專利名稱：由xy es細(xì)胞制備能育的xy雌性動物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及衍生自XY胚胎干(“ES”)細(xì)胞且具有XY核型的能育的雌性動物的制造。在特定實施方案中，描述了關(guān)于由XY供體鼠ES細(xì)胞制備能育的XY雌性小鼠的方法和組合物。還描述了用于支持表型雌性形成的體外受精方法。
背景技術(shù)：
幾乎所有通常采用的用于制備遺傳修飾小鼠的ES細(xì)胞系都是基因型雄性(XY)ES細(xì)胞系。因此，在H)代中，所有XY動物都是雄性。大多數(shù)遺傳修飾通過靶向XY ES細(xì)胞執(zhí)行，以產(chǎn)生兩種現(xiàn)有等位基因之一的修飾，即供體小鼠ES細(xì)胞對于遺傳修飾是雜合的。然而，通常希望獲得對于遺傳修飾是純合的小鼠。 因為基本上沒有完全ES細(xì)胞衍生的雌性小鼠在包含該修飾的H)代中出生，所以H)雄性一般與雌性(例如匹配的近親繁殖的雌性)交配，以生成其中至少一個雌性(Fl雌性)對于遺傳修飾可能是雜合的一窩動物。隨后使雜合Fl雌性與Fl雜合雄性互交，以獲得純合后代。此類交配需求代表昂貴和費時的步驟。希望在H)代中生成交配對，或至少生成大部分或完全衍生自供體(XY雄性)ES細(xì)胞的H)雌性。本領(lǐng)域存在關(guān)于由供體雄性(XY)ES細(xì)胞和宿主胚胎在H)代中制備能育的雌性動物的方法和組合物的需要。發(fā)明概述在一個方面，提供了用于由XY供體細(xì)胞制備能育的雌性非人動物的方法，其包括(a)將非人XY供體細(xì)胞引入非人宿主胚胎內(nèi)，以形成嵌合胚jP(b)使該嵌合胚孕育，以形成非人雌性動物，其中所述非人雌性動物是XY并且在達(dá)到性成熟后是能育的。在一個實施方案中，非人動物是小鼠。在一個實施方案中，非人XY雌性動物在H)代中形成。在一個實施方案中，在H)代中的非人雌性XY動物是小鼠且具有100%衍生自供體細(xì)胞的毛色。在一個實施方案中，在H)代中形成的非人雌性XY動物至少90%、92%、94%、96%、98%或99. 8%衍生自XY供體細(xì)胞。在一個實施方案中，在H)代中的非人雌性XY動物約100%衍生自供體細(xì)胞。在一個實施方案中，宿主胚胎胎細(xì)胞對H)代中非人雌性XY動物的貢獻(xiàn)通過定量測定法進(jìn)行測定，所述定量測定法能夠檢測2，000中的I個細(xì)胞(O. 05%)，并且沒有雌性XY動物的組織對于宿主胚胎細(xì)胞貢獻(xiàn)是陽性的。在一個實施方案中，供體細(xì)胞包含遺傳修飾。在一個實施方案中，遺傳修飾包含內(nèi)源核酸序列整體或部分的缺失；一個或多個核酸的取代；內(nèi)源核酸序列例如基因整體或部分由異源核酸序列的替換；敲除；和/或敲入。在一個實施方案中，該方法進(jìn)一步包括使對于遺傳修飾雜合的H)代XY雄性與對于遺傳修飾雜合的H)代XY雌性(例如同胞)交配，并且由所述交配獲得對于遺傳修飾純合的Fl代動物。 在一個實施方案中，在引入宿主胚胎內(nèi)之前，將XY供體細(xì)胞維持在包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補充物的培養(yǎng)基中，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示選自下述的特征(a)約250-310m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度；(b)約ll-13mS/cm的導(dǎo)電性；(c)濃度約60_105mM的堿金屬和鹵素的鹽；(d)約20-30mM的碳酸鹽濃度；(e)至多約85_130mM的堿金屬鹵鹽和碳酸鹽總濃度；和(f)其組合。在一個實施方案中，補充物包含用于維持在培養(yǎng)中的ES細(xì)胞的組分。在一個實施方案中，補充物包含胎牛血 清(FBS)、谷氨酰胺、抗生素、丙酮酸鹽、非必需氨基酸、2-巰基乙醇和LIF中的一種或多種。在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基是低鹽DMEM。在特定實施方案中，低鹽DMEM具有85-130mM的NaCl濃度。在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基是低摩爾滲透壓濃度DMEM。在特定實施方案中，低摩爾滲透壓濃度DMEM具有250-310m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基是低導(dǎo)電性DMEM。在特定實施方案中，低導(dǎo)電性DMEM具有l(wèi)l_13mS/cm的導(dǎo)電性。在一個實施方案中，在引入宿主胚胎內(nèi)之前，將供體細(xì)胞在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上補充物中維持約1、2、3、4、5、6天，I周，8、9、110、11或12天，2周、3周或4周或更久。