專利名稱：一種編碼過氧化氫酶的基因及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種編碼過氧化氫酶的基因及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
過氧化氫酶(CAT)是一種蛋白類清除劑，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它能促使 H2O2分解為分子氧和水而清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細胞免受H2A的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。氧自由基的清除可以分為兩步第一步是作為有害物質(zhì)的超氧陰離子在SOD的作用下和氫離子反應(yīng)，生成H2A ；第二步是H2O2在過氧化氫酶的作用下和氫離子反應(yīng)，最終將H2A降解成H2O和02。事實上，SOD、GSH、維生素E、CAT等是一個相互保護的防御群。當自由基代謝出現(xiàn)紊亂時，抗氧化酶含量降低而引起機體受損。適當補充外源性的抗氧化劑能提高機體的抗氧化能力，以免機體受到自由基的損傷。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)自由基與衰老、癌癥、肺心病、腎病等多種疾病有關(guān)，主要在幾個病理過程的啟動中起重要作用。機體主要通過去自由基酶(如S0D、CAT等)來清除體內(nèi)自由基，使機體免受自由基損傷。彭志英和蔣黎(19%)的研究表明過氧化氫酶正是能夠迅速分解H2A生成H2O和02，使超氧化物酶水解反應(yīng)順利進行，同時使H2A不至于與02_在鐵鰲合物的作用下反應(yīng)生成0H—自由基，而防止自由基的損傷。去自由基酶在健康和疾病中的作用正在被人們關(guān)注，檢測該類酶對研究自由基代謝平衡、抗衰老及腫瘤發(fā)病機理，以及急性胰腺炎、肝炎、心血管疾病、各種貧血與Zieve綜合癥等的診斷與鑒別診斷具有重要意義(Southern and Powis, 1988; Cohen, 1989)。此外，過氧化氫酶還可充當Hb和其它含巰基蛋白質(zhì)的保護劑。過氧化氫酶主要與細胞內(nèi)線粒體及過氧化物酶體結(jié)合，同D-氨基酸氧化酶等一系列需氧脫氫酶相偶聯(lián)并快速分解細胞代謝過程中產(chǎn)生的毒性物質(zhì)H2O2，從而起到解毒、保護巰基酶和膜蛋白等作用(王坤等，1989)。從發(fā)現(xiàn)至今，對過氧化氫酶的研究已愈百年，對該酶的理論與應(yīng)用研究均有一定的深度。近幾年隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的進步及需求，過氧化氫酶獲得廣泛的應(yīng)用，其主要應(yīng)用領(lǐng)域主要有①在食品工業(yè)中的應(yīng)用；②在制漿造紙和紡織印染工業(yè)中的應(yīng)用；③在醫(yī)藥中的應(yīng)用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，CAT的應(yīng)用已經(jīng)獲得進展。如含有過氧化氫酶的滴眼液和隱形眼鏡護理液可以有效的去除晶狀體內(nèi)的H2O2，有效的預(yù)防和延緩白內(nèi)障的發(fā)生；補充過氧化氫酶可以有效的抑制刺激部位平滑肌細胞的異常增殖的現(xiàn)象；近年來，過氧化氫酶開始使用在美容業(yè)中。一些面部護理中加入了該酶和過氧化氫，目的是增加表皮上層的細胞氧量。由于幾乎所有的疾病的發(fā)生和發(fā)展都與自由基的積累有關(guān)系，所以研究人員已經(jīng)在嘗試將過氧化氫酶用于動物活體細胞的功能研究，如血管上皮細胞，肌細胞，晶體細胞等，并取得了一定的進展。一些蛋白質(zhì)能以非傳統(tǒng)的內(nèi)化方式跨膜進入細胞，而且這些蛋白還能將更大的分子帶入到細胞內(nèi)部，甚至逾越血腦屏障。研究發(fā)現(xiàn)，這類蛋白都有共同特性的能介導(dǎo)蛋白跨膜轉(zhuǎn)運的結(jié)構(gòu)域——蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Protein transduction domain,PTD)0具有跨膜遞送活性的PTD蛋白核心序列(YGRKKRRQRRR)的多肽片段即被確定為TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，簡稱 PTD-TAT。