專利名稱：重新接種中空纖維生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞的方法
重新接種中空纖維生物反應(yīng)器系統(tǒng)中生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞的方法優(yōu)先權(quán)本專利申請(qǐng)要求于2010年5月5日提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)61/331，660的優(yōu)先權(quán)，且本專利申請(qǐng)是于2008年3月5日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)12/042，763的部分接續(xù)申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
在多種處理和治療中，干細(xì)胞的使用正受到越來(lái)越多的關(guān)注。干細(xì)胞可被用于修復(fù)或替代受損或有缺陷的組織，且具有治療大范圍疾病的廣泛的臨床應(yīng)用。細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)可用于使干細(xì)胞以及其它類型的細(xì)胞(貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞)生長(zhǎng)。在細(xì)胞將要生長(zhǎng)和分裂前，貼壁細(xì)胞需要貼附的表面。而非貼壁細(xì)胞在懸浮液中漂浮的同時(shí)進(jìn)行生長(zhǎng)和分裂。
細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)為生長(zhǎng)的細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物且移除代謝物，以及供應(yīng)有助于細(xì)胞生長(zhǎng)的生理化學(xué)環(huán)境。細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)在本領(lǐng)域是已知的。生物反應(yīng)器或細(xì)胞生長(zhǎng)腔體作為細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的組件在為擴(kuò)增的細(xì)胞提供最優(yōu)化環(huán)境中起到重要作用。在本領(lǐng)域中已知很多類型的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器裝置包括培養(yǎng)瓶、轉(zhuǎn)瓶(roller bottle)、振蕩瓶(shaker flask)、攪拌槽式反應(yīng)器(stirred_tankreactor)、氣升式反應(yīng)器(air-lift reactor)和中空纖維生物反應(yīng)器?！┥锓磻?yīng)器中擴(kuò)增的細(xì)胞達(dá)到細(xì)胞覆蓋或期望的細(xì)胞數(shù)量，則需要收集細(xì)胞，且如果期望進(jìn)ー步的細(xì)胞生長(zhǎng)，則需要將細(xì)胞重新接種在相同或不同的生物反應(yīng)器中。不管使用何種類型的生物反應(yīng)器裝置，為了收集貼壁細(xì)胞，必須首先從細(xì)胞生長(zhǎng)的表面上移除細(xì)胞。為了從生長(zhǎng)表面移除貼壁細(xì)胞，初始清洗細(xì)胞以移除抑制胰蛋白酶的離子(鎂、鈣)。然后將胰蛋白酶添加至經(jīng)清洗的細(xì)胞以使細(xì)胞從表面松落。一旦細(xì)胞被松落，則從膜表面移除它們，且通過(guò)清洗被移除的細(xì)胞或使它們旋轉(zhuǎn)沉淀為細(xì)胞團(tuán)、移除周圍的流體且將它們懸浮在新的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行處理以移除胰蛋白酶。該程序容易在細(xì)胞生長(zhǎng)在平板上的開(kāi)放系統(tǒng)(諸如培養(yǎng)瓶)中進(jìn)行，其中該程序在層流凈化罩中進(jìn)行。但是在使用中空纖維生物反應(yīng)器的封閉系統(tǒng)中，該系統(tǒng)對(duì)大氣是封閉的。沒(méi)有簡(jiǎn)單的方法來(lái)添加流體或從系統(tǒng)中移除流體，且包含在細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的離子由于通過(guò)中空纖維的超濾而從細(xì)胞生長(zhǎng)空間中丟失。因此細(xì)胞存活在被稀釋的培養(yǎng)基(來(lái)自從細(xì)胞初始清洗進(jìn)入系統(tǒng)的添加的流體)、胰蛋白酶(來(lái)自用于使細(xì)胞從膜松落的胰蛋白酶)、且由于超濾培養(yǎng)基中沒(méi)有離子(例如鈣和鎂)圍繞的環(huán)境中。這些因素可造成被直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器中的收集的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)不足。因此，需要開(kāi)發(fā)新的重新接種的方案以在使用中空纖維生物反應(yīng)器的細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)中使用
