專利名稱：基因分型dna的制作方法
基因分型DNA相關申請的交叉引用本申請要求2011年5月12日提交的美國申請N0.61/485，376和2010年8月11日提交的美國申請N0.61/372，849的優(yōu)先權，全部通過引用合并。
技術領域：
在本文提供的是用于基因分型核酸的組合物和方法。
背景技術：
用于基因分型核酸的多種方法為本領域所知。Schon，美國專利N0.5，866，337 ;Landegren，美國專利N0.6，235，472 ;及Willis，美國專利N0.6，858，412提供其末端結構域與靶序列雜交的探針，產生與靶結合的開環(huán)探針。在特定條件下，連接發(fā)生在由探針和靶形成的雜交復合物的雙鏈部分，導致探針和靶的連接。Willis另外地將切割位點合并到該文公開的前環(huán)探針。前環(huán)探針的閉合之后是切割和擴增，以產生包含地址位點的擴增子。Wi 11 i s中的擴增也包括與原靶同一或互補的序列的擴增。Shen，美國專利申請公開N0.2008/0242555和Oliphant，美國專利申請公開N0.2010/0015626描述用于同時擴增和/或基因分型各種樣品的多重化方法。在這些參考文獻中，用引物產生包括原靶序列的擴增產物，其包括基因組DNA。發(fā)明概述本文所述的組合物和方法對于核酸變異的檢測有用。在特定實施方式中，未擴增靶序列的部分或其補體。在一些 實施方式中，拷貝或擴增部分靶序列或其補體。一方面，本發(fā)明提供鑒定一級靶序列中的檢測核苷酸的方法，所述一級靶序列包含第I靶結構域，第2靶結構域及所述檢測核苷酸，所述方法包括:(a)提供第I連接探針，其依次包含:(i)第I地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域，(iii)第I雜交結構域，其互補于所述第I靶結構域及(iv)第I詢問核苷酸；(b)提供第2連接探針，其依次包含:(i)第2雜交結構域，其互補于所述第2靶結構域及(ii)第2引發(fā)結構域，其中所述第I和第2連接探針之一包含切割位點；(c)使所述第I和第2連接探針分別與所述第I和第2靶結構域雜交，以形成雜交復合物；(d)使所述雜交復合物經歷如果所述詢問核苷酸與所述檢測核苷酸完美互補，連接發(fā)生而形成連接的探針的條件；(e)自所述連接的探針形成環(huán)化的探針；Cf)在所述切割位點切割所述環(huán)化的探針以形成依次包含所述第2引發(fā)結構域，模板地址序列及所述第I引發(fā)結構域的二級靶序列；(g)使用所述二級靶序列上的所述引發(fā)結構域擴增所述模板地址序列以形成三級靶序列；及化)檢測所述三級靶序列的存在以鑒定所述檢測核苷酸。在一些實施方式中，所述環(huán)化的探針通過環(huán)化所述連接的探針來形成。在一些實施方式中，方法還包含提供第3連接探針，其依次包含:(i)第2地址序列，(ii)所述第I引發(fā)結構域，(iii)所述第I雜交結構域，其互補于所述第IIE結構域及
(iv)第2詢問核苷酸，其中所述第2地址序列不同于所述第I地址序列，及所述第2詢問核苷酸不同于所述第I詢問核苷酸。在一些實施方式中，所述環(huán)化的探針在所述連接發(fā)生時形成。在一些實施方式中，方法還包含提供第3連接探針，其依次包含:(i)第2地址序列，(ii)所述第I引發(fā)結構域，(iii)所述第I雜交結構域，其互補于所述第IIE結構域及
(iv)第2詢問核苷酸，其中所述第2地址序列不同于所述第I地址序列；所述第2詢問核苷酸不同于所述第I詢問核苷酸；選自所述第3連接探針及所述第2連接探針的探針包含切割位點；及所述第3連接探針及所述第2連接探針在所述第2地址序列和所述第2引發(fā)結構域之間接合。在一些實施方式中，所述第I地址序列具有不同于所述第2地址序列的尺寸的尺寸。在一些實施方式中，所述第I地址序列具有不同于所述第2地址序列的核苷酸序列的核苷酸序列。在一些實施方式中，該方法還包含使所述雜交復合物與至少一種dNTP和聚合酶在所述連接之前接觸，其中所述第I連接探針的3’末端和所述第2連接探針的5’末端被所述雜交復合物中的至少一個核苷酸隔開。在一些實施方式中，所述第I連接探針的3’末端和所述第2連接探針的5’末端在所述雜交復合物中相鄰。在一些實施方式中，方法還包括使所述雜交復合物與校正聚合酶和至少一種dNTP接觸，其中所述第I連接探針包含3’延伸阻斷部。在一方面，本發(fā)明中提供鑒定一級靶序列中的檢測核苷酸的方法，所述一級靶序列包含第I靶結構域，第2靶結構域及所述檢測核苷酸，所述方法包括:Ca)提供第I連接探針，其依次包含:(i)地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域及(iii)第I雜交結構域，其互補于所述第I靶結構域；(b)提供第2連接探針，其依次包含:(i)第2雜交結構域，其互補于所述第2靶結構域及(ii)第2引發(fā)結構域，其中所述第I和第2連接探針之一包含切割位點；(c)在第I容器中使所述第I和第2連接探針分別與所述第I和第2靶結構域雜交，以形成雜交復合物；(d)使所述雜交復合物與第IdNTP和聚合酶接觸，使得如果所述第IdNTP與所述檢測核苷酸完美互補，所述第I或第2連接探針延伸而包含詢問核苷酸；(e)使所述雜交復合物經歷連接發(fā)生而形成連接的探針的條件；(f)自所述連接的探針形成環(huán)化的探針；(g)在所述切割位點切割所述環(huán)化的探針以形成依次包含所述第2引發(fā)結構域，模板地址序列及所述第I引發(fā)結構域的二級靶序列；(h)使用所述二級靶序列上的所述引發(fā)結構域擴增所述模板地址序列以形成三級靶序列；及(丨)檢測所述三級靶序列的存在以鑒定所述檢測核苷酸。在一些實施方式中，所述環(huán)化的探針通過環(huán)化所述連接的探針來形成。在一些實施方式中，所述環(huán)化的探針在所述連接發(fā)生時形成。在一些實施方式中，方法還包括重復所述方法，其中第2雜交步驟發(fā)生在第2容器中，及所述接觸步驟包括使所述雜交復合物與第2dNTP和聚合酶接觸，使得如果所述第2dNTP與所述檢測核苷酸完美互補，所述第I或第2連接探針延伸而包含詢問核苷酸，其中所述第2dNTP不同于所述第I dNTP。

在一些實施方式中，所述第I和第2靶結構域僅被所述檢測核苷酸隔開。
一方面，本發(fā)明提供鑒定一級靶序列中的檢測核苷酸的方法，所述一級靶序列包含第I靶結構域，第2靶結構域及所述檢測核苷酸，所述方法包括:(a)提供第I連接探針，其依次包含:⑴第I引發(fā)結構域，(ii)地址序列，(iii)第2引發(fā)結構域及(iv)第I雜交結構域，其互補于所述第I靶結構域；(b)提供第2連接探針，其包含:(i)第2雜交結構域，其互補于所述第2靶結構域及(ii)標記物；(c)在第I容器中使所述第I和第2連接探針分別與所述第I和第2靶結構域雜交，以形成雜交復合物；(d)使所述雜交復合物與第IdNTP和聚合酶接觸，使得如果所述第IdNTP與所述檢測核苷酸完美互補，所述第I或第2連接探針延伸而包含詢問核苷酸；(e)使所述雜交復合物經歷連接發(fā)生而形成二級靶序列的條件；(f)通過使標記物與附接于固體支持物的捕獲結合配體結合來捕獲所述二級靶序列；(g)使用所述二級靶序列上的所述引發(fā)結構域擴增所述地址序列以形成三級靶序列；及(h )檢測所述三級靶序列的存在以鑒定所述檢測核苷酸。在一些實施方式中，方法包括重復所述方法，其中第2雜交步驟發(fā)生在第2容器中，及所述接觸步驟包括使所述雜交復合物與第2dNTP和聚合酶接觸，使得如果所述第2dNTP與所述檢測核苷酸完美互補，所述第I或第2連接探針延伸而包含詢問核苷酸，其中所述第2dNTP不同于所述第I dNTP。在一些實施方式中，所述第I和第2靶結構域僅被所述檢測核苷酸隔開。在一些實施方式中，所述切割位點包含選自下列的一種或更多部分:肌苷，核糖核苷酸，無堿基位點，光切割性基團，及限制酶切割序列。在一些實施方式中，所述擴增步驟包括實施PCR。在一些實施方式中，所述三級靶序列包含標記物。在一些實施方式中，所述檢測步驟包括形成包含所述三級靶序列，捕獲探針和固體支持物的信號傳導復合物。
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在一些實施方式中，所述信號傳導復合物還包含信號探針。在一些實施方式中，所述第2引發(fā)結構域包含引發(fā)結構域延伸。在一些實施方式中，所述地址序列中的至少一個包含適配體序列。在一些實施方式中，所述地址序列中的至少一個包含樣品指標序列。在一些實施方式中，所述地址序列中的至少一個包含座位指標序列。在一些實施方式中，所述座位指標序列包含對應于所述一級靶序列的片段的序列。在一些實施方式中，所述座位指標序列不包含對應于所述一級靶序列的片段的序列。在一些實施方式中，引發(fā)結構域或地址序列不包含對應于所述一級靶序列的片段的序列。在一些實施方式中，擴增所述模板地址序列的步驟在使得無雜交結構域被擴增的條件下實施。在一些實施方式中，所述一級靶序列是胎兒的DNA。在一些實施方式中，所述DNA自所述胎兒的父親被所述胎兒遺傳。 在一些實施方式中，所述檢測步驟包括測序所述三級靶序列。在一些實施方式中，所述一級靶序列得自母源血，母源血清，母源血漿或母源尿。
在一些實施方式中，所述一級靶序列是胎兒的DNA，且在所述母源血，母源血清或母源血漿中計數一級靶序列的數，以便檢測所述胎兒的三體性?！矫?，本發(fā)明提供鑒定來自母親的血樣品中的胚胎細胞的方法，所述方法包括:(a)測定來自母親的DNA中多個基因的基因型以鑒定在來自所述母親的所述DNA中純合的多個查詢基因；(b)測定來自所述母親的所述血樣品中細胞的DNA中一種或更多所述多個查詢基因的基因型以鑒定至少一種雜合基因，基因分型步驟包括實施本發(fā)明的方法，由此鑒定所述胚胎細胞。在一些實施方式中，方法還包括富集所述具有胚胎細胞的血樣品。在一些實施方式中，方法還包括擴增來自所述胚胎細胞的DNA以獲得擴增的DNA及在比較性基因組雜交測定中使用所述擴增的DNA以檢測遺傳異常。在一些實施方式中，所述遺傳異常是三體性。一方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明的方法產生的環(huán)化的探針。一方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明的方法產生的雜交復合物。一方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明的方法產生的二級靶序列。

圖1顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖2顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖3顯示本發(fā)明的 組合物和方法的一實施方式。圖4顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖5顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖6顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖7顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖8顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖9顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖10顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖11顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖12顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖13顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖14顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖15顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖16顯示本發(fā)明的組合物和方法的一實施方式。圖17A，17B和17C顯示可用于構建檢測許多不同SNP的探針和引物的例示核苷酸序列。圖18顯示設計為模擬本發(fā)明的連接的探針的例示線性寡核苷酸。圖19提供顯示通過實施本發(fā)明的方法形成的產物的環(huán)化，再線性化和擴增的數據。圖20A和20B提供顯示本發(fā)明的例示連接的探針和二級靶序列的PCR擴增和檢測的數據。
圖21A和21B提供顯示本發(fā)明的例示連接的探針和二級靶序列的PCR擴增和檢測的數據。圖22提供顯示本發(fā)明的例示連接的探針和二級靶序列的PCR擴增和檢測的數據。發(fā)明詳述本發(fā)明提供在一級靶序列中檢測(或，在一些情況中，發(fā)現)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的組合物和方法。在例示實施方式中，未擴增一級靶序列。與此相比，方法利用不同于一級靶序列的二級靶序列的擴增，以便為特定SNP的存在基因分型一級靶序列。因此，本發(fā)明提供，在例示實施方式中，無一級靶本身擴增地在一級靶中檢測核酸變異，通常通過對齊擴增引物，以防止一級靶擴增。二級靶序列通常是“地址序列”，其鑒定在SNP檢測位置的核苷酸；即，不同二級靶序列用于在SNP檢測位置的各核苷酸。本發(fā)明的方法可以各種方式實施。如本文總的所述，在SNP位置的堿基被稱為“檢測位置”，與檢測位置雜交的連接探針的堿基被稱為在“詢問位置”的“詢問堿基”。一方面，使用各包含對應于SNP的不同等位基因的不同地址序列和詢問核苷酸的多個不同第I連接探針，由此允許醫(yī)師區(qū)別一級靶序列中在檢測核苷酸的可能的基因變異。不同第I連接探針沿著第2連接探針允許在 相同的反應容器中與一級靶序列雜交(鄰近或有間隔，還如下文描述)。含有與在檢測核苷酸的SNP完美互補的詢問核苷酸的僅第I連接探針會與第2連接探針連接。將連接的探針環(huán)化及切割，產生包含用于進一步擴增和檢測的地址序列的二級靶序列。二級靶序列側翼有用于聚合酶鏈反應(PCR)的引物序列，由此導致僅二級靶序列擴增以形成擴增子。在一些實施方式中，第I和第2連接探針實際上是單探針，常被稱為“前環(huán)”或“開環(huán)”探針的不同端。因此，不必需在連接之后的另外的環(huán)化步驟，但在實施任何擴增步驟之前，通常例如，通過使用外切核酸酶降解來移出任何未連接的探針。一方面，用另外的步驟實施以上方法，其中第I和第2連接探針沿著靶序列與它們之間的一個或更多核苷酸雜交，例如連接探針當雜交時在它們之間形成“間隔”。在此實施方式中，連接探針之一在連接之前使用聚合酶延長一個或更多dNTP。此導致添加的特異性，由于聚合酶通常不會將堿基添加到錯配的末端；即，如果詢問堿基不是正確的，聚合酶會不延伸間隔，且連接酶會不能將2個探針(或開環(huán)探針的端)連接在一起。由此需要，在連接之前聚合酶成功地延伸連接探針可導致SNP的等位基因的更精確的檢測。一方面，在一級靶序列中檢測SNP包括使用不包含對應于任何特定SNP的詢問核苷酸，且與具有單核苷酸間隔的檢測(SNP)位置的任意側上的互補靶序列雜交的連接探針。在本文中，第I和第2連接探針允許在至少2個不同反應容器中與一級靶序列雜交，向各容器中添加不同dNTP。在添加的dNTP與在檢測核苷酸的SNP完美互補的容器中，連接探針之一會延長聚合酶。然后將連接探針連接，環(huán)化及切割，產生包含用于進一步擴增和檢測的地址序列的二級靶序列。如本文所述，此也可用開環(huán)探針進行，其中開環(huán)探針的末端之間的“間隔”是檢測位置。一方面，檢測一級靶序列中的SNP包含使用(i)第I連接探針，其包含(a)地址盒，其依次包含第I引發(fā)結構域，地址序列和第2引發(fā)結構域，及(b)第I靶特定序列，其互補于靶序列的第I靶結構域(有時在本文被稱為“第I雜交結構域”)及在詢問位置含有詢問堿基，及(ii)第2連接探針，其包含(a)第2靶特定序列，其互補于靶序列的第2靶結構域(有時在本文被稱為“第2雜交結構域”)及(b)結合標記物，其是結合對的部分。如下文進一步描述，重要的是地址及詢問位置在一個探針上，而結合標記物在另一探針上，使得僅如果詢問位置匹配檢測位置，則會發(fā)生連接及結合標記物與地址關聯。一方面，以上方法用另外的步驟實施，其中在連接之前連接探針使用聚合酶延長一個或更多dNTP。添加的特異性需要，在連接會導致SNP的更精確的檢測之前，聚合酶成功地延伸連接探針。二級靶序列可通過使用本文公開的本領域知道的各種方法或還，包括但不限于測序及以下描述的傳統陣列檢測方法擴增及檢測。本文所述的SNP檢測方法廣泛用于各種應用，其中測定核酸靶中各種核苷酸的同一性。但是，這些方法在一級靶序列擴增不是期望的情景中尤其有用。