專利名稱：用于平行分離和/或純化rna和dna的方法
用于平行分離和/或純化RNA和DNA的方法本發(fā)明涉及一種經(jīng)固定的同一生物學(xué)樣本中平行分離和/或純化RNA和DNA方法，以及根據(jù)本發(fā)明方法分離的核酸的定量和分析，本發(fā)明還涉及一種用于從經(jīng)固定的樣本中平行分離和/或純化RNA和DNA的試劑盒，以及該試劑盒在關(guān)于疾病治療的療法和/或監(jiān)視的診斷、預(yù)后、決策中的應(yīng)用。如果將生物學(xué)材料，如組織碎片或分離的細(xì)胞，從活的生物體中移除，細(xì)胞就會在短時間內(nèi)死亡。很快地，死亡的細(xì)胞先通過自我分解或發(fā)酵作用，然后被細(xì)菌分解，從而破壞原始細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)。如果細(xì)胞或組織碎片從生物體中移除用于組織學(xué)檢查，推薦對移除的(taken)生物學(xué)樣本進(jìn)行固定從而防止降解。理想地是，固定后的樣本結(jié)構(gòu)大體上沒有改變，允許進(jìn)行組織學(xué)評價(jià)。固定還允許對樣本進(jìn)行長時間保存和存檔(archiving)。由于這些原因，只有以經(jīng)固定的材料為基礎(chǔ)才有可能進(jìn)行許多形態(tài)學(xué)檢查。通常，使用使蛋白沉淀或蛋白交聯(lián)的化合物完成固定，如酸類、醇類、酮類或醛類，
特別是戊二醛或甲醛。在這里，用甲醛(以水(性)溶液的形式使用，被稱為“福爾馬林”)進(jìn)行固定，然后將經(jīng)固定的樣本包埋于石蠟中，這在病理學(xué)中是特別重要的，這是因?yàn)榧?xì)胞和組織結(jié)構(gòu)保存得特別好。在下文中，以這種方式固定的材料被稱為“經(jīng)福爾馬林固定的、石蠟包埋的材料”或“FFPE材料”。然而，樣品的固定，特別是用福爾馬林固定，具有不足之處，這是由于甲醛導(dǎo)致的交聯(lián)效應(yīng)，不僅蛋白質(zhì)，而且存在于樣本中的各種其他生物分子包括核酸，互相共價(jià)交聯(lián)，因此，將核酸分子(DNA或RNA)從這樣的樣本中分離是非常困難的。但是，對于許多分子水平的調(diào)查來說，核酸的分離是非常重要的。在WO 2007/068764中，描述了一種從這樣經(jīng)固定的樣本中分離核酸的方法。所描述的方法使得打斷生物樣本中經(jīng)固定形成的交聯(lián)以及分離一種類型的核酸(或DNA，或RNA)成為可能，然后可以進(jìn)行，例如PCR或RT-PCR分析。在分子病理學(xué)領(lǐng)域，例如對腫瘤紊亂的診斷或預(yù)后，既使用基于DNA的分析又使用基于RNA的分析。為了允許在同一的經(jīng)固定的樣本(如腫瘤樣本)上進(jìn)行基于DNA和RNA的分析，需要一種允許從一個樣本(例如活體組織切片檢查中的組織切片)中平行分離DNA和RNA的方法。這樣的從一個樣本中平行分離DNA和RNA是非常需要的，因?yàn)?，首先，通?？梢垣@得的樣本材料的量很少，不足以用于多個獨(dú)立的純化。其次，樣本材料的組成一般來說是不均質(zhì)的；例如，在健康細(xì)胞的基質(zhì)中只存在非常少的腫瘤細(xì)胞。在這種情況下，由于不可能保證在每一分樣中不同細(xì)胞彼此間的比例都是相同的，因此分割樣本是不可取的。只有從單一的沒有分開的樣本中平行分離DNA和RNA，才能保證要研究的全部分析物以相同的比例存在,并且來自于完全相同組成的樣本。WO 2007/068764中描述的方法，通過同樣地打斷在固定中引入的交聯(lián)，釋放兩種類型的核酸，DNA和RNA。因此該方法只允許分離DNA、或者RNA，或者兩種核酸的混合物；然而，它不允許在分開的部分中平行分離DNA和RNA。為了分離兩種類型的核酸(DNA和RNA)，WO 2007/068764建議，在分離之后，對純化過程同時釋放的兩種類型的核酸中的一種進(jìn)行選擇性的沉淀或選擇性吸收。或者，可以用酶法降解單獨(dú)的不需要的核酸類型。