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于直接重新接種收集的在中空纖維生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞的方法，所述中空纖維生物反應(yīng)器具有內(nèi)毛細(xì)管空間(intracapillary space)和外毛細(xì)管空間(extracapillary space),其中細(xì)胞生長(zhǎng)空間是內(nèi)毛細(xì)管空間或外毛細(xì)管空間中的一種。該方法包括以下步驟從所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間移除生長(zhǎng)培養(yǎng)基；清洗所述細(xì)胞以從所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間移除殘留的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；通過(guò)將胰蛋白酶添加至所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間，使所述細(xì)胞從中空纖維生物反應(yīng)器的中空纖維上松落；從所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間移除細(xì)胞和所有胰蛋白酶；使來(lái)自被移除的細(xì)胞中的胰蛋白酶失活；以及，將被移除的細(xì)胞和胰蛋白酶直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器的細(xì)胞生長(zhǎng)空間中。本發(fā)明還要求了一種制造收集培養(yǎng)基的方法，所述方法通過(guò)使用Chvh+Ov0K =CfVh+Cc;V。計(jì)算培養(yǎng)基中需要的離子和蛋白質(zhì)的量，且將計(jì)算出的量的離子和蛋白質(zhì)加入培養(yǎng)基中，以在將貼壁細(xì)胞直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器中使用。


圖I為在本發(fā)明中有用的中空纖維生物反應(yīng)器的示例圖。 圖2示出了可被本發(fā)明使用的細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的示例圖。圖3是在根據(jù)本發(fā)明完整重新接種的程序之前、過(guò)程中及之后的代謝濃度的示圖。
具體實(shí)施例方式本申請(qǐng)大體涉及用于收集和/或重新接種來(lái)自封閉細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的中空纖維細(xì)胞生長(zhǎng)腔體/生物反應(yīng)器的貼壁細(xì)胞(尤其為間充質(zhì)干細(xì)胞)的無(wú)菌方法。封閉系統(tǒng)指該系統(tǒng)沒(méi)有直接暴露于大氣。從細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)收集擴(kuò)增的細(xì)胞包括從生物反應(yīng)器中移除所有擴(kuò)增的細(xì)胞。重新接種收集到的細(xì)胞包括將所有被移除的細(xì)胞重新裝載在相同或不同的生物反應(yīng)器中以用于進(jìn)ー步擴(kuò)增；或，將收集到的細(xì)胞的一部分重新裝載在相同或不同的生物反應(yīng)器中，同時(shí)保留被移除細(xì)胞的剰余部分用于隨后的應(yīng)用?，F(xiàn)在參考圖1，在正面立視圖中示出了可被本發(fā)明使用的中空纖維細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100的實(shí)例。細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100具有縱向軸LA-LA，且包括細(xì)胞生長(zhǎng)腔體的殼體104。在至少ー個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞生長(zhǎng)腔體的殼體104包括四個(gè)開(kāi)孔(opening)或端ロ(port) IC入口 108、IC出口 120、EC入口 128和EC出口 132。應(yīng)注意在附圖中，相同的元件由相同的標(biāo)記表示。箭頭示出了流體流過(guò)生物反應(yīng)器100 (圖I)和細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)200 (圖2)的方向。多個(gè)中空纖維116被配置在細(xì)胞生長(zhǎng)腔體的殼體104內(nèi)。用于制造中空纖維116的材料可以是能夠被制成中空纖維的任何生物相容的聚合材料。術(shù)語(yǔ)“中空纖維”、“中空纖維毛細(xì)管”和“毛細(xì)管”可互換使用。多個(gè)中空纖維被稱為膜。中空纖維116的末端可通過(guò)連接材料(本文中還被稱為“灌封料(potting) ”或“灌封材料”)被灌封至細(xì)胞生長(zhǎng)腔體的殼體104的末端。灌封料可為用于粘合中空纖維116的任何適當(dāng)?shù)牟牧?，但條件是不阻塞培養(yǎng)基(和如果期望的細(xì)胞)進(jìn)入中空纖維的流動(dòng)。示例性的灌封材料包括(但并不限于)聚氨酯或其它適當(dāng)?shù)恼澈匣蛘掣浇M分。端蓋112和124被分別配置在傳質(zhì)裝置(mass transferdevice)的姆一端。
