專利名稱：利用實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)檢測(cè)膽囊結(jié)石中華支睪吸蟲dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)膽囊結(jié)石中華支睪吸蟲DNA的方法。
背景技術(shù)：
膽囊結(jié)石病是目前全世界范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)疾病之一，隨著發(fā)病率的日趨增加，嚴(yán)重影響人民的健康和生活質(zhì)量。近年來(lái)膽囊結(jié)石成因的研究有了較大進(jìn)展，如喬鐵等報(bào)道了華支睪吸蟲與膽囊結(jié)石有密切相關(guān)性，但目前對(duì)膽囊結(jié)石的形成機(jī)制仍不十分明了，尚未對(duì)華支睪吸蟲與膽囊結(jié)石形成機(jī)制之間的關(guān)系進(jìn)行DNA水平上的研究。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)以上要解決的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)膽囊結(jié)石中華支睪吸蟲DNA的方法，從而為探討華支睪吸蟲卵與膽囊結(jié)石形成機(jī)制的關(guān)系提供新的角度和方向。為了達(dá)到上述技術(shù)目的，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明所述的利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)膽囊結(jié)石中華支睪吸蟲DNA的方法，其具體步驟包括:I)膽囊結(jié)石預(yù)處理；2)提取膽囊結(jié)石中的DNA ；3)設(shè)計(jì)并合成特異性引物及探針:根據(jù)華支睪吸蟲線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因序列，設(shè)計(jì)并合成如下特異性的引物及探針:正向引物序列:5'-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3'；反向引物序列:5'-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3'；探針序列:5' - (JOE) -AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC- (BHQ-1) -3'；將以上引物及探針配制成濃度為1(^11的儲(chǔ)存液，-201:保存；4)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，所述步驟I)中，膽囊結(jié)石預(yù)處理的具體步驟如下:A)將膽囊結(jié)石用蒸餾水沖洗至少2次，然后置于60°C烘箱中12小時(shí)烘干；B)取步驟A)中烘干后的膽囊結(jié)石10毫克，液氮冷凍30分鐘后取出，再向膽囊結(jié)石中加入500 μ I生理鹽水，冰上研磨充分后，12000rpm離心10分鐘，棄上清保留膽囊結(jié)石沉渣；C)向所述膽囊結(jié)石沉渣中加入I毫升80v/v%乙醇，混勻后靜置5分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄上清，保留沉渣；

D)重復(fù)步驟C);E)向步驟D)所得的膽囊結(jié)石沉渣中加入I毫升生理鹽水，12000rpm離心10分鐘，棄上清,保留沉洛。根據(jù)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，所述步驟2)中提取膽囊結(jié)石中的DNA的具體步驟為:使用DNeasy Blood &Tissue Kit提取膽石DNA，再用100 μ I AE溶液溶解所提取的DNA，-20°C保存。根據(jù)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，所述步驟4)中實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的具體步驟如下:a)在冰上配制PCR反應(yīng)體系，依次加入以下試劑:Premix Ex Taq 25 μ 1、正向引物溶液 μ 1、反向引物溶液 μ 1、探針溶液 μ 1、rox液 μ 1、結(jié)石dna 2 μ 1，然后再加蒸懼水至總體積為50 μ I ;
b)設(shè)置PCR反應(yīng)條件:第一步95°C預(yù)變性30秒，第二步95°C變性15秒，60°C退火延伸31秒，共計(jì)45個(gè)循環(huán)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，能夠高效地提取膽囊結(jié)石中華支辜吸蟲的DNA,并且無(wú)需電泳，可以節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，靈敏度聞，并有效避免有毒物質(zhì)(如EB)的污染，為探討華支睪吸蟲卵與膽囊結(jié)石形成機(jī)制的關(guān)系提供了新的研究角度和方向。