一種通過選擇性吸收從樣本中平行純化DNA和RNA的方法是已知的，并且是可以實(shí)現(xiàn)的，例如，市場上可以購買的Allprep DNA/RNA試劑盒(凱杰有限公司，希爾登，德國)。在這里，樣本首先用含有離液劑而沒有任何醇的裂解緩沖液進(jìn)行溶解，存在于溶解產(chǎn)物中的DNA與硅基質(zhì)結(jié)合，而另外存在于溶解產(chǎn)物中的RNA依然獨(dú)立于溶液中。然后向剩下的溶解產(chǎn)物中添加乙醇，RNA會進(jìn)一步與硅基質(zhì)結(jié)合。這一方法對非固定的樣本有效。但是，由于這里DNA沒有定量地(quantitatively)與第一娃基質(zhì)結(jié)合,而是大量地存在于殘留的溶解產(chǎn)物中并于RNA —起被純化，因此已發(fā)現(xiàn)這一方法對福爾馬林固定的樣本仍不是最佳適用的。因此,這個方法不允許RNA和DNA的獨(dú)立純化。W02005/075642描述了一種從生物學(xué)樣本(包括FFPE樣本)中同時提取DNA和RNA的方法。用含有離質(zhì)序列高的介質(zhì)、離子去污劑和蛋白水解酶的裂解緩沖液對FFPE樣本進(jìn)行脫蠟和消化。樣本至少消化5小時，優(yōu)選10小時，從而釋放RNA和DNA，加入苯酚-氯仿，相被分離。水相主要包括RNA，有機(jī)相主要包括DNA。使用乙醇沉淀可以從水相中回收RNA。從有機(jī)相中回收DNA。該方法存在特別的缺點(diǎn)，即在將所述核酸從有機(jī)相和水相分別分尚之前，為了能夠?qū)NA從DNA中分離，需要使用苯酚對釋放的核酸進(jìn)行提取。
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在O ^ Shea等人的“使用從福爾馬林固定石蠟包埋的組織中提取的RNA分析T細(xì)胞受體 beta 鏈 CDR3 的大小”(“Analysis of T cell receptor beta chain CDR3 sizeusing RNA extracted from formalin fixed paraffin wax embedded tissue”)(臨床病理學(xué)雜質(zhì)(J Clin Pathol)，1997 ;50:811-814)描述了類似的標(biāo)準(zhǔn)方法。市售的用于從FFPE樣本中分離DNA和RNA的混合物、或DNA、或RNA的試劑盒，也同樣是已知的。FFPE RNA/DNA純化試劑盒(加拿大索羅爾德諾冠生物科技(Norgenjiotek)公司公司)允許在一個洗脫液中分離RNA和DNA的混合物。在這里，為了只獲得DNA或只獲得RNA，可以特別進(jìn)行長時間的蛋白酶K消化和核糖核酸酶的處理，從而分離出DNA，或者可以進(jìn)行短時間的蛋白酶K消化和DNA酶的處理，從而分離出RNA。但是，該試劑盒不允許從一個樣本中同時，而允許單獨(dú)，純化兩種類型的核酸。Agencourt FormaPure試劑盒(美國，馬薩諸塞州,丹弗斯，貝克曼庫爾特基因組股份有限公司)也允許在一個洗脫液中分離RNA和DNA的混合物，或者經(jīng)DNA酶消化后分離RNA，但不是同時而是單獨(dú)分離RNA和DNA。Ambion Recover All FFPE試劑盒(美國，加利福尼亞，福斯特市，應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司)和QuickExtract FFPE RNA抽提試劑盒(美國，威斯康星,麥迪遜，Epicentre生物技術(shù)公司)也提供了一種選擇，通過相應(yīng)的核酸酶消化或者通過適當(dāng)?shù)臒岱跤?，獲得DNA或RNA中的任一種。然而，這些市場上可以買到的試劑盒都不允許從同一的經(jīng)固定的樣本中單獨(dú)純化DNA和RNA。此外,WO 2005/075642描述了一種從同一樣本中(此外，也可以是一個經(jīng)固定的樣本)同時抽提兩種類型核苷酸(RNA和DNA)的方法。該方法包括在樣本溶解和使用芳香醇類將酶鈍化之后，用一種合適的抽提方法分離兩種類型的核酸。然而，在進(jìn)一步的純化和/或分離之前，必須通過加入合適的沉淀劑，將核酸從該方法中獲得的兩相(含有RNA的水相，以及含有DNA的有機(jī)相)中沉淀下來。