在特定實施方案中，在引入宿主胚胎內(nèi)之前，將供體細(xì)胞維持在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上補充物中至少一周。在特定實施方案中，在引入宿主胚胎內(nèi)之前，將供體細(xì)胞維持在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基加上補充物中2-4周。在一個實施方案中，宿主胚胎是2-細(xì)胞期、4-細(xì)胞期、8-細(xì)胞期、16-細(xì)胞期、32-細(xì)胞期或64-細(xì)胞期胚胎。在另一個實施方案中，宿主胚胎是囊胚。在一個實施方案中，胚胎在選自桑椹胚前期、桑椹胚期、非致密的桑椹胚期和致密的桑椹胚期的階段中。在一個實施方案中，胚胎期選自泰勒期(Theiler Stage) I (TSl )、TS2、TS3、TS4、TS5和TS6，參考Theiler (1989) “The House Mouse Atlas of Mouse Development, ^Springer-Verlag,New York中所述的泰勒期。在特定實施方案中，泰勒期選自TS1、TS2、TS3和TS4。在一個實施方案中，胚胎包含透明帶，并且供體細(xì)胞是通過透明帶中的孔引入胚胎內(nèi)的ES細(xì)胞。在一個實施方案中，胚胎包含囊胚前胚胎。在一個實施方案中，胚胎是桑椹胚期胚胎。在特定實施方案中，桑椹胚期胚胎是聚集的。在一個實施方案中，胚胎是少帶(zona-less)胚胎。在一個實施方案中，XY供體細(xì)胞選自ES細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞、多能細(xì)胞和全能細(xì)胞。在特定實施方案中，XY供體細(xì)胞是小鼠ES細(xì)胞并且宿主胚胎是小鼠胚胎。在一個實施方案中，XY供體細(xì)胞是來自近交小鼠品系的ES細(xì)胞。在一個實施方案中，XY供體細(xì)胞是來自雜交或遠(yuǎn)交小鼠品系的ES細(xì)胞。在一個實施方案中，宿主胚胎是小鼠宿主胚胎。在一個實施方案中，小鼠宿主胚胎來自近交品系，在另一個實施方案中，來自雜交或遠(yuǎn)交品系。在一個實施方案中，供體細(xì)胞是小鼠供體細(xì)胞。在一個實施方案中，宿主胚胎和供體細(xì)胞都是小鼠，并且各自獨立地選自其為129品系、C57BL/6品系、129和C57BL/6的雜種、BALB/c品系或Swiss Webster品系的小鼠。在特定實施方案中，小鼠是50% 129和50% C57BL/6。在一個實施方案中，小鼠是選自其為 129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如 129S1/SV、129Sl/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6 (129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2 (參見例如，F(xiàn)esting 等人(1999) Revised nomenclature for strainl29 mice、Mammalian Genome 10:836)品系的129品系。在一個實施方案中，小鼠是C57BL品系，在特定實施方案中，選自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、C57BL/01a。在特定實施方案中，小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的雜種。在另一個特定實施方案中，小鼠是前述129品系的雜種或前述BL/6品系的雜種。在特定實施方案中，雜種的129品系是129S6 (129/SvEvTac)品系。在一個實施方案 中，XY雌性小鼠在其壽命期間產(chǎn)生1、2、3、4、5、6、7、8或9窩的活小鼠。在一個實施方案中，XY雌性小鼠產(chǎn)生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10只幼崽/窩。在一個實施方案中，XY雌性小鼠產(chǎn)生約4-6只幼崽/窩。在一個實施方案中，XY雌性小鼠產(chǎn)生2-6窩，其中每窩具有至少2、3、4、5或6只幼崽。在一個實施方案中，約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的幼崽是XY雌性幼崽。在特定實施方案中，約15%_25%是XY雌性幼崽。在一個方面，提供了用于制備對于遺傳修飾是純合的小鼠的方法，采用對于遺傳修飾是雜合的XY ES細(xì)胞。在一個實施方案中，該方法包括遺傳修飾XY供體ES細(xì)胞，以形成雜合XY供體ES細(xì)胞，將雜合XY供體ES細(xì)胞維持在低鹽和/或低摩爾滲透壓濃度或低導(dǎo)電性培養(yǎng)基中，將雜合XY供體ES細(xì)胞引入桑椹胚前宿主胚胎內(nèi)，使宿主胚胎孕育，在孕育后獲得能育的H)代雌性XY小鼠，其包含雜合修飾且至少部分衍生自供體ES細(xì)胞，并且在孕育后獲得能育的H)代雄性XY小鼠，其包含雜合修飾且至少部分衍生自供體ES細(xì)胞，并且使H)雄性和H)雌性交配，以獲得包含純合修飾的Fl后代。