專利名稱：β-內酰胺酶抗藥性的質譜測量的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生β -內酰胺酶的細菌的抗藥性的確定，包括〃超廣譜β -內酰胺酶 〃 (ESBL)?，F(xiàn)有技術
我們可以快速輕松地對許多微生物類型，特別是細菌和單細胞真菌，進行質譜鑒定將少量微生物從普通方法培養(yǎng)的菌落或從營養(yǎng)培養(yǎng)基中的菌落轉移到質譜樣品載板， 并在載板中與含有基質的溶液混合，然后在基質輔助激光解吸電離后進行質譜測量。如果在微生物中的蛋白質有足夠的濃度，則質譜圖可顯示特征蛋白質的質量和強度。該質譜圖每次可顯示微生物中大約40至80種蛋白質的峰值，可通過利用質譜庫中成千上萬的參照質譜進行相似性分析來確定其身份。這里〃鑒定〃 一詞表示分類學鑒定，例如，科、屬和種的確定。許多地方正在進行研究，以便對具有成千上萬微生物的參照質譜庫進行整理，這些是可靠的且經(jīng)過法律批準的醫(yī)用質譜(所謂的〃已驗證〃的質譜庫)。
在許多研究中以及微生物實驗室的日常工作中，這種鑒定微生物的方法已被證明非常成功。這種方法十分快速，成本低，而且誤差率極低，遠低于傳統(tǒng)微生物鑒定方法。
這些方法的特殊版本不僅可以用于鑒定微生物種類，而且還經(jīng)常用于鑒定亞種， 有時甚至用于鑒定株系，如果它們與常見且可質譜檢測的蛋白質在質量和強度方面存在不同。關于更多詳細描述，請參閱專利申請例如DE 10 2009 032 649 Al (T. Maier和 M-Kostrzewa, 2009，US2011/0012016 Al;GB 2 471 746 Α)，其不僅提供了該方法的詳細說明，而且還提供了更好的品種搜索方法。
微生物的鑒定對于傳染病特別是敗血癥非常關鍵。重要的一點是其能夠非常快速的鑒定病原體的種類，以便立即采取正確的治療措施。質譜鑒定已在這些方面接受了試驗和驗證，目前正在逐漸獲得臨床和微生物實驗室的認可。
然而，在醫(yī)學領域不僅需要快速鑒定，而且還需要檢測出對常用抗生素的抗藥性。 在不知道抗藥性的情況下將無法快速控制疾病。因此，不僅有必要進行快速鑒定，而且還有必要快速確定并辨別微生物物種的抗藥性。人們已經(jīng)知道一些微生物物種對特定抗生素幾乎具有完全的抗藥性，因此在精確鑒定后才確定抗藥性毫無意義。然而，大多數(shù)情況下，物種會有無抗藥性的株系，還會有輕微抗藥性，特別是高抗藥性的株系，抗藥性會隨著抗生素種類的不同而不同。因此，確定抗藥性的類型和強度非常重要。
似乎顯而易見的是，質譜儀不僅可用于分類學鑒定，而且還可用于確定微生物對特定抗生素的抗藥性，特別是細菌的抗藥性。但是，已證明這一任務非常艱巨。盡管抗藥性必須通過新蛋白質或改性蛋白質的存在來表示，但迄今為止還未證明可在質譜儀測量的蛋白質表達譜中直接進行鑒定。畢竟，在微生物的成百上千或甚至成千上萬的蛋白質中， 質譜圖內僅能測量40至80種蛋白質。因此必須間接地確定抗藥性。這種抗藥性確定的首次嘗試在文件 DE 10 2006 021 493 Β4(V. Govorun 和 J. Franzen;GB 2 438 066 B;US 2008/0009029 Al)中介紹；但是這種方法迄今為止還未得到認可。該方法主要基于在加入抗生素后因細胞死亡而引起的蛋白質表達譜的變化，亦或基于與抗藥性參照微生物的比較而確定的繁殖停止。