首先，該方法耗費(fèi)時間，其次，由于沉淀，會有物質(zhì)損失和/或核酸被沉淀劑污染的風(fēng)險(xiǎn)。相應(yīng)地，本發(fā)明的目的是提供一種方法，允許從通過交聯(lián)固定的同一樣本中單獨(dú)純化DNA和RNA，從RNA中分離DNA既不需要有機(jī)溶劑，也不需要用于結(jié)合核酸的固體基質(zhì)。發(fā)明概述本發(fā)明特別基于這樣的發(fā)現(xiàn)使用至少一種蛋白酶活性化合物，將通過交聯(lián)固定的生物樣本的含有蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行部分蛋白質(zhì)酶解，使得選擇性地釋放RNA進(jìn)入到樣本的溶解組分中，而DNA主要存在于所述樣本的不溶解殘留物中。所述樣本的部分消化允許獲得單獨(dú)的組分，所述溶解組分主要包含RNA，不溶解殘留物主要包含DNA。主要包含RNA的溶解組分可以很容易地從主要包含DNA的不溶解殘留物中分離，如使用離心的方法。將溶解組分從不溶解組分中分離后，按照需要分別處理組分，如，RNA可以從不溶解組分中分離，DNA可以從不溶解組分中分離。在從各自的組分中分離核酸之前，將主要含有RNA的溶解組分與主要含DNA的不溶解組分分離，這樣使得可以從同一的交聯(lián)的樣本中有效分離RNA和DNA，并有很好的產(chǎn)量。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，還包括僅從一個組分中分離核酸并放棄另一組分的方法。比如，如果主要目的是分離RNA，在分離后，可以放棄含 有DNA的不溶組分。從下面的描述和隨附的權(quán)利要求中，本發(fā)明的其他目的、特征、優(yōu)點(diǎn)和方面，對于那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員是明顯的。但是，應(yīng)理解，下面的描述、隨附的權(quán)利要求以及特定的實(shí)施方式，盡管示出了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，但是只是為了說明。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，閱讀以下內(nèi)容后，在本發(fā)明披露的精神和范圍內(nèi)作出各種變化和修改是十分容易的。發(fā)明詳述如上述的討論，本發(fā)明的一個目的是提供一種允許從經(jīng)交聯(lián)固定的同一樣本中分離純化DNA和RNA的方法，將DNA從RNA中分離既不需要有機(jī)溶劑，也不需要用于結(jié)合核酸的固體基質(zhì)。本發(fā)明的目的是通過用于從由交聯(lián)固定的同一生物樣本中平行分離和/或純化核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)的方法來實(shí)現(xiàn)的，包括以下步驟a)在水(性)緩沖溶液中部分溶解樣本，利用至少一種蛋白酶活性的化合物同時部分蛋白酶水解樣本的含有蛋白質(zhì)的組分從而獲得溶解組分(組分A)以及不溶解殘留物(沉淀物；組分B),b)將溶解組分從不溶解殘留物中分離，其中，以溶解組分中核苷酸的總量為基準(zhǔn)，溶解組分主要包含RNA，以不溶解殘留物中核苷酸的總量為基準(zhǔn)，不溶解殘留物主要包含DNA，以及，將主要包括RNA的組分從主要包括DNA的組分中分離，既不需要使用有機(jī)溶劑抽提或沉淀一種或兩種核酸，也不需要將一種或兩種核酸與固體基質(zhì)結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明方法的目的，應(yīng)理解，平行分離和/或純化是這樣一種分離和/或純化兩種類型的核酸(RNA和DNA)的分離和/或純化在空間上彼此分離，對組分A和組分B(其中一種主要包含RNA，另一種主要包含D NA)的處理可以同時進(jìn)行或在不同的時間點(diǎn)進(jìn)行。為了本發(fā)明的目的，應(yīng)理解，通過交聯(lián)固定的同一生物樣本是指在步驟a )中經(jīng)部分溶解的全部的樣本。