在一個實施方案中，F(xiàn)O代雌性XY小鼠和/或H)代雄性XY小鼠至少20%或更多衍生自供體ES細(xì)胞。在一個實施方案中，F(xiàn)O雌性XY小鼠至少30%、40%、50%、60%、70%或80%衍生自供體ES細(xì)胞。在一個實施方案中，F(xiàn)O代雌性XY小鼠和/或雄性XY小鼠至少90%衍生自供體ES細(xì)胞。在一個實施方案中，H)雌性XY小鼠至少92%、94%、96%、98%、99%或99. 8%衍生自供體ES細(xì)胞。在一個實施方案中，H)代雌性XY小鼠和/或H)代雄性XY小鼠具有100%衍生自供體ES細(xì)胞的毛色。在一個實施方案中，H)代小鼠包含XY卵母細(xì)胞。在一個實施方案中，F(xiàn)l代后代小鼠包含完全衍生自供體ES細(xì)胞的基因組。在一個實施方案中，F(xiàn)O代雄性和H)代雌性小鼠產(chǎn)生完全ES細(xì)胞衍生小鼠的雜交頻率是100%。在一個方面，提供了用于生成小鼠幼崽窩的方法，其包括將根據(jù)本發(fā)明制備的XY供體ES細(xì)胞引入宿主小鼠胚內(nèi)，使胚胎在合適的小鼠中孕育，并且獲得包含至少一只XY雌性小鼠幼崽的一窩小鼠幼崽，所述XY雌性小鼠幼崽在達(dá)到性成熟后是能育的XY雌性小鼠。在一個實施方案中，出生的在達(dá)到性成熟后是能育的XY雌性小鼠幼崽百分比是約10%、15%、20%、25%、30%、35%.、40%、45%或50%。在特定實施方案中，該百分比是約15_25%。在一個方面，提供了用于將XY ES細(xì)胞維持在培養(yǎng)中的方法，其中在將XY ES細(xì)胞引入宿主胚胎內(nèi)之后且在合適的雌性小鼠中孕育之后，在促進(jìn)或支持雌性XY小鼠發(fā)育的條件下維持所述XY ES細(xì)胞。該方法包括將雄性ES細(xì)胞維持在包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補充物的合適培養(yǎng)基中，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約240-320m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度、約10-14mS/cm的導(dǎo)電性、約50_105mM的堿金屬鹵鹽濃度、10_40mM的碳酸鹽濃度、和/或約80-140mM的合并的堿金屬鹽和碳酸鹽濃度。在一個實施方案中，在引入宿主胚胎內(nèi)之前，將XY ES細(xì)胞維持在所述培養(yǎng)基(具有用于維持ES細(xì)胞的補充物)中1、2、3、4、5或6天，或I周，8、9、110、11或12天，2周、3周或4周的時期。在特定實施方案中，在引入宿主胚胎內(nèi)之前，將ES細(xì)胞維持在所述培養(yǎng)基(具有用于維持ES細(xì)胞的補充物的低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基)中約2_4 周。在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示至多約320、310、300、290、280、270、260、250或240m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示至多約240-320、250-310或260-300m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約270m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示至多約10. 0,10. 5,11. 0,11. 5,12. 0,12. 5、13. O、13. 5或14. OmS/cm的導(dǎo)電性。在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示至多約10_14mS/cm或ll-13mS/cm的導(dǎo)電性。在特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約12_13mS/cm的導(dǎo)電性。在特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約12-13mS/cm的導(dǎo)電性和約260-300m0sm/ kg的摩爾滲透壓濃度。在進(jìn)一步的特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含濃度約90mM NaCl的氯化鈉。在進(jìn)一步的特定實施方案中，氯化鈉的濃度是約70-95mM。在進(jìn)一步的特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含濃度小于約35mM的碳酸氫鈉。在進(jìn)一步的特定實施方案中，碳酸氫鈉的濃度是約20-30mM。