PTD-TAT區(qū)段(protein transduction domain)能夠高效地將多種不同結(jié)合形式的大分子顆粒帶進體外培養(yǎng)的細胞，并不會導(dǎo)致攜帶物生物學活性的喪失。CAT現(xiàn)已經(jīng)成為一種療效廣泛的藥用酶，但仍有一些缺陷，如天然酶分子量大且難透過細胞膜、穩(wěn)定性較差、體內(nèi)半衰期短、且具有免疫原性、功能相對單一等，使其在臨床上的應(yīng)用仍有一定的困難，從而限制了其應(yīng)用。對于CAT-TAT融合蛋白研究有利于進一步拓寬其應(yīng)用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種編碼過氧化氫酶的基因及其制備方法和應(yīng)用。通過使用該基因表達得到了 CAT-TAT蛋白，實現(xiàn)CAT-TAT的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化，獲得具有良好穩(wěn)定性的CAT-TAT產(chǎn)品，用于提高細胞內(nèi)的過氧化氫酶活性。本發(fā)明首先提供了一種編碼過氧化氫酶的基因，該基因的核苷酸序列如SEQ NO. 1 所示。其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。其次提供了一種載體，包含所述的編碼過氧化氫酶的基因。還提供了一種細胞，包含上述的載體。所述細胞為大腸桿菌細胞或酵母細胞。本發(fā)明另外提供了一種編碼過氧化氫酶的基因的制備方法，包括以下步驟從人肝臟細胞中分離提取總RNAJf mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行PCR擴增，根據(jù)NCBI發(fā)表的人 CAT基因序列設(shè)計引物Pl和P2，分別含有MfeI和Viz^III酶切位點，用于大腸桿菌質(zhì)粒的構(gòu)建；或設(shè)計引物P3和P4分別含有和I酶切位點，用于酵母質(zhì)粒的構(gòu)建；其中引物P2或P4含有編碼蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT的9個氨基酸RKKRRQRRR的基因序列；擴增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，并回收凝膠中的目標基因；制備好的雙鏈cDNA進行亞克隆將所得目的基因進行DNA序列測定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，得到CAT-TAT基因。所述引物Pl、P2、P3、P4 的序列如 SEQ NO. 3, SEQ NO. 4, SEQ NO. 5, SEQ NO. 6 所不。本發(fā)明還提供了所述編碼過氧化氫酶的基因的應(yīng)用，所述基因分泌的CAT-TAT蛋白能以體外給藥的方式提高細胞內(nèi)的過氧化氫酶活力。本發(fā)明詳述如下
本發(fā)明涉及從人肝臟細胞中克隆的CAT基因。本發(fā)明涉及從人肝臟細胞中克隆的CAT-TAT的編碼序列。實施方式之一，本發(fā)明提取人肝臟細胞L-02的總RNA，通過RT-PCR和PCR的方法克隆到編碼CAT的全長序列以及CAT-TAT融合基因。實施方式之一中，所述編碼序列包含如SEQ NO. 1所示的核酸序列， 稱之為CAT-TAT。實施方式之一中，所述編碼序列是SEQ NO. 1中的核苷酸1至1608bp所示的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及包含所述CAT-TAT編碼序列的重組載體，例如由各種本領(lǐng)域常用的表達載體制備的重組載體，其中，所述編碼序列不包含其來源微生物的內(nèi)源性信號肽序列。實施方式之一中，將不帶內(nèi)源性信號肽編碼序列的本發(fā)明CAT-TAT編碼序列經(jīng)MfeI和 Λ /7 /ΙΙΙ雙酶切后與MfeI和歷/^ III雙酶切的pET21a(+)載體連接，得到大腸重組表達載 pET21a(+)-CAT-TAT0另一實施方式中，將不帶內(nèi)源性信號肽編碼序列的本發(fā)明CAT-TAT編碼序列經(jīng)機和Not\雙酶切后與Sft^I和Afoi I雙酶切的pPICTk載體連接，得到酵母重組表達載體pPIC9k-CAT-TAT。本發(fā)明還制備包含本發(fā)明CAT-TAT編碼序列的細胞。實施方式之一中，所述細胞是用上述本發(fā)明重組載體轉(zhuǎn)化來構(gòu)建的。所述細胞優(yōu)選各種利于基因產(chǎn)物表達或發(fā)酵生產(chǎn)的細胞，此類細胞已為本領(lǐng)域熟知并常用，例如各種大腸桿菌細胞和酵母細胞。