抗生素抗藥性一詞歸類了微生物種的特征(這里主要是細菌)，即減弱或完全中和抗生素活性物質的作用?？顾幮袁F(xiàn)在很普遍，在美國，醫(yī)院內獲得的大約70%的傳染性細菌都至少對一種抗生素具有抗藥性?；颊呓?jīng)常會傳染那些對若干種抗生素具有抗藥性的細菌株系(多抗藥性)。所謂的問題細菌是指抗甲氧西林性金黃色葡萄球菌(MRSA)、假單胞菌屬、 帶有超廣譜β -內酰胺酶(ESBL)抗藥性的大腸桿菌及結核分枝桿菌。由CDC(美國疾病控制與預防中心)所做的評估認為2004年在醫(yī)院有兩百萬傳染病例，大約有九萬人死亡，遠遠高于因交通事故或家庭或工業(yè)事故而導致的死亡人數(shù)。
日常使用的抗生素一詞通常表示用于治療細菌傳染性疾病的藥劑或藥物產(chǎn)品?？股卦卺t(yī)學界取得的巨大成功首先是青霉素。雖然青霉素取得了成功，但也首次出現(xiàn)了抗藥性，這促使研究人員去尋找和發(fā)現(xiàn)更多的抗生素鏈霉素、氯霉素、金霉素、四環(huán)素及許多其他抗生素。現(xiàn)在已知的大部分抗生素都源自于自然物質。通俗的講，青霉素現(xiàn)在是抗生素的代名詞。
青霉素是β -內酰胺類抗生素。這些β -內酰胺與青霉素結合蛋白(PBP)結合， 即負責形成加固細胞壁的肽鍵的肽聚糖轉肽酶。在β-內酰胺和PBP間的結合導致PBP失效。隨著細菌的生長，有效PBP的數(shù)量不足會導致細胞壁損害，細胞膜會因此失去對滲透性的控制而無法調節(jié)細胞質的濃度。短時間后細菌就會死亡。在極端條件下，可在實驗室內觀察到完全〃破裂〃的細菌細胞。這是β-內酰胺的殺菌方式。
自從首次使用青霉素后，細菌已逐漸發(fā)展出不同類型的抗藥性。細菌對β-內酰胺產(chǎn)生抗藥性的一種重要類型是形成酶(β -內酰胺酶)，這種酶通過水解，以催化的方式破壞β-內酰胺環(huán)，并因此致使β-內酰胺失效?，F(xiàn)在已知的β-內酰胺酶有340多種，由多種類型的細菌形成?？筛鶕?jù)細菌的總體結構或作用方式將它們分成不同類別。通過突變最初產(chǎn)生的酶合成遺傳信息由染色體或質粒繼承。質粒信息可通過各種途徑在細菌之間轉移，甚至可通過接觸在不同物種的細菌之間轉移("水平轉移")。根據(jù)β-內酰胺酶的作用，可對青霉素酶和頭孢菌素酶進行區(qū)別，但還有更多的類別。這 些酶的催化作用意味著少量的β_內酰胺酶就足夠破壞大量的β_內酰胺類抗生素。
現(xiàn)在存在大量β -內酰胺類抗生素的衍生物，在它們中有若干種青霉素(芐青霉素、口服青霉素、氨基青霉素、異惡唑青霉素、酰基氨基青霉素)、頭孢菌素、單環(huán)β_內酰胺類和碳青霉烯類。這些衍生物通常具有較大的化學基團，以便對β_內酰胺酶產(chǎn)生空間位阻作用。反過來，超廣譜β -內酰胺酶(ESBL)可分裂多種含有β -內酰胺的抗生素。ESBL 最初由β-內酰胺酶上的點突變形成。ESBL的基因位于可從細菌到細菌水平轉移的質粒上。
ESBL攜帶細菌對青霉素、頭孢菌素(1-4代)及單環(huán)β-內酰胺類有抗藥性。攜帶 ESBL基因的主要是大腸桿菌和克雷伯氏菌(革蘭氏陰性菌)，但是微生物學家們焦慮地觀察到這些ESBL抗藥性的快速蔓延。除抗藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)外，超廣譜β -內酰胺酶(ESBL)是傳染研究中最令人擔心的菌類之一。