在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯不至多約IOOmM的堿金屬和齒素的鹽濃度。在一個實施方案中，堿金屬和齒素的鹽是NaCl ο在一個實施方案中，堿金屬和齒素的鹽的濃度不高于90、80、70、60或50mM。在一個實施方案中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的堿金屬和鹵素的鹽濃度是約60-105、70-95或80_90mM。在特定實施方案中，該濃度是約85mM。在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯不碳酸鹽濃度。在一個實施方案中，碳酸鹽是鈉鹽。在一個實施方案中，鈉鹽是碳酸氫鈉。在一個實施方案中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳酸鹽濃度不高于40、35、30、25或20mM。在一個實施方案中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳酸鹽濃度是約10-40，在另一個實施方案中，是約20-30mM。在特定實施方案中，該濃度是約25或26mM。在一個實施方案中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中堿金屬和齒素的鹽以及碳酸鹽的濃度總和是至多140、130、120、110、100、90或80mM。在一個實施方案中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中堿金屬和鹵素的鹽以及碳酸鹽的濃度總和是約80-140、85-130、90-120、95-120或100_120mM。在特定實施方案中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中堿金屬和鹵素的鹽以及碳酸鹽的濃度總和是約115mM。在一個實施方案中，堿金屬和鹵素的鹽以及碳酸鹽的摩爾比高于2. 5。在一個實施方案中，該比是約2. 6-4. 0,2. 8-3. 8,3-3. 6或3. 2-3. 4。在一個實施方案中，該比是3. 3-3. 5。在特定實施方案中，該比是3. 4。在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約250-310m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度，和約60-105mM的堿金屬和鹵素的鹽濃度。在進(jìn)一步的實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基具有約20_30mM的碳酸鹽濃度。在進(jìn)一步的實施方案中，堿金屬和鹵素的鹽以及碳酸鹽的濃度總和是約80-140mM。在進(jìn)一步的實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的導(dǎo)電性是約12-13mS/cm。在一個方面，提供了在如本文描述的條件下用于維持培養(yǎng)中的供體XY ES細(xì)胞的方法，其中在將供體XY ES細(xì)胞引入宿主胚胎內(nèi)以形成嵌合胚，和嵌合胚在合適動物中孕育之后，嵌合胚發(fā)育成其為至少90%XY且在達(dá)到性成熟后是能育的雌性的小鼠幼崽。在一個實施方案中，小鼠幼崽是至少92%、94%、96%、98%或99. 8%ΧΥ。在一個方面，提供了用于制備能育的XY雌性動物的方法，其包括在將供體細(xì)胞引入宿主胚胎內(nèi)之前，將XY供體細(xì)胞維持在包含低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，將供體細(xì)胞引入宿主胚胎內(nèi)，使宿主胚胎在合適動物中孕育至足月，和在孕育后由其獲得XY雌性動物，其中在達(dá)到性成熟后該XY雌性動物是能育的。在一個實施方案中，XY供體細(xì)胞是小鼠ES細(xì)胞，并且宿主胚胎是來自XX雌性小鼠的胚胎。在一個實施方案中，供體細(xì)胞在其中維持的培養(yǎng)物包含如本文描述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，和適合于維持培養(yǎng)中的小鼠ES細(xì)胞的一種或多種補充物。在特定實施方案中，適合于維持培養(yǎng)中的小鼠ES細(xì)胞的一種或多種補充物是FBS (90mL FBS/0. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、谷氨酰胺(2. 4mmol/0. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、丙酮酸鈉(O. 6mmol/0. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、非必需氨基酸(〈O. lmmol/0. 