNA模板的擴(kuò)增條件為
7.如權(quán)利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述用膠回收純化的DNA片段制備Ol群和0139群弧霍亂弧菌rfb基因克隆子，配制的連接反應(yīng)體系為
8.如權(quán)利要求7所述的非診斷性方法，其特征在干，所述01群和0139群弧霍亂弧菌rfb克隆子制備時(shí)，用01F/01R和0139F/0139R對(duì)涂有AmplOO的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行擴(kuò)增鑒定。
9.如權(quán)利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述酶切反應(yīng)體系如下
10.如權(quán)利要求5所述的非診斷性方法，其特征在于，所述雙酶切鑒定呈陽(yáng)性的克隆質(zhì)粒上機(jī)測(cè)序，序列結(jié)果與已知目的序列進(jìn)行比對(duì)；所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的體系中對(duì)01群和 0139群弧霍亂弧菌質(zhì)粒的檢測(cè)下限均為I. OXlO2拷貝/ μ I。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙重TaqMan探針熒光RT-PCR檢測(cè)O1群和O139群霍亂弧菌的非診斷性方法，針對(duì)O1群和O139群弧霍亂弧菌的O抗原合成基因rfb基因設(shè)計(jì)引物和探針，對(duì)待檢樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，該方法對(duì)O1群和O139群霍亂弧菌的rfb基因片段非常靈敏，雙重實(shí)時(shí)PCR的檢測(cè)下限比普通PCR高了100倍，能夠達(dá)到1.0×102拷貝/μl。雙重實(shí)時(shí)PCR能夠在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)基因或者兩種不同的細(xì)菌，大大減少了實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)時(shí)間和對(duì)試劑的消耗，在實(shí)際中，尤其是疫情爆發(fā)時(shí)有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102676653SQ201210067180
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月14日
發(fā)明者周蕾, 徐寶梁, 李海山, 楊宇, 韓輝 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院