β -內酰胺酶抑制劑是對抗β -內酰胺酶的一種手段，與β -內酰胺類一起使用以減弱存在于細菌中的β-內酰胺酶的作用。已確立的組合是克拉維酸+氨基青霉素、舒巴坦+氨芐青霉素、他唑巴坦+哌拉西林。不是所有的組合都有最佳的作用。這些手段僅可在仔細鑒定細菌并謹慎確定其抗藥性后使用，因為這些手段也可能非?？焖俚氖А?br> 在二十世紀的70年代和80年代，在抗生素領域進行了很多科研活動。現(xiàn)在對新抗生素的研發(fā)已經(jīng)大大的減少了，盡管抗生素是世界上最常用的處方藥之一，占有13%的市場份額，它們是我們使用藥品的最大類別?，F(xiàn)在已知的抗生素物質大概有8，000種，卻僅僅大約有80種用于治療，這主要是由于副作用和審批成本。根據(jù)德國聯(lián)邦藥品和醫(yī)療器械研究所(BfArM)的統(tǒng)計，2005年在德國總共有2，775種抗生素獲得批準，但是僅僅涵蓋了大約80種抗生素物質。
隨著時間的推移，微生物種對諸如殺細菌劑或殺真菌劑等抗生素產(chǎn)生抗藥性這一問題會變得越來越緊迫。一方面，微生物種對不同類型的抗生素產(chǎn)生抗藥性的速度正在增加；而另一方面，正在研發(fā)的新的醫(yī)用抗生素越來越少。由于沒有作用，許多新抗生素不得不在投入市場一段時間后退出市場，對醫(yī)藥公司來說，研發(fā)新的抗生素越來越困難，而投資這一領域的利潤也越來越少。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)，在1990到2005年間僅正式推出了 3種新的抗生素活性物質，與之對比，1940到1950年間推出了 10種新的抗生素活性物質， 1971到1980年間為5種新的抗生素活性物質。
抗藥性快速增加的原因多種多樣不負責任濫用抗生素，甚至沒必要時也使用抗生素；在傳染媒介完全被破壞之前不負責任地中斷殺菌劑治療；在農(nóng)業(yè)和動物飼養(yǎng)中不負責任地、經(jīng)常為純粹預防而使用抗生素。與非抗藥性物種相比，所有這些做法都促進了抗藥微生物物種的選擇和傳播。
作為治療傳染病的新希望而聞名于上個世紀中葉的抗生素，現(xiàn)在正在快速地失去它的療效。避免這一趨勢的唯一希望就是有針對性地使用治療手段，而且治療必須全部完成，這需要快速鑒定傳染病原體和快速鑒定其對不同類型抗生素的特定抗藥性。
發(fā)明目的
發(fā)明目的是提供一種方法，即可以快速簡單地通過質譜測量來確定微生物、特別是細菌對不同類型的β-內酰胺類抗生素的β-內酰胺酶抗藥性。發(fā)明概要
本發(fā)明提供了一種方法，即可非常方便快速地使用質譜儀測量微生物由于β -內酰胺酶而具有的抗藥性。該方法可在微生物與相應的底物(β -內酰胺類抗生素或定制 β-內酰胺類衍生物)混合幾小時后，通過直接質譜測量β_內酰胺酶在底物上的水解破壞來確定其細菌的抗藥性。細菌在底物上產(chǎn)生的β_內酰胺酶的催化作用導致β_內酰胺環(huán)水解分裂開。底物量減少，取而代之的是出現(xiàn)水解的分裂產(chǎn)物，其質量比抗生素多出18個原子質量單位。