在本發(fā)明的實施方式之一中，選用大腸桿菌Rosetta2(DE;3)和畢赤酵母GS115構(gòu)建表達CAT-TAT的重組細胞。本發(fā)明還提供了表達CAT-TAT的方法，包括培養(yǎng)前述包含CAT-TAT編碼序列的細胞或所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞，誘導(dǎo)其表達，收獲表達產(chǎn)物，還可以可行性地包括純化表達產(chǎn)物的步驟。實施方式之一中，本發(fā)明通過包含本發(fā)明CAT-TAT編碼序列的酵母(例如畢赤酵母GS1K)發(fā)酵來生產(chǎn)CAT-TAT，并通過硫酸銨沉降，離子交換層析和凝膠層析純化得到了純酶形式的目的蛋白。本發(fā)明利用基因工程手段制備了能夠高效表達并分泌CAT-TAT融合蛋白，實現(xiàn)了 CAT-TAT的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化，并獲得了優(yōu)質(zhì)的CAT-TAT產(chǎn)品。本發(fā)明通過融合蛋白酶學性質(zhì)鑒定進行了酶的最適作用溫度、最適作用PH值、金屬離子穩(wěn)定性等理化性質(zhì)的分析，證明本發(fā)明的CAT-TAT重組蛋白最適反應(yīng)溫度為40°C，最適反應(yīng)pH為6. 5 ；CAT-TAT融合蛋白通過體外給藥實驗，表明TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域融合的CAT蛋白能明顯提高細胞內(nèi)的過氧化氫酶活性。


圖1人源CAT-TAT在質(zhì)粒pET21a(+) (A)和pPIC9k (B)上的重組子結(jié)構(gòu)圖。圖2人源CAT和CAT-TAT在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE。圖3畢赤酵母表達人源CAT-TAT發(fā)酵過程中的酶活力。圖4畢赤酵母表達人源CAT-TAT發(fā)酵過程中樣品的SDS-PAGE。圖5畢赤酵母表達人源CAT-TAT的分子量。圖6畢赤酵母表達人源CAT-TAT的最適反應(yīng)pH。圖7畢赤酵母表達人源CAT-TAT的最適反應(yīng)溫度。圖8畢赤酵母表達人源CAT對對細胞內(nèi)CAT活性影響。
具體實施例方式以下根據(jù)具體的實施例充分說明本發(fā)明。 實施例實驗材料和試劑 1.菌株和載體
大腸桿菌 Rosetta2 (DE3)、JDH5 α 及表達載體 pET21a(+)購自 Novagen 公司；pMD_18T Vector購自Takara公司；畢赤酵母GS115及表達載體pPIC9k均購自hvitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)。2.酶類及其他生化試劑
限制性內(nèi)切酶、DNA Maker、蛋白質(zhì)Maker均購自i^ermentas (MBI)，CAT檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其他常規(guī)試劑為上海生工或進口。3.培養(yǎng)基
使用的培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基，YPD，YPAD, BMDY, BMMY, MM, MD培養(yǎng)基均參照hvitrogen畢氏酵母操作手冊。4.本發(fā)明中所用到的生物化學技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在以下實施例中， 除非特殊說明，所有實驗操作均按照以下實驗手冊或文獻中的相關(guān)章節(jié)或部分進行，包括 [美]J.莎姆布魯克等，分子克隆實驗指南；趙永芳等，生物化學技術(shù)原理及其應(yīng)用(第二版)；朱檢等，生物化學實驗[M]。5.本發(fā)明中所有相關(guān)的酶活、酶活力、酶活性均是指CAT酶活性，均采用CAT檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)，并按照其說明書中所述的方法進行測定及計算。實施例1 CAT及CAT-TAT基因的克隆
(1)總RNA的分離提取
(2)cDNA第一鏈的合成