5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、2_巰基乙醇、LIF和一種或多種抗生素。在一個實施方案中，在將供體細(xì)胞引入宿主胚胎內(nèi)之前，將供體細(xì)胞維持在具有低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中至少1、2、3、4、5或6天，或I周，8、9、110、11或12天，2周、3周或4周。在特定實施方案中，在將供體細(xì)胞引入宿主胚胎內(nèi)之前，將供體細(xì)胞維持在具有低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中至少2-4周。在一個實施方案中，在將供體細(xì)胞引入宿主胚胎內(nèi)之前，將供體細(xì)胞維持(例如冷凍)在包含低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中，并且將供體細(xì)胞解凍且維持在包含低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中至少1、2、3或4或更多天。在特定實施方案中，在引入宿主胚胎內(nèi)之前，將供體細(xì)胞在包含低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中傳代至少一次，將細(xì)胞在包含低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中冷凍，并且將細(xì)胞在包含低鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中解凍且生長1、2、3、4、5或6天或更久，或I周，8、9、110、11或12天，2周、3周或4周或更久。在一個實施方案中，在引入宿主胚胎內(nèi)之前，將供體細(xì)胞維持一、二、三或四天的時期。在一個實施方案中，將供體細(xì)胞維持在包含所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基中3天的時期。在一個方面，提供了用于在相同H)代中制備各自完全衍生自供體ES細(xì)胞的能育的小鼠交配對的方法，其包括將供體雄性小鼠XYES細(xì)胞維持在如本文描述的包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補充物的培養(yǎng)物中，其中所述ES細(xì)胞維持在基礎(chǔ)培養(yǎng)基和補充物中至少一天的時期JfES細(xì)胞引入宿主胚胎(例如來自XX小鼠)內(nèi)以形成嵌合胚；使嵌合胚在合適小鼠中孕育至足月；且由合適小鼠獲得一窩小鼠幼崽，其包含完全衍生自供體ES細(xì)胞的H)代能育的雄性XY小鼠，且包含完全衍生自供體ES細(xì)胞的H)代能育的雌性XY小鼠。在一個實施方案中，供體ES細(xì)胞包含遺傳修飾。在一個實施方案中，供體ES細(xì)胞包含其為雜合的遺傳修飾。在一個實施方案中，供體ES細(xì)胞包含雜合的遺傳修飾，H)代能育的雄性小鼠和H)代能育的雌性XY小鼠各自對于遺傳修飾是雜合的，并且H)代能育的雄性和H)代能育的雌性彼此交配，且產(chǎn)生對于遺傳修飾純合的Fl代小鼠的后代。在一個實施方案中，將ES細(xì)胞維持兩天、三天或四天或更久的時期。在一個方面，提供了用于在H)代中制備能育的雌性XY小鼠的方法，其包括步驟Ca)在包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和適合于維持培養(yǎng)中的小鼠ES細(xì)胞的補充物的培養(yǎng)基中維持供體XY小鼠ES細(xì)胞，(b)將供體XY小鼠ES細(xì)胞引入宿主胚胎內(nèi)，(c)孕育宿主胚胎，和(d)獲得XY雌性小鼠后代，其中在達(dá)到性成熟后XY雌性小鼠是能育的。根據(jù)這個方面的基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示選自下述的一種或多種特征(I )200m0sm/kg至小于329m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度，(2)約ll-13mS/cm的導(dǎo)電性，(3)濃度約50_110mM的堿金屬和鹵素的鹽，(4)約17_30mM的碳酸鹽濃度，和(5)約85-130mM的堿金屬鹵鹽和碳酸鹽總濃度。在一個實施方案中，供體XY小鼠ES細(xì)胞包含遺傳修飾。在一些實施方案中，遺傳修飾包含內(nèi)源核酸序列、一個或多個核酸的取代、內(nèi)源核酸序列由異源核酸序列的替換、敲除和敲入中的一種或多種。在一個特定實施方案中，遺傳修飾是STEAP2基因的敲除。在一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基尤其含有(顯不)50±5mM NaCl和26±5mM碳酸鹽，具有218±22m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約3mg/mLNaCl和2. 