酶的分裂反應非常迅速，但前提是其不會受到底物逐漸減少的影響，則每個分子反應時間大約是I到100毫秒，不同的β-內酰胺酶的特征差異也有所不同。測量反應速度可提供關于β-內酰胺酶類型和強度的初始信息。
原則上可使用任何質譜儀進行測量，但是最好使用進行細菌鑒定的同樣的基質輔助激光解吸電離(MALDI)飛行時間質譜儀。由于用于在幾百個原子質量單位的較低質量范圍內對物質進行電離的MALDI過程(基質輔助激光解吸的電離)將會產(chǎn)生非常強的化學背景，因此最好使用位于低背景區(qū)域的底物。這可通過生成分子量在700到1，200原子質量單位的定制底物來實現(xiàn)。還有利的是，增加底物的質子親和力以增加電離程度。不僅如此， 如果能夠使用較高濃度的底物以增加靈敏度，效果會更好。為了使高濃度的高殺菌作用不會立即殺死細菌，可定制底物使得其抗生素作用(MIC值)相對較小。MIC是在相應抗生素存在下通過β -內酰胺酶抑制劑抑菌的"最低抑制濃度"，可作為測量抗藥性強度和抗生素強度的衡量指標使用。
例如，較好的底物實例是通過共價鍵的方式將6-His標簽與β-內酰胺結合。 6-His標簽由六個組氨酸組成，將分子量增加了大約800原子質量單位，提高了質子親和力，并且還可從反應液體中提取純形式的底物及其分解產(chǎn)物。例如，這種提取可借助使用市售的磁珠進行。在磁珠上有加載鎳離子的螯合物，其可通過可逆的方式結合6-His標簽。 然后就可準備MALDI樣品。該樣品的基質包含經(jīng)過高度富集且提純的剩余底物及其分解產(chǎn)物，因此可實現(xiàn)非常靈敏的測量。
特別是，可通過引入若干種不同類型底物來測定特定的多抗藥性，但是不同底物的定制方式以及它們的引入濃度都必須確保其分解方式可用來鑒定細菌的類別以及 β-內酰胺酶的作用強度。例如，底物可模仿與不同類別抗生素的β-內酰胺環(huán)的接觸。


圖1中頂部的質譜圖顯示了原子質量單位為349. 41摩爾質量的混合氨芐青霉素對于無抗藥性的DH5a株系大腸桿菌懸浮液的作用。氨芐青霉素(這里質量為350原子質量單位)和氨芐青霉素鈉鹽(質量為372原子質量單位)均未發(fā)生分解。相對而言，底部的質譜圖顯示了 ESBL抗藥性株系大腸桿菌對氨芐青霉素及其鈉鹽的作用二者均被分解，分解產(chǎn)物的質量分別為368和390原子質量單位。
優(yōu)選的實施方式
本發(fā)明可提供了一種根據(jù)微生物(特別是細菌)產(chǎn)生β -內酰胺酶來快速方便確定微生物抗藥性的方法。
該方法主要是向細菌懸浮液中加入一種或多種合適的底物。底物可以是β -內酰胺類抗生素或更適宜的定制β-內酰胺類衍生物。如果細菌具有β-內酰胺酶抗藥性，則在合適的培養(yǎng)條件下經(jīng)過數(shù)分鐘至數(shù)小時，β-內酰胺酶會通過水解破壞β-內酰胺環(huán)分解至少一種底物。β-內酰胺酶對底物的水解可直接進行質譜測量。底物量減少，取而代之的是水解的分裂產(chǎn)物，其質量比抗生素多出18個原子質量單位。
在圖1中，在兩個質譜圖中使用β_內酰胺類抗生素氨芐青霉素時，顯示僅在具有抗藥性時發(fā)生的這種水解。上部的質譜圖顯示了原子質量單位為349. 41摩爾質量的氨芐青霉素與DH5a株系大腸桿菌懸浮液混合的結果。該株系沒有抗藥性。因此，可以看到氨芐青霉素(這里質量為350原子質量單位)和氨芐青霉素鈉鹽(質量為372原子質量單位)均未發(fā)生分解。相對而言，底部的質譜圖顯示了 ESBL抗藥性株系大腸桿菌對氨芐青霉素及其鈉鹽的作用二者均被分解，分解產(chǎn)物的質量分別為368和390原子質量單位。