反轉(zhuǎn)錄成第一鏈 cDNA 參照(First-straind cDNA Synthesis KIT)產(chǎn)品說明，在 20ul 體系中，加入 lug 總 RNA、lul Oligo dT18 (500ug/ml)和 foiase-free 水，在 70°C水浴溫育 IOmin后，立即置于冰浴冷卻；繼續(xù)向冷卻的管中加入4ul 5XBuffer、2ul 0. IM的DTT和 Iul IOmM的dNTPs，混勻后于42°C水浴保溫^iin ；再加入Iul (200U)反轉(zhuǎn)錄酶，42°C繼續(xù)保溫50min ；最后，置于70°C水浴保溫15min，滅活反轉(zhuǎn)錄酶，獲得第一鏈cDNA。實驗過程中設(shè)置不加RNA的陰性對照。(3) PCR獲取目的基因
根據(jù)NCBI發(fā)表的人CAT基因序列設(shè)計引物=PKSEQ NO. 3)和P2(SEQ NO. 4)，分別含有 MfeI 和歷'/ /ΙΠ酶切位點，用于 pET21(a+)質(zhì)粒的構(gòu)建；P3 (SEQ NO. 5)和 P4 (SEQ NO. 6)， 分別含有Sffi^I和Λ^ I酶切位點，用于pPICTk質(zhì)粒的構(gòu)建；P2和P4均含有編碼蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT的9個氨基酸RKKRRQRRR的基因序列。所述引物均由上海生工合成，引物序列如下
Pl :5， CATATG GCTGACAGCCGGGATCCCG 3，，
P2 :5， GGAAGCTTTCATCTTCTTCTTTGTCTTCTCTTCTTTCTCAGATTTGCCTTCTCCCTTG 3，； P3 :5’ TACGTAGCTGACAGCCGGGATCCCG 3’，
P4 :5， GCGGCCGCTTATCTTCTTCTTTGTCTTCTCTTCTTTCTCAGATTTGCCTTCTCCCTTG 3，。本實施例PCR程序為94°C預(yù)變性％iin;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 2min，循環(huán)擴增30次；最后72°C延伸lOmin。擴增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，并回收凝膠中的目標基因。得到產(chǎn)物P1-P2和產(chǎn)物P3-P4.
制備好的雙鏈cDNA P1-P2和P3-P4插入到載體系統(tǒng)pMD_18T vector上，分別將連接物轉(zhuǎn)入制備好的DH5a感受態(tài)細胞，涂LB平板(含lOOug/ml氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取在抗性平板上生長的陽性克隆子接入anl LB培養(yǎng)基中(含lOOug/ml氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)過夜；收集培養(yǎng)液，IOOOOrpm室溫離心Imin收集菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒 (上海生工)提取質(zhì)粒；質(zhì)粒分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶MfeI和歷/^III /SnaB I和Λ^ I進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測；挑取陽性克隆PMD-18T-CAT-TAT1和pMD_18T-CAT_TAT2用 M13F(5，CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3，)和 M13R(5，AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3，)弓丨
6物進行測序(上海英俊公司)，測序采用Sanger測序方法。pMD-18T-CAT-TATl 和 pMD-18T_CAT_TAT2 的測序結(jié)果是，CAT-TAT 的編碼序列共有 1608bp (SEQ ID NO. 1),編碼人源過氧化氫酶與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)TAT的融合蛋白(SEQ NO. 2)。其中第1606-1608位為終止密碼子TAA ；第1-1578位編碼不含信號肽的成熟人過氧化氫酶蛋白，共5 個氨基酸；與黑猩猩等來源的過氧化氫酶有較高的同源性；第1579-1606為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT的9個氨基酸RKKRRQRRR的基因序列。