2mg/mL碳酸氫鈉,具有約218m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在另一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示87±5mM NaCl和18±5mM，具有261±26m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約5. lmg/mL NaCl和I. 5mg/mL碳酸氫鈉,具有約261m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在另一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示110 ±5mM NaCl和18 ±5mM碳酸氫鈉，具有 294±29m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約6. 4mg/mL NaCl和I. 5mg/mL碳酸氫鈉,具有約294m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在另一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示87±5mM NaCl和26±5mM碳酸氫鈉，具有約270±27m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約5. lmg/mLNaCl和2. 2mg/mL碳酸氫鈉,具有約270m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在另一個實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示87±5mM NaCl、26±5mM碳酸氫鈉和86 土 5mM葡萄糖，具有322 土 32m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯不約5. lmg/mL NaCl、約2. 2mg/mL碳酸氫鈉和約15. 5mg/mL葡萄糖,具有約322m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在一個方面，提供了用于在Fl代中產(chǎn)生對于遺傳修飾純合的轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，其包括步驟(a)使根據(jù)前述方法產(chǎn)生的H) XY能育的雌性小鼠與同期組群H) XY雄性小鼠雜交，和(b)獲得對于遺傳修飾是雜合的Fl后代小鼠。根據(jù)這個方面，F(xiàn)O XY能育的雌性小鼠和H) XY雄性小鼠各自對于遺傳修飾是雜合的。在一些實施方案中，遺傳修飾包含內(nèi)源核酸序列、一個或多個核酸的取代、內(nèi)源核酸序列由異源核酸序列的替換、敲除和敲入中的一種或多種。在一個特定實施方案中，F(xiàn)O XY能育的雌性小鼠根據(jù)前述方法制備，其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示50±5mM NaCl和26±5mM碳酸鹽，具有218±22m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約3mg/mL NaCl和2. 2mg/mL碳酸氫鈉,具有約218m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在一個方面，提供了根據(jù)前述方法產(chǎn)生的對于遺傳修飾純合的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一個方面，提供了根據(jù)前述方法中的任何產(chǎn)生的能育的雌性XY小鼠。在一個實施方案中，將由其衍生XY雌性小鼠的ES細(xì)胞維持在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示50±5mM NaCl和26±5mM碳酸鈉，具有218±22m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。在特定實施方案中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯不約3mg/mL NaCl和2. 2mg/mL碳酸鈉,具有約218m0sm/kg的摩爾滲透壓濃度。除非明確說明，或由上下文顯而易見的，本文描述的任何方面或?qū)嵤┓桨缚梢员舜私M合。附圖
簡述
圖I顯示使用由不同XY ES細(xì)胞克隆制備的H)代雌性XY小鼠的交配結(jié)果。圖2顯示由ES細(xì)胞生成XY雌性小鼠，所述ES細(xì)胞與低鹽DMEM、DMEM或補充有FS的低鹽DMEM (ffnt-3a-條件培養(yǎng)基，即通過由Wnt_3a表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的小鼠L細(xì)胞條件化的培養(yǎng)基)、NaCl和NaHCO3 —起溫育。發(fā)明詳述本公開內(nèi)容中引用的所有出版物在此引入作為參考。