一種應用是自懷孕的女性的血樣品中細胞的分選。使用本文公開的方法，可為了胚胎診斷測試的通用的目的檢測在母源血中以非常低數正常存在的胚胎DNA和胚胎細胞。一般而言，對知道是母源的DNA樣品中的許多基因進行基因分型以鑒定母親是純合的一組基因中的一組SNP。此組然后在自無細胞的核酸或自母源血樣品獲得的細胞的核酸中基因分型，直到組中的至少一種鑒定為雜合。帶有對于在母親中正常純合的基因發(fā)現的雜合基因型的DNA的細胞，或無細胞的核酸可由此鑒定為胚胎源，由于雜合性必需遺傳自父親，例如在來源上是父源的。如總地描述于國際公開W02010/075459，在此通過引用以其整體合并，在母源血流中鑒定胚胎細胞允許最低限度侵襲性胚胎診斷測試。一般而言，本發(fā)明的方法通過選擇母親是純合的SNP而用于鑒定非-母源等位基因，例如父源等位基因；由此，“其他”等位基因的呈現鑒定含有父源DNA的細胞，由此是胚胎細胞。自一群胚胎細胞的DNA可然后合并用于廣泛的進一步分析。在一應用中，將合并的DNA擴增，標記及在比較性基因組雜交測定中分析。此測試可用于檢測染色體拷貝數變異，例如，三體性或其他遺傳疾病。類似地，可克隆可現在鑒定為胚胎的細胞，且可進行任意數的遺傳測試，包括全基因 組測序，另外的SNP分析，等。一般而言，可將獲得胚胎遺傳信息的任何測定應用于通過本方法收集的DNA。靶序列在本文提供的是測定一級靶序列中的一個或更多核苷酸的同一性的組合物和方法?！耙患壈行蛄小被颉耙患壈泻怂帷敝阜Q包含待測定同一性的一個或更多核苷酸的寡核苷酸。在一些實例中，測定一個或更多核苷酸的存在或缺失。一級靶序列可直接檢測或，在特定實施方式中，可利用二級靶序列，三級靶序列等間接檢測。這些“更高-順序”或“衍生物”靶序列不同于一級靶序列，但然而可檢測為檢測一級靶序列的手段。在一些實施方式中，衍生靶序列是反應產物，諸如來自PCR反應的延伸的探針，PCR擴增產物(“擴增子”)等。靶序列可取許多形式。例如，其可含有在更大核酸序列之內，即尤其是基因或mRNA的全部或部分，質?；蚧蚪MDNA的限制片段。由此，靶序列可為部分基因，調控序列，基因組DNA，cDNA, RNA包括mRNA和rRNA，或其他，包括其任何補體。當說到“靶序列”時，應明白等同涵蓋靶序列的補體。因此，在一些實施方式中，檢測靶序列指稱檢測靶序列的補體。在例示實施方式中，靶序列(例如一級靶序列)指稱，例如，自哺乳動物，特別自人的基因組DNA。一級靶序列得自樣品。在胚胎診斷學的情況中，優(yōu)選非-侵襲性地獲得的樣品，諸如母源血樣品。血樣品可為全血，血細胞(優(yōu)選白細胞)，血清或血漿。當期望完全母源樣品(例如為原純合性測試)時，可使用其他樣品，諸如頰拭子，唾液，尿，等。在一些實施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的樣品包含母源和胚胎物質(即，無細胞的核酸和/或細胞)的混合物。在其他實施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的樣品就胚胎或母源物質(即，無細胞的核酸和/或細胞)基本上純化。如以下更完全地描述，制造與靶序列雜交的探針，以測定樣品中靶序列(例如，一種等位基因對比另一)的存在或缺失。靶序列可包含一個或更多靶結構域，其為靶序列的更小亞序列。靶結構域通常作為用于構建與靶結構域雜交的互補序列的模板。例如，如下所述，靶序列的第I靶結構域可與第I連接探針的第I雜交結構域雜交，靶序列的第2靶結構域可與第2連接探針的第2雜交結構域雜交。順序的術語諸如“第I”和“第2”未旨在賦予關于靶序列的5’和3’端的結構域的取向。例如，第I靶結構域可位于第2結構域的5’或第2結構域的3’。靶結構域可為相鄰(即連續(xù)的)或分離的。在特定實施方式中，一級靶序列包含第I和第2靶結構域。在靶結構域是相鄰的情況中，一個或其他靶結構域含有檢測(SNP)位置。一般而言，檢測位置位于靶結構域的“末端”(例如.5’或3’末端)(在本文被稱為“0位置”)，盡管在一些實施方式中，檢測位置位于結構域的I，2，3，4，5或6個核苷酸的末端之內。重要的是檢測位置足夠接近連接接頭，以允許錯配和完美匹配之間的區(qū)別；即，連接酶通常會不連接含有在0 6個堿基的連接接頭之內的錯配，在連接接頭(例如第0位)的堿基提供對連接酶活性的最高特異性 。在替代性的實施方式中，靶結構域被一個或更多核苷酸分隔，當它們與靶雜交時，例如連接探針之間有“間隔”。在此實施方式中，檢測位置仍在探針末端之一的0 6個核苷酸的之內，但在2個探針之間有另外的核苷酸。或者，“間隔”是檢測位置，如本文所述。由此，在一些實施方式中，第I靶結構域和第2靶結構域僅由檢測核苷酸分隔。靶序列的檢測核苷酸是待查明存在或同一性的核苷酸。檢測核苷酸通常是基因的多個多態(tài)性之一。在例不實施方式中，檢測一個檢測核苷酸的同一丨I"生。在一些實施方式中，檢測由一個或更多核苷酸連續(xù)的或分離的多個檢測核苷酸的同一性。可通過使用在本文的方法和組合物檢測任意數的多態(tài)性或任意數的核酸序列的SNP。檢測核苷酸可利用“讀數”或“詢問核苷酸”鑒定。詢問核苷酸是定位以與檢測核苷酸形成互補堿基對的寡核苷酸，諸如探針的部分。探針在許多實例中含有與接近檢測核苷酸的靶序列雜交的部分。在一些實施方式中，詢問核苷酸與檢測核苷酸形成互補堿基對，及在一些實施方式中，詢問核苷酸不與檢測核苷酸形成互補堿基對。連接探針，如第I連接探針，可包含詢問核苷酸，及在一些情況中可延伸而包含詢問核苷酸。術語“核酸”，“寡核苷酸”或“多核苷酸”在本文是指共價連接在一起的至少2個核苷酸。本發(fā)明的核酸會通常含有一個或更多磷酸二酯鍵，盡管在一些情況中，如下所述(例如在引物和探針諸如標記物探針的構建中)，包括可具有替代主鏈的核酸類似物，包含，例如，磷酰胺(Beaucage等人，Tetrahedron49(10):1925 (1993)和該文的參考文獻；Letsinger, J.0rg.Chem.35:3800 (1970) ; 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2-氨基腺嘌呤，1-甲基肌苷，3-甲基尿苷，5-甲基胞苷，5-甲基尿苷和在5位置具有修飾的其他堿基，5-(2-氨基)丙基尿嘧啶核苷，5-鹵代胞苷，5-鹵代尿苷，4-乙酰胞苷，1-甲基腺苷，2-甲基腺苷，3-甲基胞苷，6-甲基尿苷，2-甲基鳥苷，7-甲基鳥苷，2，2-二甲基鳥苷，5-甲基氨基乙基尿苷，5-甲基氧基尿苷，脫氮核苷酸諸如7-脫氮-腺苷，6-偶氮尿苷，6-偶氮胞苷，6-偶氮胸苷，5-甲基-2-硫脲苷，其他硫代堿基諸如2-硫脲苷和4-硫脲苷和2-硫代胞苷，二氫尿苷，假尿苷，q核苷，原曙紅，萘基及取代的萘基，任何0-及N-烷基化的嘌呤和嘧啶諸如N6-甲基腺苷，5-甲基羰基甲基尿苷，尿嘧啶核苷5-氧基乙酸，吡啶-4-酮，批啶-2-酮，苯基及修飾的苯基諸·如氨基苯酚或2，4，6-三甲氧基苯，作為G-鉗核苷酸作用的修飾的胞嘧啶，8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶，氮雜嘧啶，羧基羥基烷基核苷酸，羧基烷基氨基烷基核苷酸及烷基羰基烷基化的核苷酸。術語“核苷酸”也包括為本領域所知的通用堿基。例如，通用堿基包括但不限于
3-硝基吡咯，5-硝基吲哚或水粉蕈素。術語“核苷酸”也旨在包括由核糖基3’-氧用胺基取代得到的N3’至P5’氨基磷酸酯。連接探針本文所述的方法通常需要使用一種或更多連接探針。連接探針可為等位基因特異性探針或座位特異性探針?！暗任换蛱禺愋浴碧结樖桥c靶序列雜交(例如詢問位置含有在探針內)及區(qū)別等位基因的探針?！白惶禺愋浴碧结樖窃谔囟ㄗ慌c靶序列雜交，但不必然區(qū)別等位基因(例如其中“間隔”是詢問位置)的探針。在例示實施方式中，連接探針包含與靶序列的靶結構域互補的雜交結構域。一般而言，本文公開的探針設計為互補于靶序列(一級靶序列或衍生靶序列)的結構域，使得靶序列和探針的雜交發(fā)生。在例示實施方式中，雜交結構域和靶結構域彼此完美互補。在一些實施方式中，互補不是完美的；靶序列和探針之間可有任意數的堿基對錯配。如果錯配數大到在甚至最小嚴格雜交條件下無雜交可發(fā)生，序列不是互補靶序列。由此，“基本上互補”指稱足夠互補，使得它們在選擇的反應條件，例如，為本領域所知的嚴格雜交條件下雜交的序列。在例示實施方式中，連接探針包含引發(fā)結構域。在一些實施方式中，連接探針包含2個引發(fā)結構域?！耙l(fā)結構域”指稱與用于產生寡核苷酸與之雜交的分子的一些部分的拷貝的寡核苷酸(即引物)互補的核苷酸序列(一般而言，地址序列)。例如，引物可與引發(fā)結構域雜交而形成復合物，然后使其經歷PCR條件或允許拷貝合成的一些其他領域-知道的條件。在一些實施方式中，引發(fā)結構域還包含附加序列，有時在本文被稱為“延伸”序列。引發(fā)結構域延伸可對于為服務各種目的，諸如為添加適配體，指標序列，另外的地址序列，標記物或其任何組合添加核苷酸有用。例如，當一個引發(fā)結構域包含第I地址序列時，第2引發(fā)結構域的延伸結構域可包括另外的地址序列，使得在環(huán)化的探針形成后，地址序列就更長，含有原地址序列和延伸地址序列二者。一般而言，引發(fā)結構域的延伸結構域不雜交/不互補于引物。在一些實施方式中，第I連接探針的第I引發(fā)結構域包含第I標記物。在一些實施方式中，第I連接探針的第I引發(fā)結構域包含第I標記物，第3連接探針的第I引發(fā)結構域包含第2標記物。在一些實施方式中，所述第I標記物及所述第2標記物不同。在例示實施方式中，其中使用第I連接探針和第2連接探針，第I連接探針包含第I引發(fā)結構域，第2連接探針包含第2引發(fā)結構域，以在環(huán)化后，如在圖中通常描繪的一樣側接地址序列的構型，以允許地址序列的擴增。在一些實施方式中，單連接探針包含第I引發(fā)結構域和第2引發(fā)結構域(再次，在環(huán)化后側接地址序列)。在一些實施方式中，當使用
2個引物時，它們的與2個相應引發(fā)結構域的互補性可不同。即，一個PCR引物會與一個引發(fā)結構域直接雜交，而其他PCR引物會與其他引發(fā)結構域的補體雜交。即，當使用PCR技術時，引物對與相反鏈雜交。即，如果探針被認為是“Crick”鏈，與引發(fā)結構域雜交的引物會包括“Watson”引物，其與“Crick”引發(fā)結構域直接雜交，及“Crick”引物，其與第2引發(fā)結構域的補體雜交。在例示實施方式中，選擇第I和第2引物，使得僅引物和地址序列擴增。換言之，在例示實施方式中，選擇第I和第2引物，使得無一級靶序列部分被擴增。在例示實施方式中，引物與一級靶序列(諸如基因 組DNA)不相同或互補(完美，基本上或另外)。在例示實施方式中，連接探針包含地址序列。在本領域也被知道為“zip代碼”，“條代碼”或“標簽”，地址序列用于區(qū)別發(fā)現地址序列的分子與發(fā)現不同地址序列的不同分子。如本文所述，“地址序列”可為可基于尺寸(例如用于毛細管電泳讀數)及/或序列(例如當不同擴增子與含有會與不同地址序列雜交的捕獲探針的陣列雜交時)彼此區(qū)分。在一些實施方式中，地址序列包含本身可被稱為地址序列的一個或更多較短序列。例如，“模板地址序列”可包含一個或更多適配體，座位或等位基因指標序列和樣品指標序列或其任何組合。如下進一步討論，“座位或等位基因指標序列”和“樣品指標序列”用于將更大序列分別與特定座位或等位基因或與一類樣品關聯。在一些實施方式中，地址序列包含適配體。地址序列可具有發(fā)揮適配體功能的另外的隨附的核苷酸。或者，地址序列可本身是適配體?！斑m配體”是可用于將第I分子共價或非共價結合于第2分子或結構的序列。適配體可對于制造與各種系統相容的或在各種系統中有用的分子有用，所述系統諸如核酸測序系統，其中可使用適配體，例如，在樣品制備期期間。在一些實施方式中，地址序列發(fā)揮測序適配體的功能。適配體寡核苷酸可與，例如，HiSeq(Illumina),固體(AppliedBiosystems),454 測序技術(Roche), 1n Torrent (Life Technologies), HeliScope(Helicos Biosciences), SMRT (Pacific Biosciences), CGA 月艮務(Complete Genomics)或任何其他測序或陣列技術和服務相容。相容的適配體寡核苷酸為本領域所熟知(見，例如，Ansorge ff, (2009)New Biotechnology.25:195-203)。在一些實施方式中，測序系統中使用的適配體可具有另外的官能性。例如，可將適配體用作用于靶擴增的引物或引發(fā)結構域。在例示實施方式中，包含第I地址序列的第I序列和包含第2地址序列的第2序列之間的差異是在對應詢問位置的核苷酸不同。探針之內含有的地址序列可輔助探針固定到通用陣列，其是含有不是特異于一級靶，而是，特異于個體，特別人工序列，例如地址序列的捕獲探針的陣列(固相或液相陣列)。在例示實施方式中，地址序列不同于或互補(完美，基本上或另外)于一級祀序列(諸如基因組DNA)。在例不實施方式中，地址序列是等位基因特異性的。即，等位基因特異性地址序列用于鑒定特定等位基因。例如，等位基因特異性地址序列可為包含第I詢問核苷酸的探針，諸如第I連接探針的部分，且與是包含第2詢問核苷酸的另一探針，諸如不同連接探針(即，第3連接探針)的部分的另一等位基因特異性地址序列可區(qū)分。第I和第2詢問核苷酸不同，因此使地址序列是等位基因特異性的。在一些實施方式中，第I地址序列具有不同于第2地址序列的尺寸。改變2個探針之間的地址序列的尺寸提供對于區(qū)分2個探針的添加的尺度。此可，例如，通過沿著探針移位或“行走”引發(fā)結構域達到，以獲得探針和因此獲得地址序列由序列長度不同的擴增子。含有不同尺寸的地址序列的分子可以多種方式檢測，諸如毛細管或標準電泳或知道用于基于尺寸檢測分子的任何其他方法。在其他實施方式中，可基于尺寸選擇連接探針，以增強，例如,連接探針的環(huán)化。尺寸區(qū)分可任選地與其他組分組合以提供用于檢測不同探針和探針可用于產生的擴增子的多尺度。例如，可通過標記用于合成擴增子的引物或dNTP來將標記物(例如熒光標記物)合入擴增子，如本領域所熟知。由此，在一些實施方式中，引物包含標記物。此外，標記物可為與擴增子的一些部分雜交的分離的標記探針的部分(例如在“夾層測定”中)。包含不同尺寸和光學標記物二者的分子可以各種方式檢測，諸如通過電泳(例如，毛細管電泳)。標記物可為在不同頻度發(fā)射光的2種或更多標記物。可除光學標記物之外或代替其用其他類型的標記物，諸如 本文所述的電子檢測的，放射性或其他標記物。在一些實施方式中，地址序列互補于陣列表面上的捕獲探針。一般而言，開發(fā)地址序列組和陣列上的對應捕獲探針，以最小化彼此和與反應混合物的其他組分，包括在靶序列之外的核酸序列(例如與基因組DNA內的序列)交叉-雜交。其他形式的地址序列作為可通過使用質量光譜學分離的質量標簽，可基于電泳運動性分離的電泳標簽，等。一些地址序列描述于美國專利申請公開N0.2003/0096239。在例示實施方式中，地址序列或其補體未見于基因組，特別人基因組，及缺乏發(fā)卡環(huán)。在一些實施方式中，與“通用”表面，S卩，包含可用于任何應用的一組捕獲探針的一種標準陣列使用地址序列。終端用戶可通過設計不同可溶性捕獲探針來定制陣列，如本領域技術人員會同意，通常是簡單和成本-有效的。例如，可溶性捕獲探針可包含與捕獲探針雜交的第I結構域和與地址序列雜交的第2結構域。需知，多可溶性捕獲探針可用于創(chuàng)建將地址序列與捕獲探針間接結合的鏈。在例示實施方式中，使用不同和通常人工捕獲探針陣列；即，與天然存在的一級靶序列不具有互補性的捕獲探針。地址序列可然后合并進捕獲探針。地址序列的長度可改變，依賴于期望的結合強度及期望的不同地址序列數。在例示實施方式中，地址序列范圍是約6 約500個核苷酸長，在更特定實施方式中，約8 約100，且在更特定實施方式中，約10 約25。在例示實施方式中，連接探針包含詢問核苷酸。如前所述，詢問核苷酸用于區(qū)別一級靶序列中的可能的檢測核苷酸。詢問核苷酸可在連接探針的任何位置。在例示實施方式中，連接探針中側接詢問核苷酸的一個或更多核苷酸互補于一級靶序列的靶向結構域。在例示實施方式中，連接探針的3’末端核苷酸是詢問核苷酸(盡管在本文所述，詢問位置可自3’末端稍微移出)。在一些實施方式中，連接探針的5’末端核苷酸是詢問核苷酸(盡管在本文所述，詢問位置可自5’末端稍微移出)。各包含不同詢問核苷酸的多連接探針可同時使用。在例示實施方式中，使用一組2，3或4個連接探針，各探針包含組中連接探針彼此的詢問核苷酸彼此不同的詢問核苷酸。探針數依賴于SNP位置的等位基因；而多數SNP包含2個等位基因，一些包含3或4個。該組通常包含可用于對基因基因分型的等位基因特異性探針。多組連接探針可用于對多基因基因分型。本領域技術人員會明白，可實施在本文所述的任何實施方式中的篩選或基因分型方法以檢測至少一個遺傳座位的至少一個等位基因。一般而言，獨特地址序列用于各等位基因特定連接探針。如果可以一些方式與另一地址序列區(qū)別，地址序列是獨特的。例如，地址序列可由序列，尺寸，化學標記等，以任何組合區(qū)分。在一些實施方式中，連接探針不包含詢問核苷酸。該連接探針可用于以下描述的游離堿基測定，其中將相同的連接探針但不同游離堿基加入包含一級靶序列的不同反應容器。連接探針在雜交復合物中與一級靶序列形成開環(huán)及在互補于開環(huán)端之間的間隔內的檢測核苷酸的游離堿基的存在下延伸(或“填充”)。由此，連接探針可延伸或填充，以包含詢問核苷酸。在一實施方式中，在2個或更多連接探針內的一個或更多詢問核苷酸之外的全部核苷酸是與在連接探針之間相同的；即，在一些實施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的探針具有詢問位置之外的同一的全部組分(例如探針長度以及非-詢問堿基)，以允許良好區(qū)別。

