專利名稱：利用實時熒光pcr技術(shù)檢測膽囊膽汁中華支睪吸蟲dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種檢測膽囊膽汁中華支睪吸蟲DNA的方法。
背景技術(shù)：
膽囊結(jié)石病是目前全世界范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)疾病之一，隨著發(fā)病率的日趨增加，嚴(yán)重影響人民的健康和生活質(zhì)量。近年來膽囊結(jié)石成因的研究有了較大進展，如喬鐵等報道了華支睪吸蟲與膽囊結(jié)石有密切相關(guān)性，但目前對膽囊結(jié)石的形成機制仍不十分明了，尚未對華支睪吸蟲與膽囊結(jié)石形成機制之間的關(guān)系進行DNA水平上的研究，但也可通過研究膽囊膽汁DNA來進行研究。

發(fā)明內(nèi)容
針對以上要解決的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用實時熒光PCR技術(shù)檢測膽囊膽汁中華支睪吸蟲DNA的方法，從而為探討華支睪吸蟲卵與膽囊膽汁形成機制的關(guān)系提供新的角度和方向。為了達到上述技術(shù)目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:本發(fā)明所述的利用實時熒光PCR技術(shù)檢測膽囊膽汁中華支睪吸蟲DNA的方法，其具體步驟包括:1)膽囊膽汁預(yù)處理；2)提取膽囊膽汁中的DNA ；3)設(shè)計并合成特異性引物及探針:根據(jù)華支睪吸蟲線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因序列，設(shè)計并合成如下特異性的引物及探針:正向引物序列:5'-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3'；反向引物序列:5'-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3'；探針序列:5' - (JOE) -AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC- (BHQ-1) -3'；將以上引物及探針配制成濃度為1(^11的儲存液，-201:保存；4)實時熒光PCR反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明提供的檢測方法，所述步驟I)中，膽囊膽汁預(yù)處理的具體步驟如下:A)取膽囊膽汁500 μ I置于2.0ml Ep管中，12000rpm離心10分鐘，向沉渣中加入Iml生理鹽水,混勻后12000rpm離心10分鐘，棄上清；B)向膽囊膽汁沉渣中加入Iml 80v/v%乙醇，混勻后靜置5分鐘，12000rpm離心10分鐘棄上清；C)重復(fù)步驟B);D)向步驟C)所得的膽囊膽汁中加入Iml生理鹽水，12000rpm離心10分鐘，棄上
清，保留沉渣。
根據(jù)本發(fā)明提供的檢測方法，所述步驟2)中提取膽囊膽汁中的DNA的具體步驟為:使用DNeasy Blood &Tissue Kit提取膽汁DNA，再用100 μ I AE溶液溶解所提取的DNA，-20°C保存。根據(jù)本發(fā)明提供的檢測方法，所述步驟4)中實時熒光PCR反應(yīng)的具體步驟如下:a)在冰上配制PCR反應(yīng)體系，依次加入以下試劑:Premix Ex Taq 25 μ 1、正向引物溶液 μ 1、反向引物溶液 μ 1、探針溶液 μ 1、rox液 μ 1、膽汁dna 2 μ 1，然后再加蒸懼水至總體積為50 μ I ;b)設(shè)置PCR反應(yīng)條件:第一步95°C預(yù)變性30秒，第二步95°C變性15秒，60°C退火延伸31秒，共計45個循環(huán)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過實時熒光PCR技術(shù)，能夠高效地提取膽囊膽汁中華支辜吸蟲的DNA,并且無需電泳，可以節(jié)省檢測時間，靈敏度聞，并有效避免有毒物質(zhì)(如EB)的污染，為探討華支睪吸蟲卵與膽囊膽汁形成機制的關(guān)系提供了新的研究角度和方向。