實施例2 CAT-TAT編碼基因在大腸桿菌中的表達
將實施例1 - (4)中所得到的質(zhì)粒pMD-18T-CAT-TAT1經(jīng)Nde I和Hind III雙酶切得到 CAT-TAT片段，與經(jīng)過MfeI和歷^iZIII雙酶切的pET21a(+)質(zhì)粒連接，將連接物轉(zhuǎn)入制備好的感受態(tài)細胞DH5a中，經(jīng)藍白斑篩選，提質(zhì)粒鑒定(方法同實施例1)，得到重組質(zhì)粒 pET21a(+)-CAT-TAT (如圖 IA所示)。取Iul構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET21a(+)-CAT_TAT，加入到IOOul制備好的感受態(tài)細胞(大腸桿菌ROSetta2(DE;3))中，涂LB平板(含lOOug/ml氨芐青霉素)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑取在抗性平板上生長的陽性克隆子接入anl LB培養(yǎng)基中(含lOOug/ml氨芐青霉素)，37°C 250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1%轉(zhuǎn)接至50ml LB培養(yǎng)液中(含100ug/ml Amp) 培養(yǎng)1. 5-2h至OD600=O. 6，加入IPTG誘導(dǎo)(終濃度為2umol/ml), 30°C 250rpm再振蕩培養(yǎng) 3-3.證。取培養(yǎng)液IOOOOrpm離心lOmin，收集菌體，再加入等體積的無菌水重新懸浮菌體， 12000rpm離心lOmin，取沉淀用1/5體積pH6. 0，50mM的PBS懸浮菌體，進行超聲波破碎，破碎條件為60%功率，間隔5s破碎lOmin，停止lOmin，再破碎lOmin。12000rpm離心，收集上清液分析CAT-TAT活力，并通過SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達量，結(jié)果表明CAT-TAT 的編碼基因所編碼的CAT-TAT可在大腸桿菌中表達，且有一定的CAT活性。(圖2)
實施例3 CAT-TAT編碼基因酵母重組表達載體的構(gòu)建
將實施例1-(4)中所得到的質(zhì)粒pMD-18T-CAT-TAT2，用I和AfoiI進行酶切，酶切樣品經(jīng)核酸電泳檢測并用膠回收試劑盒(上海生工)回收目的基因。與黽SnaB I和徹《 雙酶切的PPirak質(zhì)粒經(jīng)T4連接酶16°C水浴連接池，連接物轉(zhuǎn)入DH5 α (方法同實施例1)。 挑取抗性菌株培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)I和徹《進行酶切，核酸電泳檢測，得到重組質(zhì)粒pPIC9k-CAT-TAT (如圖IB所示)。以所得pPIC9k-CAT_TAT重組質(zhì)粒為模板，以CAT-TAT的特異性引物P3和P4，進行PCR擴增，擴增程序同實施例1。擴增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳檢測可見一條約I600bp的條帶， 與目的片段的大小一致。并將該重組質(zhì)粒PPICTk-CAT-TAT行測序，測序引物為a-factor Primer 禾口 3' AOXl Primer。α -factor Primer :5’ TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’ 3' AOXl Primer 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'
測序結(jié)果與SEQ NO. 1 一致，表明CAT-TAT在pPICTk中插入位點、方向、序列和閱讀框均正確，即pPIC9k-CAT-TAT表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。實施例4畢赤酵母發(fā)酵制備重組CAT-TAT
大量提取實施例3的重組質(zhì)粒pPIC9k-CAT-TAT約5ug，用Sal I酶切，得到線性化的 pPIC9k-CAT-TAT 質(zhì)粒。