氨芐青霉素是一種半合成產(chǎn)品，抗菌活性藥物來自β_內酰胺類抗生素(青霉素) 的基團。因為其可抑制革蘭氏陽性病原體和一些革蘭氏陰性桿菌，因此作為廣譜抗生素而為人們所熟知。從化學角度上講，氨芐青霉素是一種氨基青霉素。
與所有β -內酰胺類抗生素一樣，氨芐青霉素的殺菌(殺死細菌)作用是對以多種形式存在于不同細菌中的D丙氨酸轉肽酶的抑制作用。這種酶是細菌生長和分裂階段形成新的堅固細胞壁的必須物質。這些轉肽酶也叫做青霉素結合蛋白(PBP)。抑制作用以附著形式進行，β-內酰胺環(huán)為附著基序。附著可阻止新的堅固細胞壁的合成。細胞因此無法分裂，但最初仍能存活直至其生長導致足夠多的細胞壁損壞從而導致細胞的死亡。然而人體細胞的分裂和生長卻不會受到阻礙，因為人體細胞只有細胞膜，沒有細胞壁，因此沒有相應的轉肽酶。
如圖1的示例中，將10微升濃度10毫克/毫升的氨芐青霉素水溶液加入到 Eppendorf試管內。從細菌中選取三組菌落來進行試驗，然后將這些菌落放置于10微升的氨芐青霉素溶液中進行重新懸浮處理。然后將容器在攪拌作用下置于37° C下培養(yǎng)3小時。在完成培養(yǎng)后，將其以13000轉/分的速度離心分離2分鐘，以便將細胞分離出來。剩余的氨芐青霉素和水解反應產(chǎn)物現(xiàn)在處于上清液中。
原則上可使用任何質譜儀進行測量，但是最好使用進行細菌鑒定的同樣的MALDI 飛行時間質譜儀。為此，從該上清液中取1. 5微升置于質譜樣品載板上。樣品干燥以后，將樣品包涂I微升基質溶液。使用的基質是α-氰-4-羥基肉桂酸(HCCA)，其與水混合，濃度為10暈克/暈升,其中含50%乙腈和2. 5%三氟乙酸。樣品再次干燥后,可米用普通的方法使用MALDI飛行時間質譜儀取得制劑的質譜。
作為該示例底物的氨芐青霉素的濃度非常高，要高出治療所需濃度的1000多倍。 事實是這個數(shù)量下的氨芐青霉素也被分解，顯示了超廣譜β_內酰胺酶(ESBL)的非凡作用。很難想象細菌可在這種高濃度下長時間存活，然而，在其壽命期間釋放的少量β-內酰胺酶就足可以催化分裂大量的底物。選擇高濃度是因為可以清楚地看到高于此質量范圍內的高化學背景的信號。如果使用質量范圍大約在800到1000的原子質量單位的底物，則可以使用減少100倍的濃度，這可通過帶有較高分子量的定制底物來實現(xiàn)。
這也有利于增加底物的質子親和力，以便增加電離率。帶有低質量的β-內酰胺類沒有高質子親和力，因此僅有一小部分·的β-內酰胺類在電離過程中發(fā)生電離。例如，可通過插入帶有高質子親和力胺基酸將靈敏度進一步增加10倍。
不僅如此，使用較高濃度的底物還往往有利于進一步增加靈敏度。但是為了避免那些帶有較弱β_內酰胺酶的細菌被高殺菌效果立即殺死，可這樣定制底物，使其抗生素作用(MIC值)相對較小?？股氐淖饔猛ǔｋS著分子尺寸的增加而降低，因為這些大分子滲入細胞壁孔隙而進入細菌內的過程被大大阻礙。