為了本發(fā)明的目的，應(yīng)理解，術(shù)語“部分溶解”和“部分蛋白酶水解”或“部分消化”分別是指樣本或樣本單個組分的部分溶解，以及樣本的含有蛋白質(zhì)的組分的部分降解，下面更詳細(xì)的說明。為了本發(fā)明的目的，如果組分被稱為主要包含一種類型的核酸，則該組分包含基于該組分中核酸總量(也就是兩種核酸的總量)的大于50重量％的這種類型的核酸。根據(jù)一實(shí)施方式，所述組分主要包含一種類型的核酸，包含基于該組分中核酸重量的至少60重量％、優(yōu)選至少70重量％、更優(yōu)選至少80重量％的該類型核酸。本發(fā)明方法允許從同一的經(jīng)固定的樣本在單獨(dú)的組分中平行分離DNA和RNA，并通過靈敏、定性和或定量的方法進(jìn)行后續(xù)分析，即使只獲得少量的樣本例如從用直徑只有數(shù)毫米中空的針進(jìn)行臨床切片檢查的顯微分析部分，同樣適合作為樣本材料。本發(fā)明的方法，與市場上可買到的Al lprep DNA/RNA試劑盒(德國，希爾登，凱杰有限公司)不同，在核酸實(shí)際純化之前，對包含DNA的組分和包含RNA的組分進(jìn)行分離。根據(jù)本發(fā)明方法，從經(jīng)固定的生物樣本中產(chǎn)生兩種組分，主要包含RNA的可溶性組分和主要包含DNA的不溶性組分。在進(jìn)一步的步驟中，利用這些組分分別進(jìn)行核酸的抽提和/或純化。根據(jù)本發(fā)明，部分消化和接下來將RNA與DNA分離為主要包含RNA的可溶性組分和主要包含DNA的不溶性組分使 得本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)的方法(用于將DNA從RNA中分離的基于苯酚/氯仿的抽提的方法)不同。在單獨(dú)的苯酚/氯仿為基礎(chǔ)的方法中，DNA和RNA都被釋放在裂解產(chǎn)物中，并相應(yīng)地都存在于溶解組分中。苯酚-氯仿的抽提和相分離之后，RNA溶解于水相中，DNA以溶解的形式存在于有機(jī)相中。這樣，現(xiàn)有技術(shù)的分離原理從根本上不同于本發(fā)明的方法，本發(fā)明方法不需要用于將RNA從DNA中分離的苯酚/氯仿的抽提，而是依賴交聯(lián)樣本的部分消化，從而使DNA主要存在于非溶解組分中，而RNA釋放到溶解組分中。在第一步中，優(yōu)選對FFPE樣本進(jìn)行蛋白酶處理。令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在這第一蛋白酶處理中，通過優(yōu)化調(diào)節(jié)使用蛋白酶的蛋白的蛋白質(zhì)水解(酶促“消化”)的條件，有可能選擇性地從樣本中只釋放RNA，而沒有DNA。樣本經(jīng)本發(fā)明的不完全“消化”之后，使用合適的分離方法，如離心，有可能將含有DNA的仍為不溶的組分從含有RNA的上清中分離。在這里，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員任一已知的適合將液體和固體組分分離的方法將兩個組分分離為溶解組分(A)和不溶組分(B),例如,過濾,沉淀,傾析(decantation)、離心等。在下文中，該步驟中獲得的不溶殘留物也被稱為沉淀物，為了本發(fā)明的目的，該術(shù)語明確地不限制于通過離心從液體組分中分離的不溶殘留物，也包括通過其他方法將分離的不溶性殘留物，例如，過濾后存在于過濾器上的固體物質(zhì)。沉淀不溶組分是有利的，因?yàn)樗试S兩組分的簡單有效分離。為了分離RNA，可以使用本領(lǐng)域目前的已知的常規(guī)方法處理含有RNA的上清液，例如，使用專利申請WO 2007/068764描述的方法，包括在含有親核試劑的溶液中進(jìn)行熱孵育，從而除去剩余的交聯(lián)，然后RNA就能被分離，例如，通過使用如RNeasy FFPE試劑盒(德國，希爾登，凱杰有限公司)，結(jié)合到二氧化硅基質(zhì)含有DNA和不完全消化樣本的其他不溶成分的不溶組分用于分離DNA。在這里，由于沉淀物在本質(zhì)上仍然具有經(jīng)固定樣本的性能，因此可能使用將DNA從經(jīng)固定的樣本中分離的任何合適的或者本領(lǐng)域常規(guī)的方法。