短語“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”包括本領(lǐng)域已知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如DMEM)，其適合于用于(伴隨加入的補充物)生長或維持培養(yǎng)中的ES細(xì)胞。適合于制備能育的XY雌性的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(即，“低鹽DMEM”)不同于一般用于將ES細(xì)胞維持在培養(yǎng)中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。為了一般而言討論基礎(chǔ)培養(yǎng)基的目的，不適合于制備能育的XY雌性的基礎(chǔ)培養(yǎng)基在這個部分和下表中(例如一般的DMEM培養(yǎng)基)描述為“DMEM”。為了討論適合于制備能育的XY雌性的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的目的，使用短語“低鹽DMEM”。在一般用于維持培養(yǎng)中的ES細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如DMEM)和適合于制備能育的XY雌性的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(例如“低鹽DMEM”)之間的差異在本文中連接。短語“低鹽DMEM”為了方便使用；用于制備能育的XY雌性的合適DMEM顯示不限于“低鹽”的特征，還包括本文描述的那些。例如，通過改變?nèi)鐚τ诒疚奶峁┑穆然c和/或碳酸氫鈉濃度，如與表I中所示的DMEM相比較的，其還導(dǎo)致不同的摩爾滲透壓濃度和不同的導(dǎo)電性，表I中所示的DMEM可以制備為適合于制備能育的XY雌性的?；A(chǔ)培養(yǎng)基的例子是以多種形式的達(dá)爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)(例如Invitrogen DMEM，目錄號11971-025)(表I)。合適的低鹽DMEM可作為KO-DMEM (Invitrogen目錄號10829-018)商購獲得。當(dāng)用于維持培養(yǎng)中的細(xì)胞用于用作供體細(xì)胞時，基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般補充有本領(lǐng)域已知的許多補充物。此類補充物在本公開內(nèi)容中指示為“補充物”或“+補充物”。
_表i:用于維持ES細(xì)皰的DMEM基礎(chǔ)藥養(yǎng)基_ _組分mg/L__mM _甘氨酸 30__0,4
_L-贛氨酸·ΗΟ 840,398
_L-胱氨酸·2Η<1 630,201
_L-谷氨酰胺584__4
_L-組氨酸·Ηα·Η20 42__0.2
_L-異亮氨酸105 0,802_L-亮氨酸105 0,802L-賴氨酸·ΗΟ1460,798
L-甲硫氨酸300.201
_L-苯丙氨酸66__0.4
L-絲氨酸420.4
_L-蘇氫酸950.798
L-色氨酸160J784
_L-酪氨酸二補益二水合物1040.398
L-纈氨酸940.80權(quán)利要求
1.一種用于在H)代中制備能育的雌性XY小鼠的方法，其包括 Ca)在包含下述的培養(yǎng)基中維持供體XY小鼠ES細(xì)胞 (i)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，和 (ii)適合于維持培養(yǎng)中的小鼠ES細(xì)胞的補充物， 其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示出選自下述的特征200m0sm/kg-小于329mOsm/kg的摩爾滲透壓濃度、約ll_13mS/cm的導(dǎo)電性、濃度約50_110mM的堿金屬和鹵素的鹽、約17_30mM的碳酸鹽濃度、約85-130mM的堿金屬鹵鹽和碳酸鹽總濃度、和其中任何兩種或多種的組合； (b)將所述供體XY小鼠ES細(xì)胞引入宿主胚胎內(nèi)； (c)孕育所述宿主胚胎；和 Cd)獲得XY雌性小鼠后代，其中在達(dá)到性成熟后，所述XY雌性小鼠是能育的。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述供體XY小鼠ES細(xì)胞包含遺傳修飾。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述遺傳修飾包含內(nèi)源核酸序列、一個或多個核酸的取代、內(nèi)源核酸序列由異源核酸序列的替換、敲除和敲入中的一種或多種。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述遺傳修飾是STEAP2基因的敲除。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示50±5mMNaCl、26±5mM碳酸鹽和 218±22mOsm/kg。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法,其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約3mg/mLNaCl>2. 2mg/mL碳酸氫鈉和218mOsm/kg。