此外，以這種方法定制底物還有利于完全地、方便地從上清液中提取底物。為此， 準備的底物可帶有錨定基團，這樣可使用經(jīng)固定的配體(partner)來提取底物。生物素基團對底物的吸附是本文描述的第一個實例。然后可通過固定在壁上的鏈霉抗生物素蛋白從上清液中提取底物和分解產(chǎn)物。由于生物素和鏈霉抗生物素蛋白之間的結合可逆，因此，底物和分解產(chǎn)物可在使用已知方法進行濃縮后被進一步處理和測量?？稍谑忻嫔腺I到內壁上涂有鏈霉抗生物素蛋白的合適容器，與涂覆如磁珠等微粒子一樣。
例如，較好的可提取底物實施方式是通過共價鍵的方式將6-His標簽與β -內酰胺結合。每個6-His標簽由六個組氨酸組成，將分子量增加了大約800原子質量單位，提高了質子親和力，并且提供一種從反應液體中提取純凈的底物及其分解產(chǎn)物的簡單過程。例如，該提取可通過磁珠執(zhí)行。可在市面上買到涂有螯合物的磁珠。這些螯合物可加載鎳離子。鎳離子以可逆方式與6-His標簽結合。這便于采用已知的方法準備MALDI樣品，該樣品僅包含嵌入基質晶體中的純凈的剩余底物及其分解產(chǎn)物，因此測量的靈敏度將很高。
β -內酰胺酶的分裂反應非常迅速，但前提是其不會受到底物逐漸減少的影響，則每個分子反應時間大約是I到100毫秒。可測量不同β -內酰胺酶的反應速度的特征差異， 并提供關于存在的β-內酰胺酶的強度信息，因此還可指示β-內酰胺酶的類型。最有利的情形是反應速度可在單一質譜圖中測量。例如，如果在半小時后準時停止培養(yǎng)，如果該方法已經(jīng)過相應的校準，則剩余底物和分解產(chǎn)物的比率可用于表示反應速度。
另一個較好的實施方式是在一個多抗藥性的測定中使用若干種不同的定制底物。 例如，底物可攜帶妨礙β -內酰胺酶攻擊的不同類型的立體位阻，如同存在于不同的抗生素中一樣。從分解方式和分解速度就可得出β-內酰胺酶的類型和不同類型抗生素的效果。通過使用合適的底物和選擇正確的濃度，便有可能確定β -內酰胺酶的有效程度。圖1是兩種底物(氨芐青霉素及其鈉鹽)同時分解的簡單示例，盡管此例中沒有使用可抑制分解的帶有不同抗藥性的特制底物。
特別是，微生物抗藥性的測量也可用于從血液或血液培養(yǎng)液中獲得的純凈微生物，如 DE 10 2009 033 368 Al (Τ. Maier; WO 2011/006911Α3)中所述。
除了在MALDI飛行時間質譜儀內使用基質輔助激光解吸(MALDI)進行電離對底物分解進行分析，當然還可以使用其他類型的電離，如電噴霧電離(ESI)，及其他類型的質譜， 如正交離子注入時間飛行質譜(OTOF)、離子回旋共振質譜(ICR-MS)、Kingdon靜電質譜或， 或者尤其是低成本的離子阱質譜。本領域技術人員熟悉所有這些質譜儀和電離方法，因此我們在這里不再進行闡述。
用于測量底物分解和分解產(chǎn)物增加的一個特別合適的選擇就是三重四極桿質譜儀，該質譜儀主要用于對底物和分解產(chǎn)物進行比較測量。這種三重四極桿質譜儀可達到非常高的靈敏度，所以很小量的底物就足以使用這種方法的測量。
為了簡化抗藥性的確定，可采用消毒用品包(packs of consumables)(試劑盒)的形式提供所需的材料中的一些或是全部。特別是，用品包可包含精確量的定制底物，如有需要，還包含相應的基質。它們還可含有在質譜測量后丟棄的一次性MALDI樣品載板。用品包可進行商業(yè)化生產(chǎn)。
可對質譜圖進行直觀評估，還可以通過合適的計算機程序進行評估。特別是，還可研發(fā)并使用可評估多抗藥性測定的程序。這些程序可根據(jù)分解方式立即確定微生物β_內酰胺酶抗藥性的類型和強度，并提供建議性治療方案。