第一循環(huán)路徑202 (見(jiàn)圖2)中的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基通過(guò)在細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100的第一縱向末端112處的IC入口 108穿入細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100，進(jìn)入且穿過(guò)中空纖維116的毛細(xì)管內(nèi)側(cè)(在各實(shí)施方式中被稱為毛細(xì)管內(nèi)(“1C”)側(cè)或“ IC空間”)，且通過(guò)位于細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100的第二縱向末端124的IC出口 120穿出細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100。在IC入口 108和IC出ロ 120之間的流體路徑限定了細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100的IC部分126。第二循環(huán)路徑204(見(jiàn)圖2)中的流體通過(guò)EC入口 128流入細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100，與中空纖維116的毛細(xì)管外側(cè)或外部(被稱為“EC側(cè)”或“ EC空間”)接觸，且經(jīng)由EC出口132離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100。EC入口 128和EC出口 132之間的流體路徑包括細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100的EC部分136。經(jīng)由EC入口 128進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)腔體的流體與中空纖維116的外部接觸。小分子(例如離子、水、氧氣、乳酸鹽等)可通過(guò)中空纖維從IC空間擴(kuò)散至EC空間，或從EC空間擴(kuò)散至IC空間。大分子量的分子(諸如生長(zhǎng)因子)通常太大而不能穿過(guò) 中空纖維膜，因此留在中空纖維的IC空間中?？筛鶕?jù)需要替換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基還可通過(guò)氣 體轉(zhuǎn)移組件/氧合器232進(jìn)行循環(huán)以根據(jù)需要交換氣體。在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，細(xì)胞通常被容納在第一循環(huán)路徑202中的中空纖維的IC空間內(nèi)，但還可被容納在第二循環(huán)路徑204中的EC空間內(nèi)。不管細(xì)胞生長(zhǎng)在IC空間還是生長(zhǎng)在EC空間中，細(xì)胞均生長(zhǎng)在細(xì)胞生長(zhǎng)空間中。用于制造中空纖維膜的材料可為能夠被制成中空纖維的任何生物相容的聚合材料。圖2示出了可被本發(fā)明使用的細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方式的示例圖。第一流體流動(dòng)路徑206與細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100流體相聯(lián)以形成第一流體循環(huán)路徑202。培養(yǎng)基與細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100中的中空纖維內(nèi)部接觸。流體通過(guò)IC入口 108流入細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100，穿過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100中的中空纖維，且經(jīng)由IC出口 120流出。壓カ計(jì)210測(cè)量離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100的培養(yǎng)基的壓力。培養(yǎng)基流過(guò)IC循環(huán)泵212，其中IC循環(huán)泵212可被用于控制IC環(huán)路202中培養(yǎng)基的流動(dòng)速率。然后培養(yǎng)基流過(guò)閥門(mén)214。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解的，可在不同位置放置額外的閥門(mén)和/或其它裝置以沿流體路徑的各部分分離和/或測(cè)量培養(yǎng)基的特性。因此要理解示出的示例為細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的不同元件的多種可能配置中的ー種，且對(duì)已示出的示例的改變處于ー個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的范圍內(nèi)。對(duì)于IC環(huán)路，可在運(yùn)行過(guò)程中從樣品蛇形管218獲得培養(yǎng)基的樣品。布置在第一流體循環(huán)路徑202中的壓力/溫度計(jì)220能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)運(yùn)行過(guò)程中培養(yǎng)基的壓カ和溫度。