在一些實施方式中，連接探針包含標記物序列，即可用于結合標記物或信號探針的序列。標記物序列可為基本上或完美互補于標記物探針。利用該標記物探針的系統有時在本領域被稱為“夾層”測定。即，通過將標記物序列合并到連接探針，然后將其至少部分擴增及存在于擴增子，可將包含一級(或二級)檢測標記物的標記物探針加入混合物，在添加到陣列之前或之后。此允許為有效雜交使用高濃度的標記物探針。在一實施方式中，為陣列上的全部連接探針可能使用相同的標記物序列和標記物探針；替代性地，不同連接探針可具有不同標記物序列。延伸阻斷部在一些實施方式中，連接探針在3’末端包含核酸類似物。在一些實施方式中，連接探針在包括3’末端的多個位置包含核酸類似物。在包括3’末端的一個或更多位置的核酸類似物會是在期望針對核苷酸被酶切除的抗性的實施方式中特別有用的。例如，除了能延伸與模板序列雜交的引發(fā)序列之外，特定核酸聚合酶，諸如T4DNA聚合酶，能“校正”導致經歷延伸的鏈的3’端的錯配的移出的3’ -5’外切核酸酶活性。為了確保包含錯配的連接探針通過會切下錯配的校正活性不延伸，可將連接探針的3’端的詢問核苷酸經非磷酸二酯鍵的連接附接于其余連接探針。例如，連接探針可在探針的3’末端包含含有硫代磷酸酯鍵的核酸類似物。換言之，在3’末端的核苷由硫代磷酸酯鍵偶聯于探針的殘基。在一些實施方式中，在包括3’末端的多個核酸之間合并多于一個硫代磷酸酯鍵可為必需的。例如，為了增加核酸酶抗性，在3’末端核酸和分子的其余部分之間的第I硫代磷酸酯鍵的5’包括第2硫代磷酸酯鍵可為必需的。由此，在一些實施方式中，至少一個連接探針在至少3’末端包含核苷酸類似物。在一些實施方式中，核苷酸類似物選自:硫代磷酸酯和鎖核苷酸。在一些實施方式中，連接探針包含3’延伸阻斷部。在特定實施方式中，連接探針包括包含3’延伸阻斷部的詢問核苷酸。如本領域知道，包含3’延伸阻斷部的連接探針在“校正測定”中是有用的。見Bi和Stambrook, Nucleic AcidsResearch, 1998，26(12): 3073-3075。在這些測定的特定例中，連接探針允許與靶序列雜交以形成雜交復合物，其中連接探針包含是與靶序列的檢測核苷酸的錯配的詢問核苷酸。錯配通過使雜交復合物與至少一種dNTP和具有校正能力的聚合酶(S卩，校正聚合酶，其任選地缺乏鏈位移活性)接觸來校正，其用Watson-Crick配對的正確的核苷酸取代錯配。在一些實施方式中，校正核苷酸可然后連接到第2連接探針。在一些實施方式中，校正核苷酸可然后延伸(例如由聚合酶與至少一種dNTP接觸)，然后連接到第2連接探針。在一些實施方式中，延伸具有校正的核苷酸的連接探針及檢測，或延伸及擴增，檢測擴增產物。由此，可將本文所述的任何實施方式適應于利用校正測定，其中將含有與靶序列的檢測核苷酸的錯配的探針用于檢測基因的SNP。切割位點

第I和第2連接探針中的至少一個包含切割位點。在一些實施方式中，第I連接探針包含第I切割位點，第2連接探針包含第2切割位點，及第I和第2切割位點可為相同的或不同的。術語“切割位點”指稱包含當經歷本領域知道的導致鍵斷裂的條件時斷裂的一個或更多共價鍵的部分寡核苷酸。這些條件包括高能量條件，諸如高熱或電離輻射(例如，UV光);有助于鍵斷裂的PH條件，諸如酸性或堿溶液；及催化鍵斷裂的酶，諸如內切核酸酶或水解寡核苷酸之內的特定類型的鍵的其他酶。一般而言，當經歷適當的條件時，切割位點之內的僅一個或更多鍵斷裂，其余寡核苷酸缺少其他切割位點，由此抵抗任何其他鍵斷裂。連接探針內的切割位點是核苷酸，即，DNA, RNA,核酸類似物或這些的組合的單鏈序列。在一些實施方式中，在實際切割要發(fā)生之前使附加序列與切割位點雜交可為必需的。在那些實施方式中，雙鏈切割位點包含2個單鏈DNA的雜交體，2個單鏈RNA的雜交體，單鏈DNA和單鏈RNA或其類似物的混合的雜交體。雙鏈切割位點可具有完美互補或在除了一個或更多錯配之外的每位置完美互補的核酸的2個鏈。在切割位點的鏈數可不同于見于含有切割位點的其余寡核苷酸的鏈數。例如，切割位點可為雙鏈，然而在切割位點之外的部分(例如，在以下描述的環(huán)化的探針中)是單鏈。在切割位點的一個或更多核苷酸也可含有不同于其余寡核苷酸中的糖部分的糖部分。例如，DNA鏈可包含切割位點，其包含一個或更多RNA。由此，在本文的單鏈寡核苷酸可包含DNA，RNA和其類似物的混合物。切割位點內的一個或更多主鏈糖部分可缺乏堿基；該部分有時被稱為無堿基，AP，無嘌呤或無嘧啶位點。在例示實施方式中，切割位點包含肌苷。“肌苷”指稱次黃嘌呤經P -N9-糖苷鍵附接于呋喃核糖的核苷酸。在一些實施方式中，肌苷指稱脫氧肌苷。合并肌苷進其序列的寡核苷酸當與核酸酶，諸如內切核酸酶接觸時可在接近肌苷位點切割。在例示實施方式中，內切核酸酶是內切核酸酶V。內切核酸酶V，也被稱為脫氧肌苷3’ -內切核酸酶，是切割在雙鏈或單鏈DNA中肌苷的3’的第2磷酸二酯鍵的酶。此外，內切核酸酶V也可切割含有無堿基位點，脲，尿嘧啶，堿基錯配，插入/缺失錯配，發(fā)卡或未配對的環(huán)，瓣和假-Y結構的DNA。由此，在一些實施方式中，切割位點包含被內切核酸酶V識別的一個或更多核苷酸或位點。在一些實施方式中，切割位點包含無堿基位點。無堿基位點是糖主鏈缺乏堿基的部分寡核苷酸。本領域用來指稱無堿基位點的術語包括無嘌呤，無嘧啶和AP。無堿基位點的切割可由任何許多本領域知道的AP-切割酶催化，包括大腸埃希氏菌(Escherichia coli)外切核酸酶III (基因xthA),肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)和枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)外切核酸酶A (基因exoA)，哺乳動物AP內切核酸酶I (AP1)，果蠅屬(Drosophila)重組修復蛋白I (基因Rrpl),擬南芥(Arabidopsis thaliana)無嘌呤內切核酸酶-氧化還原蛋白(基因arp),網柱菌屬(Dictyostelium) DNA-(無嘌呤或無喃唳位點)裂合酶(基因apeA),細菌內切核酸酶IV(基因nfo),真菌和秀_隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)無嘌呤內切核酸酶APN1,網柱菌屬(Dictyostelium)內切核酸酶4同源物,古細菌可能的內切核酸酶4同源物和擬菌病毒屬(Mimivirus)推定的內切核酸酶4。此外，無堿基位點可通過熱或化學-處理切割。例如，包含無堿基位點的寡核苷酸可經歷 IOCTC經 30min。見 Sugiyama et al.，Chem.Res.Toxicol.，1994，7:673-683。無喊基位點也可通過使用劑諸如嗎啉，哌啶，哌嗪，I, 2-乙二胺和N，N’ -二甲基亞乙基二胺化學切割。堿處理，諸如使用氫氧化鈉升高樣品PH，也可用于在無堿基位點切割寡核苷酸。在一些實施方式中，如下所述，在寡核苷酸創(chuàng)建無堿基位點，然后由用AP-切割酶處理，熱或化學處理或本領域知道的其他方法切割。在一些實施方式中，切割位點包含核糖核苷酸。特定酶，尤其是RNA酶，已知切割RNA。特定RNA酶諸如RNA酶A和RNA酶T1作用于單鏈RNA。其他RNA酶作用于雙鏈核酸。例包括RNA酶III，其底物是雙鏈RNA，及RNA酶H，其切割見于RNA:DNA雜交體的RNA。如果需要，包含RNA的切割位點可通過會形成對于識別和由這些酶切割足夠的雙鏈位點的另外的DNA或RNA鏈的導入來由RNA酶III，RNA酶H等切割。在一些實施方式中，切割位點包含尿嘧啶。在例示實施方式中，切割位點包含脫氧尿嘧啶。各種糖基化酶識別DNA序列之內尿嘧啶的存在。這些糖基化酶切下尿嘧啶，留下可以本文所述的及本領域知道的各種方式切割的無堿基位點。例如，尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)自單或雙鏈DNA移出尿嘧啶，及可，例如，由熱處理或由與AP-切割酶，諸如內切核酸酶VIII接觸來切割得到的無堿基位點。因此，可組合糖基化酶和AP-切割酶的活性，以切割含有尿嘧啶的DNA的一個或更多鏈。在一些實施方式中，切割位點包含堿基對錯配。如本領域所知，互補堿基對在雙鏈核酸內的腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)之間，腺嘌呤和尿嘧啶(U)之間及鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之間形成。“堿基對錯配”或“錯配”是自這些可能性偏離的堿基對。修復酶在各種生物中起到作用而自核酸去除錯配。例如，MutY糖基化酶識別G:A錯配，從自移出腺嘌呤而留下無堿基位點。AP-切割酶，諸如內切核酸酶IV，隨后切割含有無堿基位點的鏈。因此，可組合糖基化酶和AP-切割酶的活性，以切割一個或更多含有錯配的雜交的核酸鏈。在一些實施方式中，切割位點包含限制酶切割位點。限制酶切割位點是核酸序列，一般盡管不總是4 Sbp 長，其被許多限制酶中的任何一種切割。包括多樣的組的催化性蛋白，對于實驗目的有用的限制酶包括II型，III型和IV型酶。特定II型酶，包括Hhal，HindIII和Notl，切割它們的識別位點之內的核酸，其可為連續(xù)或非連續(xù)，對稱或不對稱。其他II型酶在它們的識別位點之外切割。IIS型內切核酸酶識別4 7bp長的不對稱雙鏈DNA序列，及在離它們的識別位點達20個堿基的特定位置切割兩條鏈。IIS型內切核酸酶，諸如FokI和Alwl，含有用于DNA識別結合及切割的2個不同結構域。在一些情況中，IIS型酶與多于一個識別序列相互作用后在DNA切割更有效。IIG型酶是在限制酶識別位點之外切割的另一類型的內切核酸酶。因此，在一些實施方式中，核酸包含除切割位點，諸如限制酶切割位點之外的限制酶識別位點。在一些實施方式中，使得另外的核酸鏈與切割位點雜交，以便確保由限制酶的適當的識別和切割可為必需的。在一些實施方式中，切割位點包含3’ -S-硫代磷酸酯鍵。已顯示，含有3’ -S-硫代磷酸酯鍵的DNA可通過DNA與含有碘和嘧啶的水溶液接觸來切割。見Vy I e等人，Biochemistry, 1992,31:3012。由此，在一些實施方式中，具有包含是在核酸中正常發(fā)現的磷酸二酯鍵的類似物的連接的切割位點可有用。在其他實施方式中，切割位點包含光切割性基團。光切割性基團為本領域所知。(見例如，美國專利N0.5，919，917)。光切割性基團通過在適當的波長用光照射預定的時間來光化學切割，由此切割含有光切割性基團的多核苷酸中的預定的鍵。因此，光切割允許環(huán)狀寡核苷酸為線性寡核苷酸。例如，使對DNA的光解切割具有催化性活性的光敏texaphyrin或texaphyr in-綴合物與寡核苷酸接觸,及然后使texaphyr in暴露于光足夠切割寡核苷酸的時間。(見，例如，美國專利N0.5，607，924)。探針構型本文所述的組分可以各種方式組合。在一些實施方式中，第I連接探針但非第2連接探針包含切割位點。在一些實施方式中，第2連接探針，但非第I連接探針包含切割位點。在一些實施方式中，第I連接探針包含第I切割位點，第2連接探針包含第2切割位點，及第I和第2切割位點可為相同的或不同的。當第I靶結構域在第2靶結構域的5’時，第I和第2切割位點的使用是尤其有用的；此可進行，以確保僅引物對和地址序列擴增。因此，在一些實施方式中，第I連接探針依次包含:(i)地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域，(iii)與第I祀結構域互補的第I雜交結構域及(iv`)詢問核苷酸；及第2連接探針依次包含:(i)與第2祀結構域互補的第2雜交結構域，(ii)切割位點及(iii)第2引發(fā)結構域。在一些實施方式中，第I連接探針依次包含:(i)地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域，(iii)切割位點，(iv)與第I祀結構域互補的第I雜交結構域及(V)詢問核苷酸；及第2連接探針依次包含:(i)與第2靶結構域互補的第2雜交結構域及(ii)第2引發(fā)結構域。在一些實施方式中，第I連接探針依次包含:(i )地址序列，(ii )第I引發(fā)結構域，(iii )第I切割位點，(iv)與第I祀結構域互補的第I雜交結構域及(V)詢問核苷酸；及第2連接探針依次包含:
(i)與第2祀結構域互補的第2雜交結構域，(ii)第2切割位點及(iii)第2引發(fā)結構域?！耙来巍敝阜Q5’到3’方向或3’到5’方向，及不排除不變化特定的順序的另外的元件。在一些實施方式中，使用另外的連接探針，其除了具有不同地址序列和不同詢問核苷酸之外與第I連接探針相同。另外的連接探針可或可不包含切割位點。另外的連接探針會在多個包含詢問核苷酸的探針存在于樣品中及競爭結合相同的位點的測定中有用。因此，在例示實施方式中，第3連接探針依次包含:(i)第2地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域，(iii)與第I祀結構域互補的第I雜交結構域及(iv)第2詢問核苷酸。在例示實施方式中，第3連接探針依次包含:(i)第2地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域，(iii)切割位點，(iv)與第I靶結構域互補的第I雜交結構域及(V)第2詢問核苷酸。在例示實施方式中，第4連接探針依次包含:(i)第3地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域，(iii)與第I靶結構域互補的第I雜交結構域及(iv)第3詢問核苷酸。在例示實施方式中，第4連接探針依次包含:(i)第3地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域，(iii)切割位點，(iv)與第I靶結構域互補的第I雜交結構域及(V)第3詢問核苷酸。在例示實施方式中，第5連接探針依次包含:(i)第4地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域，(iii)與第I祀結構域互補的第I雜交結構域及(iv)第4詢問核苷酸。在例示實施方式中，第5連接探針依次包含:(i )第4地址序列，(i i )第I引發(fā)結構域，(iii)切割位點，(iv)與第I祀結構域互補的第I雜交結構域及(V)第4詢問核苷酸。在例示實施方式中，各第3，第4或第5連接探針的詢問核苷酸和地址序列不同于其他及第I連接探針的詢問核苷酸和地址序列。本領域技術人員會明白，在本文的一些實施方式中，術語“第I引發(fā)結構域”和“與第I靶結構域互補的第I雜交結構域”可分別指稱第I引發(fā)結構域的拷貝和與第I靶結構域互補的第I雜交結構域的拷貝。在一些實施方式中，第I連接探針和第2連接探針在第I連接探針的地址序列和第2連接探針的第2引發(fā)結構域之間接合。得到的“開環(huán)”或“前環(huán)”探針可然后與一級靶序列雜交。開環(huán)探針中的切割位點可在(i)第I引發(fā)結構域和與第I靶結構域互補的第I雜交結構域之間，(ii)第2引發(fā)結構域和與第2靶結構域互補的第2雜交結構域之間或(iii) 二者。由此，在一些實施方式中，各含有獨特對的地址序列和詢問核苷酸的不同連接探針各接合到第2連接探針，產生包含特征地址序列和詢問核苷酸的多個開環(huán)探針。因此，在一些實施方式中，連接探針依次包含:(i)詢問核苷酸，( )與第I靶結構域互補的第I雜交結構域，(iii)第I引發(fā)結構域，(iv)第I地址序列，(V)第2引發(fā)結構域，(vi)切割位點及(vii)與第2祀結構域互補的第2雜交結構域。在一些實施方式中，連接探針依次包含:(i)詢問核苷酸，(ii)與第I祀結構域互補的第I雜交結構域，(iii)切割位點，(iv)第I引發(fā)結構域，(V)第I地址序列，(vi)第2引發(fā)結構域及(vii)與第2祀結構域互補的第2雜交結構域。在一些實施方式中，連接探針依次包含:(i)詢問核苷酸，(ii)與第I靶結構域互補的第I雜交結構 域，(iii)第I切割位點，(iv)第I引發(fā)結構域，(v)第I地址序列，(vi)第2引發(fā)結構域，(vii)第2切割位點及(viii)與第2祀結構域互補的第2雜交結構域。在一些實施方式中，連接探針不包含詢問核苷酸。尤其是，第I連接探針可與本文公開的第2連接探針使用，其中均不包含詢問核苷酸。這些探針可在本文所述的游離堿基測定中有用。因此，在一些實施方式中，第I連接探針依次包含:(i)地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域及(iii)與第IIE結構域互補的第I雜交結構域；及第2連接探針依次包含:(i)與第2祀結構域互補的第2雜交結構域，(ii)切割位點及(iii)第2引發(fā)結構域。在一些實施方式中，第I連接探針依次包含:(i)地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域，(iii)切割位點及(iv)與第I IE結構域互補的第I雜交結構域；及第2連接探針依次包含:(i)與第2革巴結構域互補的第2雜交結構域及(ii)第2引發(fā)結構域。在一些實施方式中，第I連接探針依次包含:(i)地址序列，(ii)第I引發(fā)結構域，(iii)第I切割位點及(iv)與第I祀結構域互補的第I雜交結構域；及第2連接探針依次包含:(i)與第2靶結構域互補的第2雜交結構域，(ii)第2切割位點及(iii)第2引發(fā)結構域。