提取畢赤酵母GS115單菌落于YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至菌密度達到 OD600=L 3。取Iml的該菌液于1. 5ml無菌離心管中冰浴IOmin后，于1500g，4°C離心機離心 5min ；棄上清，加入Iml冰浴的無菌水，輕輕將細胞懸起，后置1500g，4°C離心機離心5min ； 重復(fù)一次；棄上清，加入Iml冰浴的SorbitaKl M)，輕輕將細胞懸起，后置1500g，4°C離心機離心5min ；重復(fù)兩次；棄上清，加入100 ul冰Sorbital (1 M)。將上述細胞轉(zhuǎn)入0. 2cm的電轉(zhuǎn)杯中，加入線性化的pPICTk-CAT-TAT質(zhì)粒，混勻，置于冰上5min，用電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad MicroPulser )進行電擊(電擊電壓2. OkV;時間常數(shù) 5. 8ms)，電擊后迅速加入Iml Sorbital (1 M)，混勻取菌液200ul涂布RD板，30°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3-4天，長出his+重組子。挑出長出來的單菌落，于YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，按0D_=1. O轉(zhuǎn)接于小搖瓶(IOml BMMY培養(yǎng)基)，以甲醇為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)AOX基因表達，每Mhr取樣，取樣同時補加甲醇至終濃度1%.誘導(dǎo)168hr樣品離心，取上清，測定CAT活性，并進行SDS-PAGE電泳分析， 結(jié)果分別如圖3和圖4所示。發(fā)酵達72hr時，樣品的CAT活性最高達到^OU/ml，相應(yīng)菌密度達到0D6(i(i=35.這說明重組CAT-TAT融合蛋白在畢氏酵母中得到了表達和積累。實施例5重組CAT-TAT的純化
將實施例4所制備的發(fā)酵培養(yǎng)液IOOOOrpm離心IOmin去除菌體，取上清液作為粗酶液，將粗酶液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至50%，13000rpm離心15min，取沉淀， 用緩沖液(Tris-HCl，pH8.0，50mM)重新溶解。將以上溶解后的樣品，經(jīng)13000rpm離心15min，取上清上脫鹽柱冊-558(01.6\100011)，先用501111 Tris-HCl緩沖液pH8. 0平衡柱子，然后上樣，流速為 1. 0 ml/min，用部分收集器收集樣品，然后對收集的樣品測定CAT活性，并進行蛋白質(zhì)電泳分析。取上述的目的蛋白峰樣品，用于SuperQ 650C陰離子交換色譜，先用50mM pH8. 0， Tris-HCl緩沖液平衡柱子，然后樣品上樣，再用平衡液沖平，流速為lml/min。待沖平后，再用相同緩沖液配置的0-lmol/L NaCl梯度洗脫5個柱體積，分布收集樣品，測定CAT活性， 并進行蛋白質(zhì)電泳分析。取離子交換色譜后的目的蛋白峰樣品，上Tsk-G3000SW凝膠過濾柱。先用50mM PH8.0, Tris-HCl平衡柱子，然后上樣，流速為1.0 ml/min，用部分收集器收集樣品，然后對收集的樣品測定CAT活性，并進行蛋白質(zhì)電泳分析。SDS-PAGE結(jié)果(圖5)表明，重組人源CAT-TAT融合蛋白經(jīng)純化后，以達到電泳純， 其分子量約為66kDa。CAT活性從粗酶液的^OU/mg提高到純酶的6400U/mg，純化倍數(shù)為 34. 9 倍。實施例6重組CAT-TAT的酶學性質(zhì)分析
將實施例5所制備的CAT-TAT純?nèi)诤系鞍自诓煌膒H下進行酶促反應(yīng)以測定其最適PH。所用緩沖液的pH范圍為5. 0-9.0 (pH4. 0-6.0范圍內(nèi)采用50mM Gly-HCl緩沖液， pH6. 5-9. 0采用50mM Tris-HCl緩沖液)。CAT-TAT純?nèi)诤系鞍自诓煌膒H的緩沖液中， 37°C下測定pH的適性結(jié)果，表明人源CAT-TAT融合蛋白從pH5. 0至6. 5酶活力迅速升高， 在中偏酸性的PH具有較高的酶活，在pH為6. 5是酶活力達到最高(100%)，pH在6. 5-9. 0 之間酶活力緩慢降低，在PH9. 0時仍能保持70%以上的酶活力(圖6)。