圖1是對華支睪吸蟲、弓形蟲、日本血吸蟲、廣州管圓線蟲、蛔蟲的DNA及陰性對照的實時熒光PCR特異性分析結(jié)果比較。圖2是本發(fā)明實時熒光PCR靈敏度檢測結(jié)果。圖3是Ct值與華支睪吸蟲DNAiO倍濃度梯度稀釋的相關(guān)性分析。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳述，但本發(fā)明并不限于以下實施例。實施例1膽囊膽汁的獲取喉罩全身麻醉，迷你腹腔鏡直視右肋緣下小切口抓取膽囊，膽囊底部微小切口(< 6mm)，用無菌腦室引流管引流膽汁至連接的無菌注射器中，再轉(zhuǎn)移至無菌試管中。實施例2膽囊膽汁DNA的提取將以上手術(shù)獲得的膽囊膽汁500 μ I置于2.0ml Ep管中，12000rpm離心10分鐘，向沉渣中加入Iml生理鹽水，混勻后12000rpm離心10分鐘，棄上清。然后加lml80%乙醇,混勻后靜置5分鐘，12000rpm離心10分鐘棄上清，重復(fù)一次。最后再加Iml生理鹽水，12000rpm 離心 10 分鐘，棄上清，保留沉禮:。按照 DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN)說明書操作步驟提取膽汁DNA。最后用100 μ I AE溶液(QIAGEN)溶解DNA，_20°C保存。實施例3設(shè)計并合成實時熒光PCR引物、探針根據(jù)華支睪吸蟲線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因序列(Genebank:FJ965388.1)，應(yīng)用Beacon Designer_v7.51軟件設(shè)計特異性的引物及TaqMan探針，將篩選出的引物探針組合提交 NCBI 網(wǎng)站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)與其他物種基因序列進行Blast比對，保證引物、探針的高度特異性，最終確認(rèn)選取的探針5’端標(biāo)記熒光報告基團J0E，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團BHQ-1。正反向引物以及探針的堿基序列如下:正向引物序列:5'-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3'反向引物序列:5'-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3'
探針序列:5'- (JOE) -AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC- (BHQ-1) -3'將合成的引物、探針配制成濃度為10 μ M的儲存液，_20°C保存。實施例4實時熒光PCR反應(yīng)體系及條件的建立實時熒光PCR反應(yīng)體系如下:在生物安全柜內(nèi)，冰上配置PCR反應(yīng)體系。向PCR反應(yīng)管中依次加入以下試劑:Premix Ex Taq (Takara) 25 μ 1、正向引物I μ I (10 μ Μ)、反向引物 I μ I (10 μ Μ)、探針 I μ I (10 μ Μ)、R0X 液(Takara) I μ 1、膽汁 DNA 2 μ I，然后再加滅菌超純水至總體積為50 μ I。同時以華支睪吸蟲成蟲DNA做陽性對照，以蒸餾水做陰性對照。實時熒光PCR反應(yīng)條件如下:第一步95°C預(yù)變性30秒；第二步95°C變性15秒，60°C退火延伸31秒，共計45個循環(huán)。實時熒光PCR儀優(yōu)選為ABI7300實時熒光PCR儀(USA)。實施例5實時熒光PCR檢測體系的靈敏度及特異性分析1.特異性分析分別對華支睪吸蟲、弓形蟲、日本血吸蟲、廣州管圓線蟲和蛔蟲的成蟲DNA用本實驗建立的實時熒光PCR檢測方法在相同反應(yīng)條件下進行PCR擴增，以確定其檢測特異性。結(jié)果顯示，應(yīng)用該實驗所設(shè)計的華支睪吸蟲特異性引物、TaqMan探針，建立的華支睪吸蟲實時熒光PCR檢測方法，能特異性地檢測到華支睪吸蟲DNA，而對弓形蟲、日本血吸蟲、廣州管圓線蟲、蛔蟲的DNA及陰性對照均未有特異性擴增出現(xiàn)。結(jié)果如圖1所示。圖中，曲線1:華支睪吸蟲，曲線2:弓形蟲，曲線3:日本血吸蟲，曲線4:廣州管圓線蟲，曲線5:蛔蟲，曲線6:蒸餾水(即陰性對照)。2.靈敏度分析