類似地，在一些實施方式中，開環(huán)探針不包含詢問核苷酸。因此，在一些實施方式中，連接探針依次包含:(i)與第I祀結構域互補的第I雜交結構域，(ii)第I引發(fā)結構域，(iii)地址序列，(iv)第2引發(fā)結構域，(V)切割位點及(vi)與第2祀結構域互補的第2雜交結構域。在一些實施方式中，連接探針依次包含:(i)與第I靶結構域互補的第I雜交結構域，(ii)切割位點，(iii)第I引發(fā)結構域，(iv)地址序列，(V)第2引發(fā)結構域及(vi)與第2靶結構域互補的第2雜交結構域。在一些實施方式中，連接探針依次包含:(i)與第I革巴結構域互補的第I雜交結構域，(ii)第I切割位點，(iii)第I引發(fā)結構域，(iv)地址序列，(V)第2引發(fā)結構域，(vi)第2切割位點及(vii)與第2靶結構域互補的第2雜交結構域。在一些實施方式中,在本文的任何連接探針包含標記物。在例示實施方式中，標記物是結合標記物。在一些實施方式中，第I連接探針依次包含:(i)第I引發(fā)結構域，(ii)地址序列，(iii)第2引發(fā)結構域，(iv)第I雜交結構域,其互補于第I祀結構域及(V)詢問核苷酸；及第2連接探針包含:(i)第2雜交結構域，其互補于第2靶結構域及(ii)結合標記物。在一些實施方式中，第I連接探針依次包含:(i)第I引發(fā)結構域，(ii)地址序列，(iii)第2引發(fā)結構域及(iv)第I雜交結構域，其互補于第I祀結構域；及第2連接探針包含:(i)第2雜交結構域，其互補于第2靶結構域及(ii)結合標記物。術語“地址盒”可在本文用于指稱，依次，第I引發(fā)結構域，地址序列和第2引發(fā)結構域。另外的組分可為地址盒的部分，且可第I和第2引發(fā)結構域之間添加。雜交本文所述的連接探針設計為與靶序列雜交以形成雜交復合物?！半s交復合物”包含靶序列及一個或更多連接探針，且當連接探針的雜交結構域與靶序列的靶結構域雜交時形成。術語“雜交”是指形成穩(wěn)定的雙聯體?！半p聯”是指在全部或多數它們的核苷酸之中經歷Watson-Crick類型堿基配對的完全或部分互補的至少2個寡核苷酸。在一實施方式中，穩(wěn)定的雙聯體是未 被嚴格洗滌毀壞的雙聯結構，例如包括小于雙聯體鏈的Tm約5°C的溫度和低單價鹽濃度，例如小于0.2M，或小于0.1M的條件。術語“雙聯體”包括與核苷酸類似物，諸如脫氧肌苷，具有2- 二氨基嘌呤堿基的核苷，PNA，等配對。2個寡核苷酸之間的雙聯體的“錯配”指稱未經歷Watson-Crick鍵合的雙聯體的相反鏈中的一對核苷酸。在例示實施方式中，雜交結構域是與靶結構域完美互補。在一些實施方式中，雜交結構域是與靶結構域基本上互補。當一條鏈的核苷酸，最佳對齊及比較及具有適當的核苷酸插入或缺失，與其他鏈的至少約80%的核苷酸配對，通常至少約90% 95%，及更特別約98 100%時，2個單鏈RNA或DNA分子可說是“基本上互補”。一般而言，雜交結構域應具有不多于I或2個與靶未完美匹配的堿基(除了詢問核苷酸之外)。在一些情況中，例如，靶結構域可含有多于一個SNP位置，及探針組設計為允許雜交以查詢第ISNP位置和第2SNP位置，由此需要分別在第2或第I位置的錯配?；蛘?，當RNA或DNA鏈會在選擇性雜交條件下與其補體雜交時，實質性互補性存在。一般而言，當在至少約14 約25個核苷酸的延伸物上有至少約65%互補，特別至少約75%,更特別至少約90%互補時,選擇性雜交會發(fā)生。見,通常，M.Kanehisa, Nucleic AcidsRes.，2004，12:203。在一些實施方式中，雜交復合物包含一級靶序列和第I和第2連接探針，其中第I雜交結構域的末端核苷酸與第2雜交結構域的更近末端核苷酸被至少一個核苷酸隔開。在一些實施方式中，雜交復合物包含一級靶序列和第I和第2連接探針，其中第I雜交結構域的末端核苷酸與第2雜交結構域的末端核苷酸被I, 2, 3,4, 5或6個核苷酸隔開。在例不實施方式中，雜交復合物包含一級靶序列和第I和第2連接探針，其中第I雜交結構域的末端核苷酸與第2雜交結構域的末端核苷酸被2個核苷酸隔開。在一些實施方式中，雜交復合物包含一級靶序列和連接探針(例如，開環(huán)探針)，其中第I雜交結構域的末端核苷酸與第2雜交結構域的更近末端核苷酸被至少一個核苷酸隔開。在一些實施方式中，雜交復合物包含一級靶序列和連接探針(例如，開環(huán)探針)，其中第I雜交結構域的末端核苷酸與第2雜交結構域的末端核苷酸被1，2，3，4，5或6個核苷酸隔開。在例示實施方式中，雜交復合物包含一級靶序列和連接探針(例如，開環(huán)探針)，其中第I雜交結構域的末端核苷酸與第2雜交結構域的末端核苷酸被2個核苷酸隔開。連接雜交復合物可使經歷條件，使得第I和第2連接探針的端或相同的連接探針的端連接以形成連接的探針。即，連接可為分子內或分子間。連接探針一般在連接之前與靶序列雜交。在例示實施方式中，如果第I連接探針的詢問核苷酸與靶序列上的檢測核苷酸完美互補，第I和第2連接探針的端連接在一起。在一些實施方式中，詢問核苷酸與第2連接探針直接連接。在例示實施方式中，詢問核苷酸偶聯于一個或更多核苷酸，特別是一個核苷酸，及最后偶聯的核苷酸與第2連接探針連接。在一些實施方式中，如果詢問核苷酸與靶序列上的檢測核苷酸完美互補，連接探針的端連接在一起。在無連接探針在雜交復合物中包含詢問核苷酸的實施方式中，連接探針可被聚合酶延長，使得連接探針包含詢問核苷酸。詢問核苷酸可然后與第2連接探針連接或還偶聯于一個或更多核苷酸，最后 偶聯的核苷酸連接于第2連接探針。在雜交復合物包含連接探針的另一形式中，詢問核苷酸可然后連接于連接探針的另一端。在一些實施方式中，在使經歷延伸和/或連接一個或更多連接探針的端的條件后，使雜交復合物與核酸酶(例如外切核酸酶)接觸。在該時間使用核酸酶的一個原因是降解未成功地延伸和/或連接的連接探針。由此，在一些實施方式中，在本文的方法包括例如，在延伸步驟，連接步驟或二者后，移出或分離或降解(或其組合)未連接的連接探針(諸如未彼此連接的第I和第2連接探針，或未本身連接的連接探針)。連接可以各種方式實施。在例示實施方式中，使連接酶，諸如連接酶，與一種或更多連接探針接觸。在例示實施方式中，連接酶是T4DNA連接酶。T4DNA連接酶催化雙聯DNA或RNA中5’磷酸及3’羥基末端之間磷酸二酯鍵的形成。尤其是，T4DNA連接酶可封閉雙聯DNA，RNA或DNA/RNA雜交體中的單鏈切口。可實施此功能的任何連接酶可用于在本文的
方法。其他有用的連接酶的例包括Ampligase dna連接酶，小球藻病毒pbcv-1dna連
接酶，人DNA連接酶I和人DNA連接酶III。在一些實施方式中，將連接劑與一種或更多連接探針接觸。典型連接劑是已知實現核酸的“化學連接”的小(例如〈500D)分子。連接劑的例包括溴化氰(BrCN)，碳二亞胺，N-氛基咪唑，1-乙基-3-(3- 二甲基氛基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽，見Dolinnaya etal., Nucleic Acids Research, 1988, 16(9):3721-3738;and Shabarova et al., NucleicAcids Research, 1991, 19(15):4247-4251;Metelev et al., Nucleosides&Nucleotides(1999) 18:2711; Luebke and Dervan, J.Am.Chem.Soc.(1989) 111:8733。Kool (美國專利N0.7，033，753)描述使用化學連接和熒光共振能量轉移(FRET)以檢測遺傳多態(tài)性。其他化學連接方法使5’ -甲苯磺酸或5’ -碘基團與3’ -硫代磷酸酯基團反應，產生DNA結構，硫取代橋磷酸二酯氧原子之一。見 Gryanov, S.M.，and Letsinger, R.L., Nucleic AcidsResearch (1993)21:1403;Xu, Y.and Kool, E.T.Tetrahedron Letters (1997)38:5595;andXu, Y.and Kool, E.T., Nucleic Acids Research (1999) 27:875。見也就本領域知道的其他化學連接技術討論的US2008/0124810。由此，如果詢問核苷酸完美互補于在雜交復合物中的檢測核苷酸，可使雜交復合物經歷任何連接技術，諸如上述那些，以便連接一個或更多探針。延伸在一些實施方式中，一個或更多連接探針延長一個或更多核苷酸。在例不實施方式中，第I或第2連接探針在雜交復合物中與聚合酶及一個或更多dNTP (換言之，游離堿基或游離的核苷酸)接觸，由此延伸第I或第2連接探針一個或更多dNTP以形成延伸的第I或第2連接探針。在一些實施方式中,連接探針(諸如開環(huán)探針)與聚合酶及一個或更多dNTP接觸，由此延伸連接探針一個或更多dNTP以形成延伸的連接探針。通過采用除了連接步驟之外的延伸步驟，測定的特異性可在一些實例中增加，由于成功的延伸，例如，由于在一些實施方式中，在連接可在延伸的連接探針和本身或另一連接探針之間發(fā)生之前，需要詢問核苷酸與檢測位點的匹配。由此，在一些實施方式中，連接探針，諸如第I或第2連接探針，在連接步驟之前延伸一個或更多dNTP。在一些實施方式中，連接探針，諸如第I或第2連接探針，延長1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個核酸。在例示實施方式中，連接探針，諸如第I或第2連接探針，延長I個核酸。術語“填充”可與“延伸”同義，特別當探針延長I個核酸時。在一些實施方式 中，可延伸雜交復合物中連接探針的端，以包括一個或更多dNTP。在一些實施方式中，連接探針包含詢問核苷酸，及一個或更多dNTP隨附于詢問核苷酸。在例示實施方式中，包含末端詢問核苷酸的第I連接探針通過dNTP與末端詢問核苷酸結合來延伸。其可在這些實施方式中對于本文所述的雜交復合物與一種或更多不同dNTP接觸，各在分離容器中，然后為測定哪種dNTP已被合入連接探針有用，例如在詢問位置有單核苷酸間隔的情況中。本文所用的術語“容器”指稱任何物質用容器或容具。容器的一例是本領域明白的微陣列的孔?！熬酆厦浮?，如本文所用，指稱對于將游離的核苷酸共價結合到寡核苷酸有用的任何蛋白。許多聚合酶為本領域所知，且可根據聚合酶具有的活性或活性缺乏選擇。例如，聚合酶可根據是否其尤其是具有或缺乏5’ -3’外切核酸酶活性，3’ -5’外切核酸酶活性，鏈位移活性或加熱活化/滅活能力來選擇。在一些實施方式中，聚合酶缺乏鏈位移活性，缺乏外切核酸酶活性或二者。在例示實施方式中，聚合酶具有3’-5’外切核酸酶活性,缺乏5’-3’外切核酸酶活性及缺乏鏈位移活性。延伸中使用的例示聚合酶，例如在連接之前，是T4聚合酶。如本文所述，在一些實施方式中為延伸使用的聚合酶可不同于為核酸產物，諸如二級靶序列的擴增使用的聚合酶。例如，T4聚合酶可用于延伸而TaqDNA聚合酶可用于擴增。環(huán)化已接合在一起而形成線性分子的第I和第2連接探針(“連接的探針”)可再次接合在一起而形成環(huán)化的探針。在例示實施方式中，連接的探針分離自靶序列，諸如一級靶序列，在環(huán)化之前。在例示實施方式中，使連接的探針與環(huán)化酶接觸。一種特別有用的環(huán)化酶是 CircLigase (Epicentre Biotechnologies)。CircLigase 催化具有 5’-憐酸和3’ -羥基的ssDNA模板或具有3’ -羥基核糖核苷酸和5’ -磷酸化的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸的單鏈寡核苷酸的分子內連接(即環(huán)化)。一般而言，可使用連接寡核苷酸，特別是單鏈分子，諸如ssDNA的5’和3’末端核苷酸的任何環(huán)化酶。在一些實施方式中，環(huán)化步驟不需要或實施。切割包含切割位點的探針可根據本領域知道的或在本文描述的方法切割。在切割位點切割探針，諸如環(huán)化的探針，包括使探針經歷有助于由鍵斷裂形成“二級靶序列”的任何條件。在例示實施方式中，二級靶序列依次包含:第I引發(fā)結構域，地址序列和第2引發(fā)結構域，有任何端上的任選的序列，諸如雜交結構域及有地址序列和任何引發(fā)結構域之間的任選的序列。切割探針可包括，例如，使探針與酶接觸；使探針暴露于電離輻射，提升的溫度，堿性或酸性條件，或導致在切割位點鍵斷裂的一種或更多化學試劑；或本文所述的這些和其他方法的任何組合。如上所述，使附加序列與切割位點雜交以形成雙鏈位點而作為用于識別和/或切割的底物可為必需的。在例示實施方式中，將環(huán)化的探針與內切核酸酶，諸如內切核酸酶V接觸。在切割位點切割環(huán)化的探針會導致線性分子(例如，二級靶序列)，及此步驟有時被稱為“線性 化”或“再線性化”。捕獲在一些實施方式中，由附接于固體支持物的捕獲配體捕獲分子可為有用的?？墒褂脧V泛數的適合的支持物，依賴于測定的復雜性；即，檢測多少不同地址/SNP。可在測定中的任何點實施捕獲步驟，捕獲的分子可為實施的方法產生的任何分子。在捕獲之后，將支持物洗滌，及還使各種捕獲的物質經歷另外的步驟，例如，擴增和/或檢測。由捕獲配體捕獲的分子一般包含與捕獲配體結合的結合標記物。在一些實施方式中，一種或更多連接探針，諸如第I或第2連接探針,包含結合標記物。在例示實施方式中,連接探針,諸如第2連接探針，包含雜交結構域(諸如第2雜交結構域，其互補于第2靶結構域)和結合標記物，及在特定實施方式中在使連接探針經歷連接步驟之前不包含地址序列或地址盒。在一些實施方式中，第2連接探針包含:(i)結合標記物及(ii)第2雜交結構域，其互補于第2靶結構域連接于第I連接探針，其包含:(i)地址盒及(ii)第I雜交結構域，其互補于第I靶結構域，以提供二級靶序列。常常，不會發(fā)生與一級靶序列雜交而形成二級靶序列的第I和第2連接探針的連接，除非核苷酸與一級靶序列中的檢測核苷酸形成互補堿基對。二級靶序列然后由附接于固體支持物的捕獲配體捕獲，然后檢測。任選地，二級靶序列在檢測之前擴增。在此及其他情況中，洗滌固體支持物，以便消除包含地址序列或盒但未成功地連接于包含結合標記物的探針的物質會是有用的。由此，這些實施方式例示捕獲及洗滌步驟如何可用于測定是否2種探針已成功地連接。擴增由本文所述的方法形成的二級靶序列可直接檢測。但是，其在擴增部分二級靶序列，以便，例如，為改善的檢測產生多個拷貝(即.“三級靶序列”，也被稱為“擴增子”)的一些情況中可為期望的。由此，在一些實施方式中，擴增地址序列。引發(fā)結構域對通常應關于二級靶序列上的地址序列定向，使得僅引發(fā)結構域，弓I物結構域對之間的任何序列和其任何補體可擴增。此外，選擇引物對，以便確保僅引發(fā)結構域，引物結構域對之間的任何序列，及其任何補體可擴增可為必需的。在例示實施方式中，與在地址位點的5’的引發(fā)結構域雜交的引物(即，5’地址引物)與引發(fā)結構域具有相同的5’ -3’序列。在例示實施方式中，與在地址位點的3’的引發(fā)結構域雜交的引物(即，3’地址引物)是引發(fā)結構域的反向互補體；換言之，3’地址引物的5’ -3’序列是引發(fā)結構域的3’ -5’序列的補體。在例示實施方式中，包含部分一級靶序列(例如，雜交結構域)或一級靶序列的補體的序列未擴增。換言之，在例示實施方式中，三級靶序列不互補(完美，基本上或另外)于一級靶序列(諸如基因組DNA)或其補體。擴增部分二級靶序列(諸如地址序列)以獲得一個或更多三級靶序列可通過任何領域知道的方法，諸如聚合酶鏈反應(PCR)實現。可使用本文所述的或本領域知道的聚合酶。在例示 實施方式中，聚合酶具有5’ -3’外切核酸酶活性。在例示實施方式中，聚合酶缺乏鏈位移活性。在例示實施方式中，聚合酶具有5’ -3’外切核酸酶活性及缺乏鏈位移活性。該聚合酶可用于確保線性化失效了的環(huán)化的探針(例如，切割位點的缺乏)不會擴增。特別有用的聚合酶是Taq DNA聚合酶。