然后培養(yǎng)基返回IC入口 108以完成流體循環(huán)路徑202。可將在細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100中生長(zhǎng)/擴(kuò)增的細(xì)胞從細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100中沖洗出來(lái)以進(jìn)入收集袋299，或?yàn)榱诉M(jìn)一步生長(zhǎng)使在上述細(xì)胞在中空纖維內(nèi)重新分布。下面將對(duì)此作更詳細(xì)的描述。第二流體循環(huán)路徑204包括第二流體流動(dòng)路徑284，其中第二流體流動(dòng)路徑284與環(huán)路中的細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100流體相聯(lián)。第二流體循環(huán)路徑204中的流體經(jīng)由EC入口 128進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100，且經(jīng)由EC出口 132離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100。 布置在第二流體循環(huán)路徑204中的壓カ/溫度計(jì)224允許在培養(yǎng)基進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100的EC空間之前測(cè)量培養(yǎng)基的壓カ和溫度。壓カ計(jì)226允許在培養(yǎng)基離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100之后測(cè)量第二流體循環(huán)路徑204中的培養(yǎng)基的壓力。對(duì)于EC環(huán)路，可在運(yùn)行過(guò)程中從樣品端ロ 230或樣品蛇形管(未示出)獲得培養(yǎng)基的樣品。在離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100的EC出口 132后，第二流體循環(huán)路徑204中的流體流過(guò)EC循環(huán)泵228至氣體轉(zhuǎn)移組件232。第二流體流動(dòng)路徑222經(jīng)由氣體轉(zhuǎn)移組件入ロ 234和出ロ 236與氣體轉(zhuǎn)移組件232流體相聯(lián)。在運(yùn)行中，流體培養(yǎng)基經(jīng)由入口 234流入氣體轉(zhuǎn)移組件232，且經(jīng)由出口 236流出氣體轉(zhuǎn)移組件232。氣體轉(zhuǎn)移組件232將氣體加入細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的培養(yǎng)基中或從細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的培養(yǎng)基中移除過(guò)量的氣體(氣泡)。在不同實(shí)施方式中，第二流體循環(huán)路徑204中的培養(yǎng)基與進(jìn)入氣體轉(zhuǎn)移組件232的氣體處于平衡狀態(tài)。氣體轉(zhuǎn)移組件232可為本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)尺寸的組件?？諝饣驓怏w經(jīng)由過(guò)濾器238流入氣體轉(zhuǎn)移組件232，或經(jīng)由過(guò)濾器240流出氣體轉(zhuǎn)移組件232。過(guò)濾器238和240降低或防止氣體轉(zhuǎn)移組件232和相關(guān)聯(lián)的培養(yǎng)基的污染。在起動(dòng)順序(priming sequence)部分的過(guò)程中從系統(tǒng)200排出的空氣或氣體可經(jīng)由氣體轉(zhuǎn)移組件232排入大氣中。在所示出的構(gòu)造中，第一流體循環(huán)路徑202和第二流體循環(huán)路徑204中的流體培養(yǎng)基以相同的方向(并流構(gòu)造(cocurrent configuration))流過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100。細(xì)胞 擴(kuò)增系統(tǒng)200還可配置為以不同方向(逆流構(gòu)造)流動(dòng)。細(xì)胞(來(lái)自袋狀物262)和IC流體培養(yǎng)基(來(lái)自袋狀物246)可經(jīng)由第一流體流動(dòng)路徑206被導(dǎo)入第一流體循環(huán)路徑202。流體容器244 (例如試劑)和246 (例如IC培養(yǎng)基)可分別經(jīng)由閥門(mén)248和250各自與第一流體流入路徑242流體相聯(lián)，或分別經(jīng)由閥門(mén)270和276與第二流體流入路徑274流體相聯(lián)。為了起動(dòng)不同的流入路徑，提供了第一和第ニ無(wú)菌可密封的輸入起動(dòng)路徑208和209。空氣移除腔體256與第一循環(huán)路徑202流體相聯(lián)?？諝庖瞥惑w256可包含一個(gè)或多個(gè)超聲傳感器以檢測(cè)空氣移除腔體256內(nèi)某些測(cè)量位置處的流體缺乏或空氣。例如，可在接近空氣移除腔體256的底部和/或頂部位置處使用超聲傳感器以檢測(cè)在這些位置處的空氣或流體。