7.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示87±5mMNaCl、18±5mM碳酸鹽和 261 ±26mOsm/kg。
8.權(quán)利要求1-4和7中任一項的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約5.lmg/mL NaCl,I. 5mg/mL 碳酸氫鈉和 261mOsm/kg。
9.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示110±5mMNaCl、18±5mM碳酸鹽和 294±29mOsm/kg。
10.權(quán)利要求1-4和9中任一項的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約6.4mg/mL NaCl,1.5mg/mL 碳酸氫鈉和 294mOsm/kg。
11.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示87±5mMNaCl、26±5mM碳酸鹽和 270±27m0sm/kg。
12.權(quán)利要求1-4和11中任一項的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約5.lmg/mL NaCl,2.2mg/mL 碳酸氫鈉和 270m0sm/kg。
13.權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示87±5mMNaCl、26±5mM碳酸鹽、86±5mM葡萄糖和322±32mOsm/kg。
14.權(quán)利要求1-4和13中任一項的方法，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示約5.lmg/mL NaCl,2.2mg/mL 碳酸氫鈉、15. 5mg/mL 葡萄糖和 322mOsm/kg。
15.—種在Fl代中產(chǎn)生對于遺傳修飾純合的轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，其包括使權(quán)利要求1-14中任一項的H) XY能育的雌性小鼠與同期組群H) XY雄性小鼠雜交，其中所述H) XY能育的雌性小鼠和H) XY雄性小鼠各自對于所述遺傳修飾是雜合的，且獲得對于所述遺傳修飾是雜合的Fl后代小鼠。
16.權(quán)利要求15的方法,其中所述遺傳修飾包含內(nèi)源核酸序列、一個或多個核酸的取代、內(nèi)源核酸序列由異源核酸序列的替換、敲除和敲入中的一種或多種。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述H)XY能育的雌性小鼠根據(jù)權(quán)利要求6制備。
18.—種對于遺傳修飾純合的轉(zhuǎn)基因小鼠，其根據(jù)權(quán)利要求15-17中任一項產(chǎn)生。
19.一種能育的雌性XY小鼠，其根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項產(chǎn)生。
20.權(quán)利要求19的能育的雌性XY小鼠，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基顯示50±5mMNaCl,26 + 5mM 碳酸鹽和 218±22mOsm/kg。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于由XY供體細(xì)胞和合適的宿主胚胎制備表型雌性的能育動物的方法和組合物。提供了用于將XY供體細(xì)胞維持在培養(yǎng)中的培養(yǎng)基和方法，在引入宿主胚胎內(nèi)和在合適的宿主中孕育后，所述XY供體細(xì)胞將導(dǎo)致能育的XY雌性動物。描述了用于由供體XY細(xì)胞和宿主胚胎在F0代中制備能育的雌性動物的方法和組合物，以及用于由雜合的F0能育雄性和雜合的F0能育雌性同胞制備F1后代的方法，所述F1后代對于修飾是純合的。
文檔編號C12N15/873GK102933074SQ201180028717
公開日2013年2月13日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者W·奧爾巴克, T·德希阿拉, W·普埃米洛, D·弗倫德維, D·巴倫蘇埃拉 申請人:瑞澤恩制藥公司