在一些實施方式中，二級靶通過使用乳劑PCR擴增。乳劑PCR沿著油相之內的水滴中引物-包被的珠分離多核苷酸分子。聚合酶鏈反應(PCR)然后用多核苷酸分子的克隆拷貝包被各珠，之后是固定用于由，例如，測序隨后分析。本領域技術人員可利用的乳劑PCR的任何方法可在本發(fā)明的方法中使用(見，例如，Hori et al.(2007)Biochem Biophys ResCommun.352:323-8;Xu et al.(2010)Biotechniques.48:409-12;WiIliams et al.(2006)Nat Methods.3:545-50;Nakano et al.(2003)J Biotechnol.102:117-24)。檢測靶序列，尤其是衍生靶序列諸如三級靶序列，可通過本領域技術人員知道的各種測定，方法和檢測系統檢測或測量。術語“測量”，“檢測”或“測量”指稱實體的性質或特征的定量或定性確定，例如，定量分子的量或活性水平或測定分子的缺失或存在。各種方法包括但不限于紫外(UV)光譜學，近紅外線(接近-1R)光譜學，紅外線(IR)光譜學，可見光譜學，折射率(RI)光譜學，熒光光譜學，比色法，核磁共振光譜學(NMR)，分散拉曼光譜學，光散射分析(LS)，質量光譜法(MS)(諸如飛行MS的矩陣-輔助的激光解吸電離-時間(MALD1-TOF MS)，熱解MS，離子噴射MS)，氣相層析(任選地與質量光譜法組合)，液相層析(任選地與質量光譜法組合)，電泳(諸如毛細管或凝膠電泳)，放射化學分析和表面等離子體共振(諸如根據由Biacore Life Sciences提供的系統)和比池法。本領域新發(fā)現或知道的序列，諸如保存在序列數據庫或商業(yè)上提供的那些，可用于構建用于各種檢測方法的探針和引物。由此，在本文提供的是探針組包含用于檢測靶序列的多個探針或由其組成。本文提供的也是引物組包含用于檢測靶序列的多個探針或由其組成。如下進一步定義，“特異性結合”或“選擇性地結合”或對于物質“選擇性”的配體是指配體以足夠區(qū)分物質和樣品的其他組分或混雜物的特異性結合該物質。在一些實施方式中，以溶液形式進行檢測靶序列的測定。在一些實施方式中，使用端-點或實時PCR形式，如本領域所熟知。這些測定可作為一組，在個體管或孔中，或作為多重測定，使用引物組和單管或孔之內的不同標記物進行。也可使用依賴于使用FRET探針或嵌入染料諸如SYBR Green的5’核酸酶測定的qPCR技術。除了基于PCR的溶液形式之夕卜，可利用其他形式，包括，例如，利用FRET染料對的基于連接的測定。在此實施方式中，僅在與靶序列雜交的2種(或更)探針連接后產生信號。在例示實施方式中，檢測靶序列的測定利用陣列進行。陣列可分為2大類基于表面的多重平臺:使用固定的平面表面的那些(固定的陣列，有時被稱為芯片或生物芯片)和基于粒子的那些(液體陣列)。在固定的陣列平臺中，在共享的，一般測定通過位置鑒定的2-維矩陣上實施測定。在液體陣列平臺中，各測定在分離的支持物，諸如珠上實施，其可由一些非位置的特征性，諸如熒光頻度鑒定。在任何情況中，檢定系統包括包含捕獲配體(也被稱為吸附劑，親和性試劑或結合配體，或當測量核酸時，捕獲探針)的基材或固體支持物。術語“固體支持物”或“底物”指稱對于捕獲結合配體的附接或關聯適當的任何物質。適合的底物包括金屬表面諸如金，電極，玻璃及修飾的或官能化的玻璃，塑料(包括丙烯酸脂類，聚苯乙烯和苯乙烯和其他物質的共聚物，聚丙烯，聚乙烯，聚丁烯，聚碳酸酯，聚氨基甲酸酯，特氟隆，其衍生物，等)，多糖，尼龍或硝酸纖維素，樹脂，云母，氧化硅或基于氧化硅的物質包括硅及修飾的硅，碳，金屬，無機玻璃，纖維玻璃，陶瓷，GETEK (聚丙烯氧化物和纖維玻璃的混合物)和各種其他聚合物。在一些實施方式中，固體支持物被修飾為含有離散個體位點。生物芯片表面由此可包含多個可尋址的位置，各包含捕獲結合配體?！瓣嚵形恢谩保翱蓪ぶ返奈恢谩?，“墊”或“位點”是指包含共價附接的捕獲配體的基材上的位置。陣列可以規(guī)則，有序的形式，諸如矩陣包含多個捕獲配體。陣列也可包括對照，標記物的復本等。在一些實施方式中，也可制造包含單捕獲配體的組合物。此外，在一些陣列中，可使用不同或同一組合物的多個基材。由此，例如，大陣列可包含多個更小基材?？墒褂帽绢I域知道的許多不同生物芯片陣列平臺。例如，本發(fā)明的組合物和方法可用陣列平臺諸如 GeneCh ip (Affymetrix), CodeLink Bioarray (Amersham),表達陣列系統(Applied Biosystems), SurePrint 微陣列(Agilent), Sentrix LD BeadChip 或 Sentrix陣列矩陣(Illumina)和Verigene (Nanosphere)實施。在例示實施方式中,包括使用液體陣列，例如，xMAP (Luminex Corp.)或Arrayable液體陣列平臺，基于編碼的可分選的粒子(ESP)技術(諸如由Arrayomics提供的)的檢測祀序列的存在。捕獲探針或捕獲結合配體可，例如，經官能團，諸如附接于表面諸如硅烷化的玻璃的氨基，羥基或氫硫基共價附接于表面?；蛘?，可利用非共價附接，諸如靜電，疏水/親水粘接。如由本領域技術人員同意，在廣泛的表面上大量的附接是可能的。例如對于測量核酸有用的平臺和方法，見美國專利申請公開N0.2006/0275782和2005/0064469。說到“結合配體”，“捕獲結合配體”，“捕獲結合物質”，“捕獲探針”或“捕獲配體”在本文是指會與靶分析物，靶物質或靶序列(全部互換使用)結合，以便檢測靶分析物，靶物質或靶序列的存在或相對或絕對定量，靶分析物，靶物質或靶序列的化合物。在例示實施方式中，捕獲結合配體或捕獲探針允許為本文進一步所述的檢測目的將靶物質或靶序列附接于固體支持物。靶物質附接于捕獲結合配體可為直接或間接。在例示實施方式中，靶物質是靶序列，諸如二級，三級或其他衍生靶序列。本領域技術人員會同意，結合配體的組成會依賴于靶序列的組成。用于廣泛的物質的結合配體知道或可通過使用知道的技術容易發(fā)現。結合配體包括蛋白(特別包括抗體或其片段(FAbs,等)如下進一步討論)或小分子。結合配體也可與其他物質的蛋白具有交叉反應性?？乖?抗體對，受體-配體和碳水化合物和它們的結合偶體也是適合的分析物-結合配體對。在例示實施方式中，結合配體可為核酸。如總描述于美國專利 N0.5，270，163 ;5，475，096 ;5，567，588 ;5，595，877 ;5，637，459 ;5，683，867 ；5，705，337及相關的專利，可開發(fā)核酸“適體”用于與實際上是任何靶結合。有與基于組合的化學方法的結合偶體的開發(fā)相關的廣泛的文獻。見，例如，國際公開No。W01998/020162。捕獲探針可直接結合靶序列，其可任選地結合到一種或更多另外的組分，諸如標記物或信號探針。在該“夾層”測定的一些實施方式中，捕獲探針結合到靶序列的第I結構域，標記物探針結合到靶序列的第2結構域?；蛘?，捕獲探針可通過使用另外的探針，諸如可溶性結合配體或可溶性捕獲配體而間接結合到靶序列。例如，捕獲探針可結合可溶性結合配體的第I結構域，靶序列可結合可溶性結合配體的第2結構域。常常，檢測“標記物”或“報告子”，以便測定樣品中靶序列的存在。標記物是致使檢測化合物的原子或分子。在一些實施方式中，標記物直接結合(例如，經共價，離子或氫鍵，或范德華相互作用)到靶序列。在一些實施方式中，標記物間接結合(例如，經分子)到靶序列。在一些實施方式中，標記物與指示靶序列存在的一個或更多分子直接或間接結合。可檢測由包含標記物及一種或更多分子的“信號傳導復合物”產生的信號，以提供作為目標分子，諸如一級靶序列的存在的指示。一般而言，標記物落入4類:(a)同位素標記物，其可為放射性或重同位素；(b)磁，電，熱；(C)發(fā)光染料；及((1)酶；盡管標記物也包括粒子諸如磁粒子。染料可為生色團或磷光體，但在特定實施方式中是熒光染料，因為它們的強信號提供用于解碼的良好信號-噪音比。用于在本發(fā)明中使用的適合的染料包括，但不限于，熒光鑭系元素絡合物，包括銪和鋱的那些，熒光素，若丹明，四甲基若丹明，伊紅，赤蘚紅，香豆素，甲基_香豆素,花,Malacite綠,苗,Lucifer黃,級聯藍,德克薩斯紅,Alexa染料和其他描述于Molecular Probes Handbook(6th ed.)by Richard P.Haugland 的。另外的標記物包括描述于美國專利N0.6，544，732的納米晶體或Q-點。標記物可為主要或二級標記物。主要標記物產生可直接檢測的可檢測的信號。例如，引物或在擴增可期間合并的dNTP上的標記物是主要標記物，諸如熒光團。或者，標記物可為二級標記物，諸如生物素或酶。二級標記物需要導致可檢測的信號產生的另外的試劑。二級標記物是間接檢測的標記物；例如，二級標記物可與用于檢測的主要標記物結合或反應，可作用于另外的試劑而產生主要標記物，或可允許包含來自未標記的物質的二級標記物的化合物，等的分離。二級標記物包括，但不限于，結合偶體對之一，諸如生物素；結合偶體對；化學可修飾的部分；核酸酶抑制物；酶諸如辣根過氧化物酶；堿性磷酸酶；螢光素酶，等ο在一些實施方式中，信號傳導復合物是夾層形式，其中靶未標記。在這些實施方式中，信號傳導復合物，其包含:(i)附接于支持物的捕獲配體，( )與捕獲配體結合的靶及(iii)與靶獨立地結合的及直接或間接包含一個或更多標記物的“信號探針”或“標記物探針”。在這些實施方式中，標記物探針可包含一級(例如熒光團)或二級(生物素或酶)標記物。在一些情況中，標記物探針包含生物素，其然后結合到鏈霉親和素-酶(例如包含辣根過氧化物酶)綴合物及隨著沉淀劑，諸如3，3’，5，5’ -四甲基聯苯胺(ΤΜΒ)，ο-二茴香胺(3，3' -二甲氧基聯苯胺(二鹽酸鹽)，Fast Blue B的添加而形成著色的沉淀物)等。此實施方式具有特定益處，即檢測用光學不需要使用熒光計或其他檢測器，其可添加到實施方法消費中。在一些實施方式中，酶諸如辣根過氧化物酶直接綴合到標記物探針。在一些實施方式中，信號傳導復合物包含結合偶體對。適合的結合偶體對包括，但不限于:抗原(諸如多肽)和抗體(包括其片段(FAbs，等))；其他多肽和小分子，包括生物素/鏈霉親和素；酶和底物或抑制物；其他蛋白-蛋白相互作用對；受體-配體；及碳水化合物和它們的結合偶體。核酸-核酸結合蛋白對也是有用的。在特定實施方式中，結合偶體對包括，但不限于，生物素(或亞氨基-生物素)和鏈霉親和素，地高辛配基和Abs，及Prolinx 試劑。在一些實施方式中，連接探針包含二級標記物，諸如生物素。在例示實施方式中，使包含二級標記物諸如生物素的連接探針與包含針對二級標記物，諸如鏈霉親和素的結合偶體的固體支持物接觸。由此形成的復合物可洗滌及含有生物素的部分可用于進一步測定。如本文所用，術語“熒光信號產生部分”或“熒光團”指稱在一種波長吸收能量且在另一波長再發(fā)射能量的分子或分子的部分?？蓽y量的熒光性質包括熒光強度，熒光壽命，發(fā)射光譜特征，能量轉移等?？僧a生來自單分子的信號及由許多檢測系統，包括但不限于掃描電子顯微鏡檢，近場掃描光學顯微鏡檢(NS0M),總內部反射突光顯微鏡檢(TIRFM)，等檢測。豐富的指導見于將該技術應用于分析及檢測表面上的納米尺度結構的文獻，如由通過引用合并的以下參考文獻證明:Reimer et al, editors, ScanningElectron Microscopy:Physics of Image Formation and Microanalysis, 2ndEdition(Springer, 1998);Nie et al, Anal.Chem.，78:1528-1534(2006);Hecht etal, Journal Chemical Physics, 112:7761-7774(2000);Zhu et al, editors, Near-FieldOptics!Principles and Applications(World Scientific Publishing, Singapore, 1999);Drmanac, W02004/076683;Lehr et al, Anal.Chem., 75:2414-2420(2003);Neuschafer et al, Biosens ors&Bioelectronics, 18:489-497 (2003) ；Neuschafer et al,美國專利N0.6，289，144 ;等。由此，用于熒光團的檢測系統包括可用于測量以上討論的熒光性質的任何裝置。在各種實施方式中，檢測系統包含激發(fā)源，熒光團，用于自激發(fā)光子分離發(fā)射光子的波長濾器和寄存發(fā)射光子及產生可記載的輸出，在一些實施方式中為電信號或攝影像的檢測器。檢測裝置的例包括無限制地分光熒光計和酶標儀，熒光顯微鏡，熒光掃描儀(包括例如微陣列讀取器)和流式細胞儀。在一些實施方式中，如果其由可檢測的差異表征，分子可被認為標記的。例如，“尺寸標記物”是在尺寸上與另一分子不同的分子。尺寸標記物可通過檢測或測量尺寸差異，諸如通過質量光譜法或電泳來區(qū)別。任何本領域知道的許多分析系統可用于此目的。例如，LabChip GX/GXII (Caliper Life Sciences), 3130 遺傳分析儀和其他分析儀系統(AppliedBiosystems), PA800+ (Beckman Coulter), MegaBACE (GE Healthcare),及 2100 生物分析儀(Agilent)具有對于分析物分離和遺傳分析有用的電泳能力。在本發(fā)明中有用的捕獲結合配體可對于它們的靶為“選擇性”的，“特異性結合”或“選擇性地結合”的。如果捕獲結合配體，相比不同捕獲結合配體以更高結合常數或更低解離常數與靶結合，捕獲結合配體對靶是選擇性的。一般而言，特異性或選擇性結合可區(qū)別于非特異性或非-選擇性結合，當解離常數(Kd)小于約10_5M，小于約10_6M，小于約10_7M，小于約10_8M，小于約10_9M，小于約ΙΟ,Μ，小于約，小于約10_ηΜ，小于約10_12Μ，小于約10_13Μ，小于約IO-14M,或小于約IO-15M0特異性結合可，例如，由ELISA，免疫沉淀，共沉淀，有或無化學交聯，2-雜交體檢定等檢測。適當的對照可用于區(qū)別特異性和非特異性結合。對靶核酸“選擇性地結合”(即，是“互補”或“基本上互補”)或“選擇性”的捕獲探針可在本發(fā)明中使用。“互補”或“基本上互補”指稱核苷酸或核酸之間，諸如，例如，雙鏈DNA分子的2條鏈之間或寡核苷酸引物和單鏈核酸上的引發(fā)結構域之間的雜交或堿基配對或雙聯體形成；這些術語已在以上定義。試劑盒在本文提供的是用于實施任何本文公開的方法的試劑盒。試劑盒可包含便攜載體，諸如箱，盒，管等，其中緊密具有一個或更多容器，諸如瓶，管，安瓿，瓶，袋，包膜等。在各種實施方式中，試劑盒包含選自一種或更多培養(yǎng)基或培養(yǎng)基成分和用于實施本文公開的基因分型方法的試劑的一種或更多組分。例如，本發(fā)明的試劑盒也可，在相同的或不同容器中，以任何組合，包含一種或更多酶(例如聚合酶，核酸酶，連接酶等，以任何組合)，一種或更多引物，一種或更多探針，一種或更多結合配體，一種或更多緩沖劑，一種或更多核苷酸(諸如脫氧核苷三磷酸(dNTP)及標記的dNTP)，一種或更多可檢測的標記物和標記物及一種或更多固體支持物，其中任何均在本文所述。組分可含有在相同的容器之內，或可在待在使用之前混合的分離的容器中。試劑盒也可包含用于實施本文公開的方法的一個或更多使用說明或流程。試劑盒可包含用于通過結合樣品使用本發(fā)明的組分產生的檢測信號的檢測器。試劑盒也可包含計算機或計算機組分，諸如計算機-可讀性存儲介質或裝置。存儲介質的例包括，無限制地，光盤諸如⑶，DVD和藍光盤(BD);磁-光盤；磁培養(yǎng)基諸如磁帶和內部硬盤和可移出的盤；半-導體記憶裝置諸如EPROM，EEPROM和快擦寫存儲器；及RAM。任何存儲介質可轉化(例如，電磁)以包含可由計算機解析以輔助由本文所述的各種物質產生的分析信號的軟件。一般而言，任何本文公開的方法可包括使用本文公開的任何試劑盒(包括引物，探針，標記物，配體 ，試劑和固體支持物，以任何組合)。測定形式競爭性連接本文所述的組分可以各種組合使用，以用許多不同方式檢測一級靶序列。圖1，2，5和6顯示如何實施“競爭性連接”測定的例。包含不同詢問核苷酸的多個不同連接探針競爭結合給定目標。當連接探針包含在雜交復合物中與檢測核苷酸形成互補堿基對的詢問核苷酸時，2個連接探針的端之間或相同的連接探針端之間(例如，與前環(huán)探針)發(fā)生連接。競爭性連接測定可在相同的容器中使用由詢問核苷酸不同的多個第I連接探針實施。在圖1中，一級靶序列100包含檢測核苷酸101，第I靶結構域102和第2靶結構域103。第I連接探針110包含地址序列111，第I引發(fā)結構域112，第I雜交結構域113和詢問核苷酸114。第2連接探針120包含第2雜交結構域121，切割位點122和第2引發(fā)結構域123。第I雜交結構域113與第I靶結構域102互補由此雜交。第2雜交結構域121與第2靶結構域103互補由此雜交。雜交復合物140由此形成。