在起動(dòng)順序部分的過(guò)程中從細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)200排出的空氣或氣體可經(jīng)由管路258排入空氣閥門(mén)260外的大氣，其中管路258與空氣移除腔體256流體相聯(lián)。流體容器262 (例如細(xì)胞流入袋(或鹽水起動(dòng)流體))經(jīng)由閥門(mén)264與第一流體循環(huán)路徑202流體相聯(lián)。可將EC培養(yǎng)基(來(lái)自袋狀物268)或清洗液(來(lái)自袋狀物266)加入第一或第二流體流動(dòng)路徑中。流體容器266可與閥門(mén)270流體相聯(lián)，其中閥門(mén)270經(jīng)由分配閥門(mén)272和第一流體流入路徑242與第一流體循環(huán)路徑202流體相聯(lián)?？蛇x擇地，通過(guò)開(kāi)啟閥門(mén)270且關(guān)閉分配閥門(mén)272，流體容器266可經(jīng)由第二流體流入路徑274和第二流體流動(dòng)路徑284與第二流體循環(huán)路徑204流體相聯(lián)。同樣地，流體容器268與閥門(mén)276流體相聯(lián)，其中閥門(mén)276經(jīng)由第一流體流入路徑242與第一流體循環(huán)路徑202流體相聯(lián)?？蛇x擇地，通過(guò)開(kāi)啟閥門(mén)276且關(guān)閉分配閥門(mén)272，流體容器268可與第二流體流入路徑274流體相聯(lián)。在IC環(huán)路中，流體最初由IC流入泵254推進(jìn)。在EC環(huán)路中，流體最初由EC流入泵278推迸。空氣檢測(cè)器280 (諸如超聲傳感器)也可與第二流體流動(dòng)路徑284相聯(lián)。在至少ー個(gè)實(shí)施方式中，第一和第二流體循環(huán)路徑202和204連接至廢物管路288。當(dāng)開(kāi)啟閥門(mén)290吋，IC培養(yǎng)基可流過(guò)廢物管路288，到達(dá)廢物袋286。同樣地，當(dāng)開(kāi)啟閥門(mén)292吋，EC培養(yǎng)基可流過(guò)廢物管路288，到達(dá)廢物袋286?？山?jīng)由細(xì)胞收集路徑296收集細(xì)胞。這里，通過(guò)泵送包含細(xì)胞的IC培養(yǎng)基穿過(guò)細(xì)胞收集路徑296和閥門(mén)298至細(xì)胞收集袋299，可收集來(lái)自細(xì)胞生長(zhǎng)腔體100的細(xì)胞。細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)200的各組件被容納或置放在培養(yǎng)器300內(nèi)，其中培養(yǎng)器使細(xì)胞和
培養(yǎng)基維持在期望的溫度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可的，任何數(shù)量的流體容器(例如培養(yǎng)基袋)可以任何組合與細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)流體相聯(lián)。用于系統(tǒng)(IC側(cè)和EC側(cè))的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基通常為完全培養(yǎng)基，這意味著培養(yǎng)基包含至少一定百分比的蛋白質(zhì)。在細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中常用的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括人血小板裂解液、人血漿、胎牛血清(FBS)和/或胎牛血清(FCS)。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基可互換使用。基礎(chǔ)培養(yǎng)基是沒(méi)有蛋白質(zhì)源的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基。用于本發(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)例為a -MEM，但是沒(méi)有蛋白質(zhì)的任何常用的培養(yǎng)基均可在本發(fā)明中使用。
如果期望重新接種/重新裝載生物反應(yīng)器用于進(jìn)ー步的細(xì)胞擴(kuò)增，或收集擴(kuò)增的細(xì)胞用于最終的臨床應(yīng)用，則必須啟始從膜移除細(xì)胞的細(xì)胞收集方案。依賴于期望細(xì)胞的最終數(shù)量，可完全或部分重新接種生物反應(yīng)器。重新接種生物反應(yīng)器的目的為從膜表面釋放細(xì)胞，且將它們重新裝載在相同或不同的生物反應(yīng)器中用于繼續(xù)擴(kuò)增。但是，如果在經(jīng)過(guò)收集程序后被沖洗出生物反應(yīng)器的細(xì)胞被直接重新接種在相同或不同的生物反應(yīng)器中，則這些細(xì)胞不生長(zhǎng)。直接重新接種意味著從生物反應(yīng)器移除的細(xì)胞在重新接種前不經(jīng)過(guò)任何額外的程序。這被示于下面的表I中。在本實(shí)驗(yàn)中，IC環(huán)路202和EC環(huán)路204中的培養(yǎng)基與PBS交換以從系統(tǒng)的IC環(huán)路和EC環(huán)路移除完全培養(yǎng)基以及鎂離子和鈣離子。將胰蛋白酶溶液從袋狀物244 (或246、266或268)導(dǎo)入第一流體循環(huán)路徑202。