最適反應(yīng)溫度的測定在Tris-HCl (pH6. 5，50mM)緩沖體系及不同溫度下、 20 V、25 °C、30 V、；35 °C、40 V、45°C、50 V、55°C、60 V >65°C 進行酶促反應(yīng)。熱穩(wěn)定性研究為在不同溫度下處理60min，再進行酶活性測定。酶促反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果(圖7)表明， CAT-TAT過氧化氫酶融合蛋白在4-25° C之間相對酶活平緩，從30-40° C之間相對酶活迅速上升，之后又開始迅速下降，65°C時僅保留不到20%的酶活力，最適反應(yīng)溫度為45-55°C。在Tris-HCl (pH6. 5，50mM)緩沖液中加入終濃度為ImM的金屬鹽溶液和抑制劑 (Ca2\Mn2\Zn2\Al3\Pb2\Fe3\Fe2\Mg2\K\ Cu2+、Hg+、2-Mercaptoethanol、EDTA)，在 40°C 的水浴中保溫30min后，在37°C下測定殘留的CAT活性。由表1可知，Mn2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+ 等對CAT-TAT融合蛋白的過氧化氫酶活力有一定的促進作用；Al3+、2-MerCaptoethanol、 EDTA等對CAT-TAT融合蛋白的過氧化氫酶活力有明顯的抑制作用。
表1金屬離子及其他抑制劑對CAT-TAT酶活性的影響
權(quán)利要求
1.一種編碼過氧化氫酶的基因，其特征在于該基因的核苷酸序列如SEQ NO. 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的編碼過氧化氫酶的基因，其特征在于其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。
3.一種載體，包含權(quán)利要求1或2所述的編碼過氧化氫酶的基因。
4.一種細胞，包含權(quán)利要求3所述的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細胞，其特征在于所述細胞為大腸桿菌細胞或酵母細胞。
6.一種如權(quán)利要求1或2所述的編碼過氧化氫酶的基因的制備方法，其特征在于從人肝臟細胞中分離提取總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行PCR擴增，根據(jù)NCBI發(fā)表的人CAT基因序列設(shè)計引物Pl和P2，分別含有MfeI和Viz^III酶切位點，用于大腸桿菌質(zhì)粒的構(gòu)建；或設(shè)計引物P3和P4分別含有和I酶切位點，用于酵母質(zhì)粒的構(gòu)建；其中引物P2或P4含有編碼蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域TAT的9個氨基酸RKKRRQRRR的基因序列；擴增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，并回收凝膠中的目標基因；制備好的雙鏈cDNA進行亞克隆將所得目的基因進行DNA序列測定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，得到CAT-TAT基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的編碼過氧化氫酶的基因的制備方法，其特征在于所述引物Pl、P2、P3、P4 的序列如 SEQ NO. 3、SEQ NO. 4、SEQ NO. 5、SEQ NO. 6 所示。
8.—種如權(quán)利要求1或2所述的編碼過氧化氫酶的基因的應(yīng)用，其特征在于所述基因分泌的CAT-TAT蛋白能以體外給藥的方式提高細胞內(nèi)的過氧化氫酶活力。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種編碼過氧化氫酶的基因及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的一種編碼過氧化氫酶的基因，該基因的核苷酸序列如SEQNO.1所示。本發(fā)明從人肝臟細胞中克隆的CAT-TAT的編碼序列。首先提取人肝臟細胞L-02的總RNA，通過RT-PCR和PCR的方法克隆到編碼CAT的全長序列以及CAT-TAT融合基因。通過使用該基因表達得到了CAT-TAT蛋白，實現(xiàn)CAT-TAT的生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化，獲得具有良好穩(wěn)定性的CAT-TAT產(chǎn)品，用于提高細胞內(nèi)的過氧化氫酶活性。
文檔編號C12N15/63GK102559714SQ20121002146
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月31日
發(fā)明者劉樹滔, 李仁寬, 饒平凡 申請人:福州大學