因為詢問核苷酸114和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，連接可在詢問核苷酸114到第2連接探針120的接近端之間發(fā)生。連接后，連接的探針150的端接合而形成環(huán)化的探針160。環(huán)化的探針160然后在切割位點切割而產生二級靶序列170。部分二級靶序列170通過使用5’引物171和3’引物172擴增而產生三級靶序列180，其可如本文所述標記及檢測。在雜交復合物141中，第I連接探針130包含地址序列115(不同于地址序列111)和詢問核苷酸116，其不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此無連接發(fā)生。環(huán)狀物質191不線性化及未擴增，如果使用，例如，具有5’ -3’外切核酸酶活性及缺少鏈位移活性的聚合酶。環(huán)狀物質192線性化為物質193，其未擴增，因為用于擴增的5’引物與第2引發(fā)結構域具有相同的序列，且因此不會結合。地址序列115未擴增。圖2顯示與圖1中顯示的相同的通用的測定，除了一級靶序列100的第I靶結構域102在第2靶結構域103的5’之外。通過第I和第2連接探針與一級靶序列雜交而形成雜交復合物240。因為詢問核苷酸114和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，連接可發(fā)生而形成連接的探針250。連接后，連接的探針250的端接合而形成環(huán)化的探針260。環(huán)化的探針260然后在切割位點切割而產生二級靶序列270。部分二級靶序列270通過使用5’引物271和3’引物272擴增而產生三級靶序列280，其可如本文所述標記及檢測。三級靶序列280會形成大多數擴增產物。在雜交復合物241中，第I連接探針130包含地址序列115(不同于地址序列111)和詢問核苷酸116，其不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此無連接發(fā)生。環(huán)狀物質292不線性化及未擴增，如果，例如，使用具有5’ -3’外切核酸酶活性及缺少鏈位移活性的聚合酶。環(huán)狀物質291線性化為物質293及擴增，但擴增子294缺乏地址序列，且在例示實施方式中不會被檢測到。圖5顯示開環(huán)探針510與一級靶序列100雜交的競爭性連接測定。因為雜交復合物540中詢問核苷酸114和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，詢問核苷酸114可連接于開環(huán)探針510的另一端，由此形成圓形探針550。圓形探針550然后在切割位點切割而產生二級靶序列560。部分二級靶序列560通過使用5’引物561和3’引物562擴增而產生三級靶序列570，其可如本文所述標記及檢測。在雜交復合物541中，開環(huán)探針520包含地址序列115 (不同于地址序列111)和詢問核苷酸116，其不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此無連接發(fā)生。開環(huán)探針511由此，例如，通過經外切核酸酶降解來自樣品移出。地址序列115由此不擴增。圖6顯示與圖5顯示的相同的通用的測定，除了靶序列100的第I靶結構域102在第2靶結構域103的5’之外。通過圓形探針510與一級靶序列100雜交來形成雜交復合物640。因為詢問核苷酸114和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，連接可發(fā)生而形成圓形探針650。圓形探針650然后在切割位點切割而產生二級靶序列660。部分二級靶序列660通過使用5’引物661和3’引物662擴增而產生三級靶序列670，其可如本文所述標記及檢測。三級靶序列670會形成大多數擴增產物。在雜交復合物641中，開環(huán)探針520包含地址序列115 (不同于地址序列111)和詢問核苷酸116，其不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此無連接發(fā)生。開環(huán)探針520由此，例如，通過經外切核酸酶降解來自樣品移出。地址序列115由此不擴增。圖13顯示一類競爭性連接測定，其中一種探針包含地址盒和另一探針包含結合標記物。此實施方式還在以下進一 步描述。競爭性延伸和連接
圖3，4，7和8顯示如何實施競爭性延伸和連接測定的例。包含不同詢問核苷酸的多個不同連接探針競爭結合給定目標。在一些實施方式中，詢問核苷酸延長一個或更多核苷酸(例如由聚合酶)。在一些實施方式中，連接探針，例如在雜交結構域的端，延長一個或更多核苷酸。在任何一種情況中，當連接探針包含在雜交復合物中與檢測核苷酸形成互補堿基對的詢問核苷酸時，連接在2個連接探針端之間或相同的連接探針的端之間發(fā)生。競爭性延伸和連接測定可在相同的容器中使用由詢問核苷酸不同的多個連接探針實施。在圖3中，一級靶序列300包含檢測核苷酸101，第I靶結構域102，第2靶結構域103和靶延伸結構域301。第I連接探針110包含地址序列111，第I引發(fā)結構域112，第I雜交結構域113和詢問核苷酸114。第2連接探針120包含第2雜交結構域121，切割位點122和第2引發(fā)結構域123。第I雜交結構域113與第I靶結構域102互補由此雜交。第2雜交結構域121與第2靶結構域103互補由此雜交。雜交復合物340由此形成。因為詢問核苷酸114和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，聚合酶可用與靶延伸結構域301互補的堿基對延伸第I連接探針110，形成延伸的第I連接探針350。延伸的第I連接探針350的末端核苷酸連接于第2連接探針的接近端而形成連接的探針360。連接后，環(huán)化酶接合連接的探針360的端而形成環(huán)化的探針370。環(huán)化的探針370然后在切割位點切割而產生二級靶序列380。部分二級靶序列380通過使用5’引物381和3’引物382擴增而產生三級靶序列390，其可如本文所述標記及檢測。在雜交復合物341中，第I連接探針130包含地址序列115(不同于地址序列111)和詢問核苷酸116，其不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此無延伸和無連接發(fā)生。環(huán)狀物質391不線性化及未擴增，如果，例如，使用具有5’ -3’外切核酸酶活性及缺少鏈位移活性的聚合酶。環(huán)狀物質392線性化為物質393，其未擴增，因為用于擴增的5’引物與第2引發(fā)結構域具有相同的序列，因此不會結合。地址序列115未擴增。圖4顯示與圖3中顯示的相同的通用的測定，除了一級靶序列300的第I靶結構域102在第2靶結構域103的5’之外。聚合酶可用與靶延伸結構域301互補的堿基對延伸第2連接探針120，形成延伸 的第2連接探針450。因為詢問核苷酸114和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，延伸的第2連接探針450的端連接于第I連接探針的接近端，形成連接的探針460。連接后，環(huán)化酶接合連接的探針460的端而形成環(huán)化的探針470。環(huán)化的探針470然后在切割位點切割而產生二級靶序列480。部分二級靶序列480通過使用5’引物481和3’引物482擴增而產生三級靶序列490，其可如本文所述標記及檢測。三級靶序列490會形成大多數擴增產物。在雜交復合物441中，第2連接探針120用與靶延伸結構域301互補的堿基對延伸，形成延伸的第2連接探針450。第I連接探針130包含地址探針115 (不同于地址序列111)和詢問核苷酸116，其不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此無連接發(fā)生。環(huán)狀物質492不線性化及未擴增，如果，例如，使用具有5’ -3’外切核酸酶活性及缺少鏈位移活性的聚合酶。環(huán)狀物質491線性化為物質493及擴增，但擴增子494缺乏地址序列，且在例示實施方式中不會被檢測到。圖7顯示競爭性延伸和連接測定，其中開環(huán)探針510與一級靶序列300雜交。因為雜交復合物740中詢問核苷酸114和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，聚合酶可自詢問核苷酸114，用與靶延伸結構域104的互補堿基配對延伸開環(huán)探針510，形成延伸的開環(huán)探針750。延伸的開環(huán)探針750的端可連接于探針的另一端，形成圓形探針760。圓形探針760然后在切割位點切割而產生二級靶序列770。部分二級靶序列770通過使用5’引物771和3’引物772擴增而產生三級靶序列780，其可如本文所述標記及檢測。在雜交復合物741中，開環(huán)探針520包含地址探針115 (不同于地址序列111)和詢問核苷酸116，其不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此無延伸和連接發(fā)生。開環(huán)探針520，例如，通過經外切核酸酶降解而從樣品除去。地址序列115由此不擴增。圖8顯示與圖7中顯示的相同的通用的測定，除了靶序列100的第I靶結構域102在第2靶結構域103的5’之外。雜交復合物840通過開環(huán)探針510與一級靶序列300雜交而形成。聚合酶可延伸開環(huán)探針510，形成延伸的開環(huán)探針850。因為詢問核苷酸114和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，連接可發(fā)生而形成圓形探針860。圓形探針860然后在切割位點切割而產生二級靶序列870。部分二級靶序列870通過使用5’引物871和3’引物872擴增而產生三級靶序列880，其可如本文所述標記及檢測。三級靶序列880會形成大多數擴增產物。在雜交復合物841中，開環(huán)探針520用與靶延伸結構域301互補的堿基對延伸，形成延伸的開環(huán)探針851。開環(huán)探針520包含地址序列115 (不同于地址序列111)和詢問核苷酸116，其不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此無連接發(fā)生。開環(huán)探針520由此，例如，通過經外切核酸酶降解來自樣品移出。地址序列115由此不擴增。圖14顯示一類競爭性延伸和連接測定，其中一種探針包含地址盒和另一探針包含結合標記物。此實施方式還在以下進一步描述。游離堿基測定圖9，10，11和12顯示如何實施“游離堿基”或“游離的核苷酸”測定的例。在此實施方式中，無連接探針起初包含詢問核苷酸。測定通過將相同的連接探針但不同游離的核苷酸添加到獨立反應容器來 實施。連接探針任選地在地址序列上不同。當游離的核苷酸與檢測核苷酸形成互補堿基對時，延伸和連接可在2個連接探針的端之間或相同的連接探針的端之間發(fā)生。在圖9中，一級靶序列100包含檢測核苷酸101，第I靶結構域102和第2靶結構域103。第I連接探針110包含地址序列111，第I引發(fā)結構域112和第I雜交結構域113。第2連接探針120包含第2雜交結構域121，切割位點122和第2引發(fā)結構域123。第I雜交結構域113與第I靶結構域102互補由此雜交。第2雜交結構域121與第2靶結構域103互補由此雜交。雜交復合物940由此形成。因為游離的核苷酸G和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，聚合酶可用游離的核苷酸G延伸第I連接探針110。延伸的第I連接探針950的末端核苷酸然后連接于第2連接探針的接近端。連接后，環(huán)化酶接合連接的探針960的端而形成環(huán)化的探針970。環(huán)化的探針970然后在切割位點切割而產生二級靶序列980。部分二級靶序列980通過使用5’引物981和3’引物982擴增而產生三級靶序列990，其可如本文所述標記及檢測。在分離容器中，雜交復合物941包括包含不同于地址序列111的地址序列115的第I連接探針130。在一些實施方式中，全部容器使用具有相同的地址序列的相同的第I連接探針。游離的核苷酸T不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此不發(fā)生延伸和連接。探針然后環(huán)化。環(huán)狀物質991不線性化及未擴增，如果，例如，使用具有5’ -3’外切核酸酶活性及缺少鏈位移活性的聚合酶。環(huán)狀物質992線性化為物質993，其未擴增，因為用于擴增的5’引物與第2引發(fā)結構域具有相同的序列，因此不會結合。地址序列115由此不擴增。圖10顯示與圖9中顯示的相同的通用的測定，除了靶序列100的第I靶結構域102在第2靶結構域103的5’之外。游離的核苷酸G和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對允許形成延伸的第2連接探針1050。延伸的第2連接探針1050和第I連接探針之間的連接產生連接的探針1060，其環(huán)化而形成環(huán)化的探針1070。環(huán)化的探針1070然后在切割位點切割而產生二級靶序列1080。部分二級靶序列1080通過使用5’引物1081和3’引物1082擴增而產生三級靶序列1090，其可如本文所述標記及檢測。三級靶序列1090會形成大多數擴增產物。在分離的容器中，雜交復合物1041包括包含不同于地址序列111的地址序列115的第I連接探針130。在一些實施方式中，全部容器使用具有相同的地址序列的相同的第I連接探針。游離的核苷酸T不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此不發(fā)生延伸和連接。探針然后環(huán)化。環(huán)狀物質1092不線性化及未擴增，如果，例如，使用具有5’-3’外切核酸酶活性及缺少鏈位移活性的聚合酶。環(huán)狀物質1091線性化為物質1093及擴增，但擴增子1094缺乏地址序列，且在例示實施方式中不會被檢測到。圖11顯示游離堿基測定，其中開環(huán)探針1110與一級靶序列100雜交。因為游離的核苷酸G和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，聚合酶可用游離的核苷酸G延伸開環(huán)探針1110。延伸的開環(huán)探針1150的末端核苷酸可連接于探針的另一端，由此形成圓形探針1160。圓形探針1160然后在切割位點切割而產生二級靶序列1170。部分二級靶序列1170通過使用5’引物1171和3’引物1172擴增而產生三級靶序列1180，其可如本文所述標記及檢測。在分離的容器中，雜交復合物1141包括包含不同于地址序列111的地址序列115的開環(huán)探針1120。在一些實施方式中，全部容器使用具有相同的地址序列的相同的開環(huán)探針。游離的核苷酸T不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此不發(fā)生延伸和連接。開環(huán)探針1120，例如，通過經外切核酸酶降解而從樣品除去。地址序列115由此不擴增。圖12顯示與圖11中顯示的相同的通用的測定，除了靶序列100的第I靶結構域102在第2靶結構域103的5’之外。游離的核苷酸G和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對允許形成延伸的開環(huán)探針1260。延伸的開環(huán)探針1260的端的連接產生連接的探針1270。連接的探針1270然后在切割位點切割而產生二級靶序列1280。部分二級靶序列1280通過使用5’引物1281和3’引物1282擴增而產生三級靶序列1290，其可如本文所述標記及檢測。三級靶序列1290會形成大多數擴增產物。在分離的容器中，雜交復合物1241包括包含不同于地址序列111的地址序列115的第I連接探針130。在一些實施方式中，全部容器使用具有相同的地址序列的相同的第I連接探針。游離的核苷酸T不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此不發(fā)生延伸和連接。開環(huán)探針1120，例如，通過經外切核酸酶降解而從樣品除去。地址序列115由此不擴增。圖15和16顯示一類游離堿基測定，其中一種探針包含地址盒和另一探針包含結合標記物。此實施方式還在以下進一步描述。捕獲測定