在停留一段時(shí)間以允許胰蛋白酶使細(xì)胞從IC膜分離后，將完全培養(yǎng)基從袋狀物246 (或244、266或268)重新導(dǎo)入第一流體循環(huán)路徑202以使胰蛋白酶失活，且將細(xì)胞推出生物反應(yīng)器的IC側(cè)，穿過(guò)管狀管路296，進(jìn)入細(xì)胞收集袋299。從細(xì)胞收集袋299直接獲得細(xì)胞，且將這些細(xì)胞直接裝載在新的生物反應(yīng)器中，或在裝載到新的反應(yīng)器中之前將這些細(xì)胞離心下來(lái)且在IOOml基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行清洗。如在表I中可看出在將細(xì)胞產(chǎn)物裝載在新的生物反應(yīng)器中之前使該細(xì)胞產(chǎn)物經(jīng)過(guò)清洗步驟以替代流體，則裝載有該細(xì)胞產(chǎn)物的生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)好很多。
直接裝栽-裝載前沒(méi)有清洗裝載前經(jīng)初始清洗
初始裝載的細(xì)胞數(shù)量收集后的細(xì)胞數(shù)量初始裝載的細(xì)胞數(shù)量收集后的細(xì)胞數(shù)量3.63 X 10'23.6 x IO73.86 x 10;42.4 x 10'表I如從表中可看出與將細(xì)胞直接裝載在中空纖維生物反應(yīng)器中相比，在將收集的細(xì)胞重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器中之前清洗收集的細(xì)胞顯示出更好的細(xì)胞生長(zhǎng)。但是清洗步驟為可出現(xiàn)擴(kuò)增細(xì)胞被污染之處，且該步驟是細(xì)胞擴(kuò)增過(guò)程中的額外步驟。允許直接重新接種收集的細(xì)胞而沒(méi)有額外的清洗步驟的程序?qū)⑹怯欣摹Ｒ虼?，作為清洗?xì)胞的替代方式，在連接至細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)200之前可將蛋白質(zhì)源(諸如FBS)(作為ー個(gè)實(shí)例，而并不意于進(jìn)行限制)添加至收集袋299 (使得收集袋中蛋白質(zhì)的濃度為100% )。在收集的細(xì)胞流入袋狀物中之前，還可以I 100%之間的任何濃度將蛋白質(zhì)添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基(以制成完全培養(yǎng)基)。在收集袋中額外濃度的蛋白質(zhì)可通過(guò)收集的細(xì)胞(另有胰蛋白酶，另有用于將細(xì)胞推出生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基)稀釋以幫助細(xì)胞建立更加正常的環(huán)境，這樣該細(xì)胞可被直接重新接種。在另ー實(shí)施方式中，在開(kāi)始收集程序之前，來(lái)自任意袋狀物244、246、266或268的完全培養(yǎng)基或単獨(dú)的蛋白質(zhì)可經(jīng)由泵212或254被泵入收集袋299。以比含上述細(xì)胞的培養(yǎng)基穿過(guò)生物反應(yīng)器的IC側(cè)移動(dòng)更快的速率將完全培養(yǎng)基或蛋白質(zhì)泵入收集袋299中，以便到收集到的細(xì)胞到達(dá)收集袋的時(shí)候，該收集袋已被完全培養(yǎng)基或蛋白質(zhì)裝滿。還可將完全培養(yǎng)基或単獨(dú)的蛋白質(zhì)直接添加到管狀管路296中，其中管狀管路296將細(xì)胞運(yùn)載出生物反應(yīng)器且運(yùn)載至收集袋299中。在該實(shí)施方式中，可在沿管路的任意點(diǎn)處將蛋白質(zhì)或完全培養(yǎng)基從袋狀物310直接泵入管路296中。將上述細(xì)胞從端ロ 120清洗出生物反應(yīng)器100，且進(jìn)入管路296。這些細(xì)胞將與管狀管路296中的蛋白質(zhì)源或完全培養(yǎng)基混合，且立即處于有助于細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境中。因此這些細(xì)胞可被直接重新接種。
在所述的實(shí)施方式中，當(dāng)暴露于蛋白質(zhì)源時(shí)，懸浮收集到的細(xì)胞的培養(yǎng)基中包含的胰蛋白酶將被立即中和，且可將這些細(xì)胞直接重新接種在新的或相同的生物反應(yīng)器中，而不需要額外的清洗步驟。這些程序還使得細(xì)胞在緊接收集程序之后更加容易存活，因?yàn)樵诒景l(fā)明之前(如之前所實(shí)踐的)，由于在收集程序的過(guò)程中將所有蛋白質(zhì)從細(xì)胞環(huán)境中移除，細(xì)胞在無(wú)蛋白質(zhì)的環(huán)境中存活一段時(shí)間。蛋白質(zhì)的缺乏不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。為了補(bǔ)償作為在封閉的中空纖維系統(tǒng)中收集細(xì)胞的結(jié)果而出現(xiàn)的細(xì)胞環(huán)境中離子的缺乏，開(kāi)發(fā)了新的收集培養(yǎng)基。使用該收集培養(yǎng)基以直接重新接種從中空纖維生物反應(yīng)器收集的貼壁細(xì)胞(諸如間充質(zhì)干細(xì)胞)的優(yōu)點(diǎn)在于收集培養(yǎng)基具有足夠的代謝物以補(bǔ)償細(xì)胞環(huán)境中離子的缺乏，且使細(xì)胞在重新接種后能夠隨即開(kāi)始生長(zhǎng)。下面的表2將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的離子濃度與新的收集培養(yǎng)基的離子濃度進(jìn)行對(duì)比。在該實(shí)施例中，使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為a-MEM。如在表中可看出基礎(chǔ)培養(yǎng)基和收集培養(yǎng)基的成分相同，但收集培養(yǎng)基具有更高濃度的鈣、鎂和葡萄糖以補(bǔ)償在收集程序的過(guò)程中通過(guò)中空纖維的那些代謝物的損失。