應(yīng)用本發(fā)明所建立的華支睪吸蟲實時熒光PCR檢測方法，分別對不同濃度梯度的華支睪吸蟲成蟲DNA在相同條件下進行實時熒光PCR擴增，以確定其檢測閾值。結(jié)果顯示，本實驗建立的華支睪吸蟲實時熒光PCR檢測方法，對華支睪吸蟲DNA的最低檢測閾值可達到0.1pg,檢測靈敏度高，并且熒光信號強度與華支睪吸蟲DNA濃度成線性相關(guān)(R2>0.99)，如圖2、3所示。圖2中，曲線1:10ng、曲線2:lng、曲線3:100pg、曲線4:10pg、曲線5:lpg、曲線6:0.lpg、曲線7:蒸餾水(陰性對照)。圖3為Ct值與華支睪吸蟲DNAlO倍濃度梯度稀釋的相關(guān)性分析，其中X軸為DNA濃度的負(fù)對數(shù)，Y軸為Ct值。
權(quán)利要求
1.一種利用實時熒光PCR技術(shù)檢測膽囊膽汁中華支睪吸蟲DNA的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)膽囊膽汁預(yù)處理； 2)提取膽囊膽汁中的DNA; 3)設(shè)計并合成特異性引物及探針:根據(jù)華支睪吸蟲線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因序列，設(shè)計并合成如下特異性的引物及探針: 正向引物序列-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3'； 反向引物序列-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3'；探針序列:5' - (JOE) -AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC- (BHQ-1) -3;； 將以上引物及探針配制成濃度為10 μ M的儲存液，-20°C保存； 4)實時熒光PCR反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟I)中，膽囊膽汁預(yù)處理的具體步驟如下: A)取膽囊膽汁500μ I置于2.0ml Ep管中，12000rpm離心10分鐘，向沉渣中加入Iml生理鹽水，混勻后12000rpm離心10分鐘，棄上清； B)向膽囊膽汁沉渣中加入Iml80v/v%乙醇，混勻后靜置5分鐘，12000rpm離心10分鐘棄上清； C)重復(fù)步驟B)； D)向步驟C)所得的膽囊膽汁中加入Iml生理鹽水，12000rpm離心10分鐘，棄上清，保留沉渣。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中提取膽囊膽汁中的DNA的具體步驟為:使用DNeasy Blood &Tissue Kit提取膽汁DNA，再用100 μ I AE溶液溶解所提取的DNA，-20°C保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟4)中實時熒光PCR反應(yīng)的具體步驟如下: a)在冰上配制PCR反應(yīng)體系，依次加入以下試劑:PremixEx Taq 25 μ 1、正向引物溶液Ιμ 1、反向引物溶液Ιμ 1、探針溶液Ιμ 1、rox液 μ 1、膽汁dna 2μ 1，然后再加蒸餾水至總體積為50 μ I ; b)設(shè)置PCR反應(yīng)條件:第一步95°C預(yù)變性30秒，第二步95°C變性15秒，60°C退火延伸31秒，共計45個循環(huán) 。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用實時熒光PCR技術(shù)檢測膽囊膽汁中華支睪吸蟲DNA的方法，其包括以下步驟1)膽囊膽汁預(yù)處理；2)提取膽囊膽汁中的DNA；3)設(shè)計并合成特異性引物及探針；4)實時熒光PCR反應(yīng)。本發(fā)明提供的方法能夠高效提取膽囊膽汁中華支睪吸蟲的DNA，并且無需電泳，可以節(jié)省檢測時間，靈敏度高，并有效避免有毒物質(zhì)的污染，為研究華支睪吸蟲卵與膽囊膽汁形成機制的關(guān)系提供了新的研究角度和方向。
文檔編號C12Q1/68GK103224975SQ20121002133
公開日2013年7月31日 申請日期2012年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月31日
發(fā)明者喬鐵, 鄭培明, 謝景夏, 馬瑞紅, 羅小兵, 羅振亮 申請人:廣州市番禺區(qū)膽囊病研究所