圖13 16顯示捕獲測定的例，其可以競爭性或游離堿基形式進行，且可包含簡單連接或連接和延伸二者。在此實施方式中，第I連接探針包含地址盒，第2連接探針包含結合標記物。測定組分可由固體支持物捕獲，然后可進一步分析，以測定是否發(fā)生了連接。在圖13中，第I連接探針1310包含地址盒(包含第2引發(fā)結構域123，第I地址序列111和第I引發(fā)結構域112)，第I雜交結構域113和詢問核苷酸114。第2連接探針1320包含第2雜交結構域121和結合標記物(例如，生物素)1301。第I雜交結構域113與第I靶結構域102互補由此雜交。第2雜交結構域121與第2靶結構域103互補由此雜交。雜交復合物1340由此形成。因為詢問核苷酸114和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，連接可在詢問核苷酸114到第2連接探針的接近端之間發(fā)生。連接的探針1350然后由附接于固體支持1360的捕獲配體1361捕獲，其可然后洗滌。部分連接的探針，諸如地址盒，通過使用5’引物1362和3’引物1363擴增而產生衍生物(二級)靶序列1370，其可如本文所述標記及檢測。在雜交復合物1341中，第I連接探針1330包含地址序列115和詢問核苷酸116，其不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此無連接發(fā)生。然后捕獲第2連接探針。第2連接探針通過使用5’引物和3’引物也不會擴增，由于其不含有用于那些引物的引發(fā)位點，因此無擴增產物會被檢測到。圖14顯示與圖13中顯示的相同的測定，除了實施另外的延伸步驟之外。因為詢問核苷酸114和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，聚合酶可用與靶延伸結構域301互補的堿基對延伸第I連接探針1410，形成延伸的第I連接探針1450。延伸的第I連接探針1450的末端核苷酸連接于第2連接探針的接近端而形成連接的探針1460。連接的探針1460然后由附接于固體支持1470的捕獲配體1471捕獲，其可然后洗滌。部分連接的探針，諸如地址盒，通過使用5’引物1472和3’引物1473擴增而產生衍生物(二級)靶序列1480，其可如本文所述標記及檢測。在雜交復合物1441中，第I連接探針1430包含地址序列115和詢問核苷酸116，其不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此無延伸和無連接發(fā)生。然后捕獲第2連接探針。第2連接探針通過使用5’引物和3’引物也不會擴增，由于其不含有用于那些引物的引發(fā)位點，因此無擴增產物會被檢測到。類似于圖2，4，6，8，10和12中顯示的測定，圖13和14中顯示的測定可在一級靶序列上實施，其中第I靶結構域在第2靶結構域的5’?？梢杂坞x堿基形式在分離的容器中實施使用包含地址盒的第I連接探針和包含結合標記物的第2連接探針的測定。在圖15中，第I連接探針1510包含地址盒(包含第2引發(fā)結構域123，第I地址序列111和第I引發(fā)結構域112)和第I雜交結構域113。第2連接探針1320包含第2雜交結構域121和結合標記物(例如，生物素)1301。第I雜交結構域113與第I靶結構域102互補由此雜交。第2雜交結構域121與第2靶結構域103互補由此雜交。雜交復合物1540由此形成。因為游離的核苷酸G和檢測核苷酸101之間的互補堿基配對，聚合酶可用游離的核苷酸G延伸第I連接探針110。延伸的第I連接探針1550的末端核苷酸然后連接于第2連接探針的接近端而形成連接的探針1560。連接的探針1560然后由附接于固體支持1560的捕獲配體1561捕獲，其可然后洗滌。部分連接的探針，諸如地址盒，通過使用5’引物1562和3’引物1563擴增而 產生衍生物(二級)靶序列1570，其可如本文所述標記及檢測。在分離的容器中，雜交復合物1541包括包含不同于地址序列111的地址序列115的第I連接探針130。在一些實施方式中，全部容器使用具有相同的地址序列的相同的第I連接探針。游離的核苷酸T不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此不發(fā)生延伸和連接。然后捕獲第2連接探針。第2連接探針通過使用5’引物和3’引物也不會擴增，由于其不含有用于那些引物的引發(fā)位點，因此無擴增產物會被檢測到。圖16顯示圖15中顯示的相同的通用的測定，除了靶序列100的第I靶結構域102在第2靶結構域103的5’之外。游離的核苷酸G之間的互補堿基配對允許形成延伸的第2連接探針1650。延伸的第2連接探針1650和第I連接探針之間的連接產生連接的探針1660。連接的探針1660然后由附接于固體支持1670的捕獲配體1671捕獲，其可然后洗滌。部分連接的探針，諸如地址盒，通過使用5’引物1672和3’引物1673擴增而產生衍生物(二級)靶序列1680，其可如本文所述標記及檢測。三級靶序列1680會形成大多數擴增產物。在分離的容器中，雜交復合物1641包括包含不同于地址序列111的地址序列115的第I連接探針130。在一些實施方式中，全部容器使用具有相同的地址序列的相同的第I連接探針。游離的核苷酸T不與檢測核苷酸101形成互補堿基對。因此不發(fā)生延伸和連接。然后捕獲第2連接探針。第2連接探針通過使用5’引物和3’引物也不會擴增，由于其不含有用于那些引物的引發(fā)位點，因此無擴增產物會被檢測到。在任何圖中，可知，第2連接探針顯示包含切割位點，第I連接探針可代替或除了第2連接探針之外包含切割位點。例如，圖中顯示的或在本文描述的任何第I連接探針可在第I引發(fā)結構域和第I雜交結構域之間包含切割位點。此外，結合標記物諸如生物素可在圖中顯示的任何組分的各種部分合并。例如，在圖1 12中，生物素或其他結合標記物可在第2雜交結構域和切割位點之間合并。以此方式使用結合標記物可輔助或改善顯示的各種物質的檢測。例如，在圖中顯示的探針中合并結合標記物可允許探針結合到固體支持物，其可洗滌，從而僅保留目標物質。應用本文所述的組合物和方法可在廣泛的應用中采用。在一些實施方式中，本發(fā)明的篩選或基因分型方法可用于檢測至少一個遺傳座位的至少一種等位基因。在一特別有用的實施方式中，在本文的基因分型方法用于檢測在胚胎基因組中發(fā)現的等位基因。目前知道的出生前診斷方法一般涉及侵襲性技術諸如羊膜腔穿刺術，移出絨毛膜絨毛和移出胚胎血或組織活組織檢查。已描述基于就胚胎細胞富集母源血樣品的及分析樣品中細胞群以鑒定胚胎細胞的非-侵襲性方法。見國際公開W02008/048931和W02010/075459。Lo，美國專利N0.6，258，540公開對母源血樣品實施出生前診斷的方法，該方法包括獲得血樣品的非_細胞級分，自非-細胞級分擴增父源地遺傳的核酸，及對擴增的核酸實施核酸分析，以檢測父源地遺傳的胚胎核酸。但是，本文所述的基因分型方法，不需要及在特定實施方式中不擴增一級靶序列，諸如自父親或母親遺傳的胚胎基因組DNA。本基因分型方法可與本領域知道的測定胚胎基因變體的方法組合。例如，Oliphant,國際公開W02010/075459， 其內容在本文通過引用以其整體合并，尤其描述了對母源樣品基因分型的方法，獲得母源和胚胎細胞的混合物，及就胚胎細胞濃縮樣品，及分為子樣品。選擇母源樣品是純合的一組至少一個靶座位用于子樣品的篩選或基因分型。在這些座位中的至少一個個別篩選或基因分型各子樣品，雜合基因型的檢測指示子樣品中非-母源等位基因的存在?；蛘撸x擇母源樣品是雜合的一組至少一個靶座位用于子樣品的篩選或基因分型。在這些座位中的至少一個個別篩選或基因分型各子樣品，純合基因型的檢測指示子樣品中非-母源等位基因的存在。本文所述的基因分型方法特別適合在描述于Oliphant的該及其他方法中使用，及提供不擴增和/或檢測胚胎DNA地，特別通過擴增和/或檢測人工，非-基因組序列地檢測胚胎DNA的方式。本領域會同意，可測試廣泛數的不同SNP或其他類型的多態(tài)性，以進行等位基因母源樣品是純合的測定。例如，Oliphant，國際公開W02010/075459，公開了設計對于鑒定樣品中的胚胎遺傳物質有用的SNP組的方法?？墒褂萌我鈹档某Ｒ姷腟NP/等位基因。一般而言，起初評價一組SNP以進行等位基因母源樣品是純合的測定。此組可為I 200，10 150有用，及50 100特別有用。在一些實施方式中，就母源純合性測試的SNP組選自 dbSNP 登錄記錄中公開的 SNP 的任何組合:rsl424506，rs207509，rsl004044，rsl673003，rs4789798,rsl887889,rs207509,rs4593206,rsl89664,rsl006779,rs7027512,rsl65924,rs6803756, rs207509, rs4684327, rs239683,rsl014803,rs598416,rs2830169,rs448887,rs220162, rs4982485, rs2825069, rsl014803, rs576762, rsl0129348, rsl3151776,rs2205533, rs2650957, rs2830234, rsll087884, rsl419747, rs2269355, rsl2920309,rs2205533, rs35748020, rs2838818, rsll53280, rs731750, rs2242360, rs6581667,rs2268262, rs2391110, rs2010355, rsll53280, rs3788696, rs658857, rsl263416,rs2824547, rs2306612, rsll53280, rsll700636, rs6902513, rsll074601, rs7462034,rs2829694, rs354359, rsl537852, rsll700636, rsl522666, rsl0758556, rsl241633,rs2832668, rsl864462, rs2268262, rsl2482516, rs224065, rs3784301, rs2130643,rs2833756, rsl0805396, rs879261, rsl2482516, rsl039753, rsl0217351, rs7589684,rs2839619, rs6955206, rs6687726, rsl2626413, rs6533225, rsllll832, rs2249102,rs3787659, rsl3332281, rs2205533, rsl2626873, rsl841946, rsl2423234, rsl3406272,rs3787728, rsl830138, rs2725303, rsl3049530, rsl2662883, rsl572641, rs3213856,rs3787831, rs7155331, rs3818, rsl3049530, rs2270433, rsl554472, rs2634421,rs3787894, rsl889819, rs9888005, rsl537852, rs224147, rsl0815923, rs7311115,rs3788097, rs7585579, rs723469, rsl543754, rsl456017, rsl335788, rsl495772,rs3853054, rs6844640, rsl481065, rsl543754, rs4437273, rs6475240, rs721457,rs461853, rsl3095333, rs284877, rsl921361, rsll071641, rs2182957, rslll61520,rs587085, rs220162, rs2241145, rs2000490, rs7573728, rsl923874, rs4271524,rs7279064, rsll087884, rs4144457, rs2000490, rs4753881, rs2812148, rsl385161,rs917580, rs3787728, rs9610714, rs2032652, rsll624331, rs2834708, rs324554,rs3787831, rs7875113, rs2064391, rs2182241, rs747039, rsll935170, rs3788097,rs2834924, rs2064391, rs7295630, rs8130025 和 rs4368579。dbSNP 是細節(jié)化遺傳變異的記錄的在線公共檔案，其可由以上提供的參考號的方式訪問。在其他實施方式中，通過選擇一個或另一親本是純合(通常但不總是母親)的SNP，本發(fā)明的測定可以 利用相比正常需要的更少標記物的形式進行。在這些實施方式中，不是標記全部探針，而僅標記非-純合等位基因。例如，推定第1SNP，其在檢測位置是A/G，及一個親本是純合A，僅標記G探針；類似地，第2SNP，其是T/C，一個親本是純合T，僅標記C探針。以此方式，通過使用更少標記物獲得更多信息。合成測序庫本發(fā)明的組合物和方法可用于產生合成核酸庫。該合成核酸庫可用于測序或在寡核苷酸陣列中。在特定實施方式中，本發(fā)明的方法和組合物用于產生編碼靶座位或等位基因的合成核酸庫。在其他實施方式中，可同時使用多種連接探針，各包含不同詢問核苷酸。在例示實施方式中，使用多組連接探針，各探針包含不同于組中各其他連接探針的各其他詢問核苷酸的詢問核苷酸。在本實施方式的另一方面，連接探針包含座位或等位基因指標序列及，任選地，樣品指標序列。座位或等位基因指標序列可編碼由連接探針祀向的座位或等位基因的一些或全部。樣品指標序列提供對于多重的選項。樣品指標序列可用于鑒定靶序列源。例如，包含第I樣品指標序列的一個或更多連接探針可允許與自第I源，該第I受試者獲得的樣品中含有的靶序列結合。獨立地，包含不同于第I樣品指標序列的第2樣品指標序列的一個或更多連接探針可允許與自第2源，諸如第2受試者獲得的樣品中含有的靶序列結合。自兩樣品的連接探針可然后合并及在單運行中分析。例如，可將合并的樣品與單DNA陣列芯片接觸或可沉淀進電泳的單泳道中。本發(fā)明的連接探針中座位或等位基因指標序列的供應輔助靶座位或等位基因的鑒定及計數。本文所述的方法可用于產生與樣品中靶序列的各組分是1:1的庫。庫組分可計數，例如通過測序。以此方式，測序平臺發(fā)揮樣品中序列的數字計算器的作用。在一些實施方式中，由本發(fā)明的方法和組合物產生的序列庫寡核苷酸的長度是由特定測序技術(例如.1llum ina HiSeq)優(yōu)選的長度。在特定方面,合成庫寡核苷酸是約25 50bp,約 50 IOObp,約 100 500bp,或約 500 lOOObp。合成測序庫的組分可合并可對于降低可在各種應用中出現的誤差或偽像的有用的任意數的合成序列。本文公開的任何適配體，指標序列或地址序列可設計為就它們的旨在的用途優(yōu)化序列。例如，本領域知道，核酸擴增可由于GC堿基對的存在而偏倚。因此，合成序列可設計為提供均一的GC分布，以便最小化偏倚。在其他實施方式中，誤差修正代碼包括在本發(fā)明的方法中使用的指標寡核苷酸中。該誤差修正代碼對于補償測序誤差有用(見，例如，美國專利申請公開N0.2007/0042372)。誤差修正代碼的例包括，例如，環(huán)狀冗余檢查的類似物。在一些實施方式中，功能可用于標位知道的序列到誤差修正代碼，諸如檢查值。功能可然后應用于測序結果，以產生可與誤差修正代碼比較的測試值。測試值和誤差修正代碼之間的差異可警戒醫(yī)師測序結果中的潛在誤差。實施例本發(fā)明還通過引用下列實施例明白，其旨在是本發(fā)明的純例示。本發(fā)明的范圍不由例示的實施方式限制，其旨在僅例證本發(fā)明的單方面。是功能性地相當體的任何方法在本發(fā)明的范圍之內。除了本文所述的那些之外的本發(fā)明的各種修飾會由本領域技術人員自上述描述和附圖顯而易見。該修飾落入隨附的權利要求的范圍之內。實施例1:在一級靶序列中對單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型的寡核苷酸的設計可實施本文所述的方法以對任何基因基因分型。特別有用的基因是特征在于多等位基因的那些，且這些基因的例可見于NCBI單核苷酸多態(tài)性數據庫(dbSNP)。圖17A 17C顯示為對RBPJ，與用于免疫球蛋白K J區(qū)的重組信號結合蛋白相關的基因進行基因分型，可在本文公開的方法中使用的寡核苷酸序列。關于此基因的信息由dbSNP記錄號rs2725303提供，其指示G或T等位基因可測定。在圖17A中，可基因分型的關聯一級靶序列顯示為SEQ ID NO: 1，其中字母K標記檢測位置。SEQ ID NO: 2含有第I引發(fā)結構域，及SEQ IDN0:3顯示對于與之雜交有用的引物。SEQ ID N0:4含有第2引發(fā)結構域，及SEQ IDN0:5是可與第2引發(fā)結構域的補體結合的引物。SEQ ID N0:4的5’端是脫氧肌苷，其是切割位點的部分。SEQ ID N0:6是可附接于固體支持物，諸如珠的序列。SEQ ID N0:7是作為SEQ ID N0:6的反向互補體的引物標簽。SEQ ID NO:8是可隨附于引物標簽而產生SEQ IDN0:22的序列，其，例如，在由Luminex公司提供的測定中是有用的。在此情況中，SEQ IDN0:6 8可用于G等位基因的探針。SEQ ID NO:9是可附接于固體支持物，諸如珠的另一序列。SEQ ID N0:10是作為SEQ ID N0:9的反向互補體的引物標簽。