圖1是對(duì)華支睪吸蟲、弓形蟲、日本血吸蟲、廣州管圓線蟲、蛔蟲的DNA及陰性對(duì)照的實(shí)時(shí)熒光PCR特異性分析結(jié)果比較。圖2是本發(fā)明實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果。圖3是Ct值與華支睪吸蟲DNAlO倍濃度梯度稀釋的相關(guān)性分析。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1膽囊結(jié)石的獲取喉罩全身麻醉，迷你腹腔鏡直視右肋緣下小切口抓取膽囊，膽囊底部微小切口(< 6mm)，使用三通道硬質(zhì)膽道鏡(CHiAO，橋牌)探查膽囊、取石，選取直徑大于5mm的結(jié)石，用套石網(wǎng)取出；對(duì)于直徑小于5mm的結(jié)石以及泥沙樣結(jié)石，用膽囊小結(jié)石吸取箱(CHiAO，橋牌)取出。 實(shí)施例2膽囊結(jié)石DNA的提取將以上手術(shù)獲得的膽囊結(jié)石經(jīng)蒸餾水沖洗至少2次，置于60°C烘箱內(nèi)12小時(shí)烘干。稱取IOmg膽囊結(jié)石標(biāo)本置2.0ml Ep管中，液氮冷凍30分鐘后取出，將結(jié)石標(biāo)本置研缽內(nèi)，加500 μ I生理鹽水，冰上研磨充分后轉(zhuǎn)移至2.0ml Ep管中，12000rpm離心10分鐘，棄上清保留膽石沉渣。然后加Iml 80v/v%乙醇，混勻后靜置5分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄上清，重復(fù)一次(抽提部分膽紅素及膽固醇)。最后再加Iml生理鹽水，12000rpm離心10分鐘,棄上清,保留沉洛。按照DNeasy Blood &Tissue Kit (QIAGEN)說(shuō)明書操作步驟提取膽石DNA。最后用100 μ I AE溶液(QIAGEN)溶解DNA，-20°C保存。實(shí)施例3設(shè)計(jì)并合成實(shí)時(shí)熒光PCR引物、探針根據(jù)華支睪吸蟲線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因序列(Genebank:FJ965388.1)，應(yīng)用Beacon Designer_v7.51軟件設(shè)計(jì)特異性的引物及TaqMan探針，將篩選出的引物探針組合提交NCBI 網(wǎng)站(http://www.ncb1.nl rn.nih.gov/blast/Blast.cgi)與其他物種基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，保證引物、探針的高度特異性，最終確認(rèn)選取的探針5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)J0E，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ-1。正反向引物以及探針的堿基序列如下:正向引物序列:5'-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3'反向引物序列:5'-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3'探針序列:5'- (JOE) -AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC- (BHQ-1) -3'將合成的引物、探針配制成濃度為10 μ M的儲(chǔ)存液，_20°C保存。實(shí)施例4實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及條件的建立實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系如下:在生物安全柜內(nèi)，冰上配置PCR反應(yīng)體系。向PCR反應(yīng)管中依次加入以下試劑:Premix Ex Taq (Takara) 25 μ 1、正向引物I μ I (10 μ Μ)、反向引物 I μ I (10 μ Μ)、探針 I μ I (10 μ Μ)、R0X 液(Takara) I μ 1、膽石 DNA 2 μ I,然后再加滅菌超純水至總體積為50 μ I。同時(shí)以華支睪吸蟲成蟲DNA做陽(yáng)性對(duì)照，以蒸餾水做陰性對(duì)照。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件如下:第一步95°C預(yù)變性30秒；第二步95°C變性15秒，60°C退火延伸31秒，共計(jì)45個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光PCR儀優(yōu)選為ABI7300實(shí)時(shí)熒光PCR儀(USA)。

實(shí)施例5實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系的靈敏度及特異性分析1.特異性分析分別對(duì)華支睪吸蟲、弓形蟲、日本血吸蟲、廣州管圓線蟲和蛔蟲的成蟲DNA用本實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定其檢測(cè)特異性。結(jié)果顯示，應(yīng)用該實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的華支睪吸蟲特異性引物、TaqMan探針，建立的華支睪吸蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，能特異性地檢測(cè)到華支睪吸蟲DNA，而對(duì)弓形蟲、日本血吸蟲、廣州管圓線蟲、蛔蟲的DNA及陰性對(duì)照均未有特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。結(jié)果如圖1所示。圖中，曲線1:華支睪吸蟲，曲線2:弓形蟲，曲線3:日本血吸蟲，曲線4:廣州管圓線蟲，曲線5:蛔蟲，曲線6:蒸餾水(即陰性對(duì)照)。