權(quán)利要求
1.一種用于直接重新接種收集到的在中空纖維生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞的方法，所述中空纖維生物反應(yīng)器具有內(nèi)毛細(xì)管空間和外毛細(xì)管空間，其中細(xì)胞生長(zhǎng)空間是所述內(nèi)毛細(xì)管空間或所述外毛細(xì)管空間中的ー個(gè)，所述方法包括以下步驟 從所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間移除所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基； 清洗所述細(xì)胞以從所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間移除殘留的生長(zhǎng)培養(yǎng)基； 通過(guò)將胰蛋白酶添加至所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間，使所述細(xì)胞從所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間松落； 從所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間移除所述細(xì)胞和所有的胰蛋白酶； 使來(lái)自被移除的所述細(xì)胞中的胰蛋白酶失活；以及 將被移除的所述細(xì)胞和胰蛋白酶直接重新接種到中空纖維生物反應(yīng)器的所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中移除所述細(xì)胞和所有的胰蛋白酶的步驟進(jìn)一歩包括以下步驟 推動(dòng)流體從不是所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間的所述內(nèi)毛細(xì)管空間或所述外毛細(xì)管空間中的一個(gè)穿過(guò)所述中空纖維流至所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中使所述胰蛋白酶失活的步驟進(jìn)一歩包括以下步驟 將蛋白質(zhì)添加至被移除的所述細(xì)胞和胰蛋白酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述添加蛋白質(zhì)的步驟進(jìn)一歩包括以下步驟 在添加被移除的所述細(xì)胞和胰蛋白酶之前，將蛋白質(zhì)添加至細(xì)胞收集袋。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中使所述胰蛋白酶失活的步驟進(jìn)一歩包括以下步驟 將完全培養(yǎng)基添加至被移除的所述細(xì)胞和胰蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述添加蛋白質(zhì)的步驟進(jìn)一歩包括以下步驟 當(dāng)從所述細(xì)胞生長(zhǎng)空間移除所述細(xì)胞和胰蛋白酶時(shí)，將蛋白質(zhì)直接添加至被移除的所述細(xì)胞和胰蛋白酶。
7.ー種用于收集在中空纖維生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)基，包括 基礎(chǔ)培養(yǎng)基； 蛋白質(zhì)； 3.9mM氯化I丐； 9. 91mM無(wú)水D-葡萄糖；以及 2.24mM硫化鎂。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基是a-MEM。
9.一種用于制造收集培養(yǎng)基的方法，包括以下步驟 使用ChVh+Ov0K= CfVdCc^計(jì)算在所述培養(yǎng)基中需要的離子和蛋白質(zhì)的量；以及 將計(jì)算出的量的所述離子和蛋白質(zhì)添加至所述培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及直接重新接種收集的在中空纖維生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞的方法。本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于將貼壁細(xì)胞直接重新接種在中空纖維生物反應(yīng)器中的收集培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102869762SQ201180021315
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月5日
發(fā)明者格倫·德?tīng)栘愄亍ぐ蔡仨f勒, 大衛(wèi)·A·溫德米勒, 莫尼克·吉文斯 申請(qǐng)人:泰爾茂比司特公司