SEQ ID N0:11是可隨附于引物標簽而產生SEQ ID NO: 23的序列，其，例如，在由Luminex公司提供的測定中是有用的。在本文中，SEQ ID N0:9 11可用于T等位基因的探針。SEQ ID NO: 12和13是分別探查G和T等位基因的地址序列?？蓪⑦@些組分組裝而提供各種連接探針。SEQ ID NO: 14是對應于G等位基因的第I連接探針，及SEQ ID NO: 15是對應于T等位基因的第I連接探針。在這些第I連接探針中，加下劃線的序列是不同地址序列，加雙下劃線的序列是第I引發(fā)結構域，框住的序列是第I雜交結構域。星標表示修飾，諸如賦予對外切核酸酶活性的抗性的硫代磷酸酯鍵。SEQID NO: 16是包含第2雜交結構域(框住的)，包括脫氧肌苷的切割位點，及第2引發(fā)結構域(加雙下劃線的)的第2連接探針。第I連接探針可延長核苷酸及連接到第2連接探針而提供根據SEQ ID NO: 17和18的連接的探針。圖17B中的箭標意味著已在延伸步驟中添加的核苷酸。將由SEQ ID NO: 17和18給出的連接的探針環(huán)化及通過在切割位點切割而再線性化，產生SEQ ID NO: 19和20分別顯示的二級靶序列。地址序列可通過使用具有根據SEQID NO:3和5的序列的引物擴增。可使用SEQ ID NO:21和22的寡核苷酸，例如，在尤其是基于珠的測定中。可通過使用自這些組分組裝的探針基因分型的其他基因等位基因顯示于dbSNP記載rs9888005。SEQ ID NO: 23顯示與FAM107B相關的等位基因。SEQ ID NO: 24和25是分別區(qū)別A和T等位基因的第I連接探針，和SEQ ID N0:26是第2連接探針。第I連接探針和連接于第2連接探針的延伸產生根據SEQ ID NO: 27和28的連接的探針。圖17C中的箭標意味著已在延伸步驟中添加的核苷酸。連接的探針的環(huán)化和再線性化產生二級靶SEQID NO:29 和 30。SEQ ID NO:31是用于模擬成功的填充/連接產物的合成模板。SEQ ID NO:32和33是用于與SEQ ID NO: 31或其補體結合的引物(見圖18)。實施例2:連接的探針的環(huán)化(即，分子內連接)和再線性化而形成二級靶序列對設計為模擬在本發(fā)明的方法中產生的連接的探針的例示線性寡核苷酸實施環(huán)化(即，分子內連接)和再線性化。將20pmol的例示線性寡核苷酸(模板1，圖18 中的 SEQ ID N0:31)在 20 μ L 反應體積中，使用 IOOU 的 CircLigase 酶(EpicentreBiotechnologies;Madison, WI),在補充25 μ M ATP,及0.4U的熱穩(wěn)定的無機焦磷酸酶(NewEngland Biolabs, Ipswich, MA),含及不含2.5mM MnCl2的IX濃度的生產商供給的緩沖劑中環(huán)化。此外，如上使用20pmol的例示線性寡核苷酸但不用CircLigase酶,熱穩(wěn)定的無機焦磷酸酶，及MnCl2設置“無環(huán)化”對照反應。這些分子內連接反應在Perkin Elmer2400GeneAmp PCR熱循環(huán)儀中于60°C實施I小時，之后是于80°C經10分鐘的連接酶滅活步驟及于4°C的保持步驟。然后通過用內切核酸酶V (EndoV)消化一半的各CircLigase反應來使得到的環(huán)化反應產物個別經歷再線性化。特別是，將IOpmol的各環(huán)化反應產物在20 μ L體積中，使用IOU的Endo V (New England Biolabs; Ipswich, MA),在I X濃度的生產商供給的緩沖劑中，于37°C消化2小時，之后是在Perkin Elmer2400Gene Amp PCR熱循環(huán)儀中于80°C經10分鐘的酶滅活步驟及于4°C的保持步驟。接下來，將7.5pmol的各環(huán)化及對應再線性化反應產物在17% (19:1)天然丙烯酰胺凝膠中，在25瓦特運行65分鐘,及用GelStar(Lonza;Walkersville, MD)染色而可視化。如顯示于圖19，模板1，將設計為模擬在本發(fā)明的方法中產生的連接的探針的線性寡核苷酸，通過使 用CircLigase成功地環(huán)化(見泳道4和6)。而且,環(huán)化的模板I通過使用EndoV成功地再線性化(見圖19中的泳道5和7)。這些結果顯示，本發(fā)明的方法對于環(huán)化及再線性化寡核苷酸模板有效。這些結果推薦，本發(fā)明的方法和組合物會對于環(huán)化及再線性化在本發(fā)明的方法中產生的連接的探針有效。這些結果還推薦，本發(fā)明的方法和組合物對于基因分型核酸有用。實施例3:連接的探針和二級靶序列的PCR擴增和檢測為了評定本發(fā)明的測定的靈敏度，對設計為模擬連接的探針的例示線性寡核苷酸(模板1，圖18中的SEQ ID NO: 31)和在實施例2中在4ng的雄性或雌性基因組DNA卿，背景基因組DNA)存在下產生的例示二級靶序列二者實施PCR擴增。對通過使用例示線性寡核苷酸和例示二級靶二者的稀釋制造的測試樣品運行基于PCR的sybr綠測定，其中例示序列起初以分別1.32 X 101°或1.32 X IO9例示分子/ μ L的濃度添加到Ing/μ L雄性(PM)或Ing/ μ L雌性(PF)基因組DNA (Promega; Madi son, WI)背景,然后對于各例示序列使用Ing/μ L濃度的適當的PM或PF基因組DNA背景連續(xù)稀釋10倍至1.32X 102。使用ABI SybrGreen Master Mix,添加進例示序列物質的4ng背景基因組輸入,及200nM引物濃度,PCR擴增是在25 μ L體積中，在ΑΒΙ7500儀器上于95°C經10分鐘，之后是于95°C經15s的40個循環(huán)和65°C經I分鐘，之后是標準熔解曲線分析特征。(見圖20A，20B, 21A和21B)。在擴增之后，20 μ L的反應物質在8% (19:1)天然丙烯酰胺凝膠上在25瓦特運行45分鐘，然后進行GelStar染色而可視化(見圖22)。引物設計為產生用于檢測模板I的72bp的PCR產物和用于二級靶序列的成功的檢測的44bp的PCR產物。如顯示于圖22，在含有添加到基因組DNA背景的模板I的樣品中檢測到72bp的強條帶(見圖22中的泳道4和5)。在含有添加到基因組DNA背景的例示二級靶序列的樣品中檢測到44bp的強條帶(見圖22中的泳道6和7)。這些結果顯示，本發(fā)明的方法對于擴增及檢測本發(fā)明的例示二級靶序列有效。這些結果推薦，本發(fā)明的方法和組合物會對于擴增地址序列而形成三級靶序列及檢測三級靶序列有用。這些結果還推薦，本發(fā)明的方法和組合物對于基因分型核酸有用。本文所用的冠詞“a”，“an”和“the”不排除復數個數的指示物，除非情景明顯另外決定。連詞“或”不是相互排他的，除非情景明顯另外決定。術語“包括”用于指稱非-窮舉例。 本文引用的全部參考文獻，出版物，專利申請，授權的專利，登錄記錄和數據庫，包括任何附錄，為全部目的通過引用以它們的整體合并。
權利要求
1.鑒定一級靶序列中的檢測核苷酸的方法，所述一級靶序列包含第I靶結構域，第2靶結構域及所述檢測核苷酸，所述方法包括: Ca)提供第I連接探針，其依次包含: (i)第I地址序列， (ii)第I引發(fā)結構域， (iii)第I雜交結構域，其互補于所述第IIE結構域，及 (iv)第I詢問核苷酸； (b)提供第2連接探針，其依次包含: (i )第2雜交結構域，其互補于所述第2靶結構域，及 (ii)第2引發(fā)結構域，其中所述第I和第2連接探針之一包含切割位點； (c)使所述第I和第2連接探針分別與所述第I和第2靶結構域雜交，以形成雜交復合物； (d)使所述雜交復合物經歷如果所述詢問核苷酸與所述檢測核苷酸完美互補，連接發(fā)生而形成連接的探針的條件 ； Ce)自所述連接的探針形成環(huán)化的探針； Cf)在所述切割位點切割所述環(huán)化的探針以形成依次包含所述第2引發(fā)結構域，模板地址序列及所述第I引發(fā)結構域的二級靶序列； (g)使用所述二級靶序列上的所述引發(fā)結構域擴增所述模板地址序列以形成三級靶序列；以及 (h )檢測所述三級靶序列的存在以鑒定所述檢測核苷酸。
2.權利要求1的方法，其中所述環(huán)化的探針通過環(huán)化所述連接的探針來形成。
3.任何前述權利要求的方法，其還包括: 提供第3連接探針，其依次包含: (i)第2地址序列， (ii)所述第I引發(fā)結構域， (iii)所述第I雜交結構域，其互補于所述第IIE結構域，及 (iv)第2詢問核苷酸， 其中所述第2地址序列不同于所述第I地址序列，以及 所述第2詢問核苷酸不同于所述第I詢問核苷酸。
4.權利要求1的方法，其中所述環(huán)化的探針在所述連接發(fā)生時形成。
5.權利要求4的方法，其還包括: 提供第3連接探針，其依次包含: (i)第2地址序列， (ii)所述第I引發(fā)結構域， (iii)所述第I雜交結構域，其互補于所述第IIE結構域，及 (iv)第2詢問核苷酸， 其中所述第2地址序列不同于所述第I地址序列； 所述第2詢問核苷酸不同于所述第I詢問核苷酸； 選自所述第3連接探針及所述第2連接探針的探針包含切割位點；以及所述第3連接探針及所述第2連接探針在所述第2地址序列和所述第2引發(fā)結構域之間接合。
6.權利要求3和5之任一項的方法，其中所述第I地址序列具有不同于所述第2地址序列的尺寸的尺寸。
7.權利要求3、5和6之任一項的方法，其中所述第I地址序列具有不同于所述第2地址序列的核苷酸序列的核苷酸序列。
8.任何前述權利要求的方法，其還包括:使所述雜交復合物與至少一種dNTP和聚合酶在所述連接之前接觸，其中所述第I連接探針的3’末端和所述第2連接探針的5’末端被所述雜交復合物中的至少一個核苷酸隔開。
9.權利要求1 7之任一項的方法，其中所述第I連接探針的3’末端和所述第2連接探針的5’末端在所述雜交復合物中相鄰。
10.任何前述權利要求的方法，其還包括:使所述雜交復合物與校正聚合酶和至少一種dNTP接觸，其中所述第I連接探針包括3’延伸阻斷部。
11.鑒定一級靶序列中的檢測核苷酸的方法，所述一級靶序列包含第I靶結構域，第2靶結構域及所述檢測核苷酸，所述方法包括: Ca)提供第I連接探針，其依次包含: (i)地址序列， (ii)第I引發(fā)結構域，及 (iii)第I雜交結構域，其互 補于所述第IIE結構域； (b)提供第2連接探針，其依次包含: (i )第2雜交結構域，其互補于所述第2靶結構域，及 (ii)第2引發(fā)結構域，其中所述第I和第2連接探針之一包含切割位點； (c)在第I容器中使所述第I和第2連接探針分別與所述第I和第2靶結構域雜交，以形成雜交復合物； (d)使所述雜交復合物與第IdNTP和聚合酶接觸，使得如果所述第IdNTP與所述檢測核苷酸完美互補，所述第I或第2連接探針延伸而包含詢問核苷酸； Ce)使所述雜交復合物經歷連接發(fā)生而形成連接的探針的條件； Cf)自所述連接的探針形成環(huán)化的探針； (g)在所述切割位點切割所述環(huán)化的探針以形成依次包含所述第2引發(fā)結構域，模板地址序列及所述第I引發(fā)結構域的二級靶序列； (h)使用所述二級靶序列上的所述引發(fā)結構域擴增所述模板地址序列以形成三級靶序列；以及 (i)檢測所述三級靶序列的存在以鑒定所述檢測核苷酸。
12.權利要求11的方法，其中所述環(huán)化的探針通過環(huán)化所述連接的探針來形成。
13.權利要求11的方法，其中所述環(huán)化的探針在所述連接發(fā)生時形成。
14.權利要求11 13之任一項的方法，其還包括:重復所述方法， 其中第2雜交步驟發(fā)生在第2容器中，以及 所述接觸步驟包括使所述雜交復合物與第2dNTP和聚合酶接觸，使得如果所述第2dNTP與所述檢測核苷酸完美互補，所述第I或第2連接探針延伸而包含詢問核苷酸，其中所述第2dNTP不同于所述第I dNTP。
15.權利要求11 14之任一項的方法，其中所述第I和第2靶結構域僅被所述檢測核苷酸隔開。
16.鑒定一級靶序列中的檢測核苷酸的方法，所述一級靶序列包含第I靶結構域，第2靶結構域及所述檢測核苷酸，所述方法包括: Ca)提供第1連接探針，其依次包含: (i)第1引發(fā)結構域， (ii)地址序列， (iii)第2引發(fā) 結構域，及 (iv)第I雜交結構域,其互補于所述第IIE結構域； (b)提供第2連接探針，其包含: (i )第2雜交結構域，其互補于所述第2靶結構域，及 (ii)標記物； (c)在第I容器中使所述第I和第2連接探針分別與所述第I和第2靶結構域雜交，以形成雜交復合物； (d)使所述雜交復合物與第IdNTP和聚合酶接觸，使得如果所述第IdNTP與所述檢測核苷酸完美互補，所述第I或第2連接探針延伸而包含詢問核苷酸； Ce)使所述雜交復合物經歷連接發(fā)生而形成二級靶序列的條件； Cf)通過使標記物與附接于固體支持物的捕獲結合配體結合來捕獲所述二級靶序列； (g)使用所述二級靶序列上的所述引發(fā)結構域擴增所述地址序列以形成三級靶序列；以及 (h )檢測所述三級靶序列的存在以鑒定所述檢測核苷酸。
17.權利要求16的方法，其還包括:重復所述方法， 其中第2雜交步驟發(fā)生在第2容器中，以及 所述接觸步驟包括使所述雜交復合物與第2dNTP和聚合酶接觸，使得如果所述第2dNTP與所述檢測核苷酸完美互補，所述第I或第2連接探針延伸而包含詢問核苷酸， 其中所述第2dNTP不同于所述第I dNTP。
18.權利要求16和17之任一項的方法，其中所述第I和第2靶結構域僅被所述檢測核苷酸隔開。
19.任何前述權利要求的方法，其中所述切割位點包括選自下列的一種或更多部分:肌苷，核糖核苷酸，無堿基位點，光切割性基團，及限制酶切割序列。
20.任何前述權利要求的方法，其中所述擴增步驟包括實施PCR。
21.任何前述權利要求的方法，其中所述三級靶序列包含標記物。
22.任何前述權利要求的方法，其中所述檢測步驟包括形成包含所述三級靶序列，捕獲探針和固體支持物的信號傳導復合物。
23.權利要求22的方法，其中所述信號傳導復合物還包含信號探針。
24.任何前述權利要求的方法，其中所述第2引發(fā)結構域包含引發(fā)結構域延伸。
25.任何前述權利要求的方法，其中所述地址序列中的至少一個包含適配體序列。
26.任何前述權利要求的方法，其中所述地址序列中的至少一個包含樣品指標序列。
27.任何前述權利要求的方法，其中所述地址序列中的至少一個包含座位指標序列。
28.權利要求27的方法，其中所述座位指標序列包含對應于所述一級靶序列的片段的序列。
29.權利要求27的方法，其中所述座位指標序列不包含對應于所述一級靶序列的片段的序列。
30.權利要求1 27之任一項的方法，其中引發(fā)結構域或地址序列不包含對應于所述一級靶序列的片段的序列。
31.權利要求1 27之任一項的方法，其中擴增所述模板地址序列的步驟在使得無雜交結構域被擴增的條件下實施。
32.任何前述權利要求的方法，其中所述一級靶序列是胎兒的DNA。
33.權利要求32的方法，其中所述DNA自所述胎兒的父親被所述胎兒遺傳。
34.任何前述權利要求的方法，其中所述檢測步驟包括測序所述三級靶序列。
35.任何前述權利要求的方法，其中所述一級靶序列得自母源血，母源血清，母源血漿或母源尿。
36.權利要求35的方法，其中所述一級靶序列是胎兒的DNA，且在所述母源血，母源血清或母源血漿中計數一級靶序列的數，以便檢測所述胎兒的三體性。
37.鑒定來自母親的 血樣品中的胚胎細胞的方法，所述方法包括: (a)測定來自母親的DNA中多個基因的基因型以鑒定在來自所述母親的所述DNA中純合的多個查詢基因； (b)測定來自所述母親的所述血樣品中細胞的DNA中一種或更多所述多個查詢基因的基因型以鑒定至少一種雜合基因，基因分型步驟包括實施任何前述權利要求的方法，由此鑒定所述胚胎細胞。
38.權利要求37的方法，其還包括:富集所述具有胚胎細胞的血樣品。
39.權利要求37和38之任一項的方法，其還包括: 擴增來自所述胚胎細胞的DNA以獲得擴增的DNA，及 在比較性基因組雜交測定中使用所述擴增的DNA以檢測遺傳異常。
40.權利要求39的方法，其中所述遺傳異常是三體性。
41.環(huán)化的探針,其由權利要求1 36之任一項的方法產生。
42.雜交復合物，其由權利要求1 36之任一項的方法產生。
43.二級靶序列，其由權利要求1 36之任一項的方法產生。
全文摘要
在本文描述的是對于檢測核酸變異有用的組合物和方法。探針之內或探針之間的連接用于區(qū)別與靶完美互補的探針和含有錯配的那些。根據實施的測定類型任選地應用核苷酸填充/延伸步驟?？蓪h(huán)化和再線性化步驟應用于創(chuàng)建用于進一步擴增和檢測的模板。在特定方面，未擴增靶序列的部分或其補體。
文檔編號C12Q1/68GK103228796SQ201180044732
公開日2013年7月31日 申請日期2011年8月11日 優(yōu)先權日2010年8月11日
發(fā)明者K·A·克魯梅爾, 張海川, A·S·卡茨, R·巴爾多奇, R·加蒂, 張毅, K·岡寧, E·涂 申請人:賽路拉公司