2.靈敏度分析應(yīng)用本發(fā)明所建立的華支睪吸蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，分別對(duì)不同濃度梯度的華支睪吸蟲成蟲DNA在相同條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，以確定其檢測(cè)閾值。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)建立的華支睪吸蟲實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，對(duì)華支睪吸蟲DNA的最低檢測(cè)閾值可達(dá)到0.1pg,檢測(cè)靈敏度高，并且熒光信號(hào)強(qiáng)度與華支睪吸蟲DNA濃度成線性相關(guān)(R2 > 0.99)，如圖2、3所示。圖2中，曲線1:10ng、曲線2:ln g、曲線3:lOOpg、曲線4:10pg、曲線5:lp g、曲線6:0.1p g、曲線7:蒸懼水(陰性對(duì)照)。圖3為Ct值與華支睪吸蟲DNAlO倍濃度梯度稀釋的相關(guān)性分析，其中X軸為DNA濃度的負(fù)對(duì)數(shù)，Y軸為Ct值。
權(quán)利要求
1.一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)膽囊結(jié)石中華支睪吸蟲DNA的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)膽囊結(jié)石預(yù)處理； 2)提取膽囊結(jié)石中的DNA； 3)設(shè)計(jì)并合成特異性引物及探針:根據(jù)華支睪吸蟲線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因序列，設(shè)計(jì)并合成如下特異性的引物及探針: 正向引物序列-GGTTTGGTATGATTAGTCACATTTG-3'； 反向引物序列-ACCACCCTACCCAGACAAAC-3'；探針序列:5' - (JOE) -AGCAAACATAGCCAACACCAAGCCC- (BHQ-1) -3;； 將以上引物及探針配制成濃度為10 μ M的儲(chǔ)存液，-20°C保存； 4)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟I)中，膽囊結(jié)石預(yù)處理的具體步驟如下: A)將膽囊結(jié)石用蒸餾水沖洗至少2次，然后置于60°C烘箱中12小時(shí)烘干； B)取步驟A)中烘干后的膽囊結(jié)石10毫克，液氮冷凍30分鐘后取出，再向膽囊結(jié)石中加入500 μ I生理鹽水，冰上研磨充分后，12000rpm離心10分鐘，棄上清保留膽囊結(jié)石沉渣； C)向所述膽囊結(jié)石沉渣中加入I毫升80v/v%乙醇，混勻后靜置5分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄上清，保留沉渣； D)重復(fù)步驟C); E)向步驟D)所得的膽囊結(jié)石沉洛中加入I毫升生理鹽水，12000rpm離心10分鐘,棄上清，保留沉渣。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中提取膽囊結(jié)石中的DNA的具體步驟為:使用DNeasy Blood &Tissue Kit提取膽石DNA，再用100 μ I AE溶液溶解所提取的DNA，-20°C保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟4)中實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的具體步驟如下: a)在冰上配制PCR反應(yīng)體系，依次加入以下試劑:PremixEx Taq 25 μ 1、正向引物溶液Ιμ 1、反向引物溶液Ιμ 1、探針溶液Ιμ 1、rox液 μ 1、結(jié)石dna 2μ 1，然后再加蒸餾水至總體積為50 μ I ; b)設(shè)置PCR反應(yīng)條件:第一步95°C預(yù)變性30秒，第二步95°C變性15秒，60°C退火延伸31秒，共計(jì)45個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)膽囊結(jié)石中華支睪吸蟲DNA的方法，其包括以下步驟1)膽囊結(jié)石預(yù)處理；2)提取膽囊結(jié)石中的DNA；3)設(shè)計(jì)并合成特異性引物及探針；4)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。本發(fā)明提供的方法能夠高效提取膽囊結(jié)石中華支睪吸蟲的DNA，并且無(wú)需電泳，可以節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，靈敏度高，并有效避免有毒物質(zhì)的污染，為研究華支睪吸蟲卵與膽囊結(jié)石形成機(jī)制的關(guān)系提供了新的研究角度和方向。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103224976SQ201210021338
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2012年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月31日
發(fā)明者喬鐵, 鄭培明, 謝景夏, 馬瑞紅, 羅小兵, 羅振亮 申請(qǐng)人:廣州市番禺區(qū)膽囊病研究所