權利要求
1.基于通過微生物生成β-內酰胺酶，確定微生物β-內酰胺抗藥性的方法，其中通過獲得剩余底物和分解產(chǎn)物的質譜對微生物β-內酰胺酶對底物的酶促分解進行質譜測量。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中底物分子包含內酰胺環(huán)。
3.根據(jù)權利要求2的方法，其中底物為β-內酰胺類抗生素或內酰胺類衍生物。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其中底物分子量為700到1200原子質量單位。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其中底物僅具有微弱的抗菌效果。
6.根據(jù)權利要求1的方法，其中底物分子具有可用于從溶液中提取底物的錨定基團。
7.根據(jù)權利要求6的方法，其中錨定基團為生物素基團或6-His標簽。
8.根據(jù)權利要求1的方法，其中同時測量幾種類型底物的分解。
9.根據(jù)權利要求8的方法，其中定制不同類型的底物，從而它們的分解方式使得能夠鑒定內酰胺酶的不同類別。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中關于β-內酰胺環(huán)的底物模擬不同抗生素的立體形態(tài)。
11.根據(jù)權利要求1的方法，其中測量底物分解的反應速度。
12.根據(jù)權利要求1的方法，其中微生物已從血液或血液培養(yǎng)物中獲取。
13.根據(jù)權利要求1的方法，其中對剩余底物及其分解產(chǎn)物的量進行質譜測量，采用基質輔助激光解析的電離。
14.基于微生物產(chǎn)生內酰胺酶來確定微生物內酰胺抗藥性的方法，其包括以下步驟(a)將微生物添加到至少一種能被內酰胺酶分解的底物的溶液中，(b)在特定溫度下對該溶液進行特定時間的溫育，(C)將帶有剩余底物及其分解產(chǎn)物的溶液與微生物分離，和(d)獲得溶液的質譜圖。
15.用于基于微生物產(chǎn)生β_內酰胺酶而質譜確定微生物β_內酰胺酶抗藥性的用品包(試劑盒)，其中用品包提供可被微生物內酰胺酶酶促分解的底物。
16.用于評估用根據(jù)權利要求1的方法獲得的質譜圖的程序。
全文摘要
本發(fā)明涉及對微生物種產(chǎn)生的β-內酰胺酶抗藥性的確定，特別是"超廣譜β-內酰胺酶"(ESBL)。本發(fā)明可提供一種簡單快速測量微生物抗藥性的方法，即測量微生物產(chǎn)生的β-內酰胺酶對β-內酰胺類抗生素的催化作用，這種催化作用是β-內酰胺環(huán)的水解分裂。該方法可在適合的底物(β-內酰胺類抗生素或定制β-內酰胺類衍生物)加入微生物懸浮液幾小時后，通過直接質譜測量β-內酰胺酶在底物上的水解破壞來確定細菌的抗藥性。
文檔編號C12Q1/34GK103003699SQ201180028415
公開日2013年3月27日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權日2010年6月11日
發(fā)明者M·科斯特采瓦, K·米歇爾曼, K·施帕比爾 申請人:布魯克-道爾頓有限公司