特別是，之前的不完全的蛋白酶消化還沒有從樣本中去除大量的DNAJP /或還沒有去除大量的DNA交聯(lián)。為了這個目的，有利地實(shí)施另外的或附加的蛋白酶消化，從而將樣本完全裂解，然后在含有親核試劑的溶液中進(jìn)行熱孵育，例如在W02007/068764中描述的。以這種方法釋放的DNA可以借助于任何合適的方法被進(jìn)一步純化，例如通過使用硅基質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，例如使用QIAamp FFPE試劑盒(德國，希爾登，凱杰有限公司)。用這種方法，在一個步驟中，兩種類型的核苷酸從單個樣本中被預(yù)分離，然后彼此分離，可以在進(jìn) 一步的分析方法中使用。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“核酸”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有核酸，例如，自然的或合成的核酸，和人工導(dǎo)入樣本中的核酸，單鏈和雙鏈的核酸，直鏈、分支或環(huán)狀的核酸，RNA,特別是mRNA、siRNA、miRNA, snRNA、tRNA、hnRNA或核酶，DNA特別是基因組或質(zhì)粒DNA或細(xì)胞器DNA，以及感染源的核酸。合適的生物學(xué)樣本是適合于固定的所有生物學(xué)樣本，例如，包括細(xì)胞的體液如血液、精液、腦脊液、唾液、痰或尿液、白血球組分、血沉棕黃層、糞便、表面活組織(surfacebiopsies)、抽吸物(aspirates)、皮膚片段、完整生物體、后生動物(優(yōu)選昆蟲和哺乳動物，特別是人)器官和組織，例如以尸檢、活檢、細(xì)針抽吸或組織切片的形式、分離的細(xì)胞，例如，以貼壁或懸浮的細(xì)胞培養(yǎng)物的形式、植物、植物部分、植物組織或植物細(xì)胞、細(xì)菌、病毒、酵母和真菌。根據(jù)本發(fā)明方法，在第一步驟a)中，將經(jīng)固定的樣本與優(yōu)選的允許蛋白酶水解活性化合物發(fā)揮活性的水溶液接觸，以及也與一種或多種蛋白水解活性化合物接觸。為了本發(fā)明的目的，蛋白水解活性化合物是所有的切割蛋白質(zhì)的化合物，優(yōu)選蛋白酶水解活性酶，如蛋白酶和熱穩(wěn)定蛋白酶，特別優(yōu)選蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶和蛋白內(nèi)切酶Lys-c，特別是蛋白酶K以及適合用于切割蛋白質(zhì)的非酶物質(zhì)，例如溴化氰、或這些物質(zhì)的混合物。蛋白水解活性化合物在水溶液中的濃度通常依賴于蛋白水解活性化合物的性質(zhì)和生物樣本的性質(zhì)和數(shù)量，本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就可以確定。水溶液中蛋白酶的濃度優(yōu)選范圍為O. 001-5% (以重量計(jì))，特別優(yōu)選O. 01-2. 5% (以重量計(jì))，特別優(yōu)選O. 05-0. 2% (以重量計(jì))，在每種情況中，都是以水溶液的總重量為基準(zhǔn)的。在這里，對于某一樣本使用的蛋白水解活性化合物的濃度的量依賴于蛋白水解活性化合物的性質(zhì)和所選擇的反應(yīng)條件，如pH、輔助因子、孵育溫度和孵育時間，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。合適的蛋白水解活性化合物的量和濃度可以使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)以簡單的方法來決定。根據(jù)本發(fā)明的方法，還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在任一種情形中，蛋白水解活性化合物的量或濃度并非嚴(yán)格地特別調(diào)控，它可以在一定的寬度內(nèi)改變，而不負(fù)面地影響核酸的產(chǎn)量或其完整性(實(shí)施例2)。水溶液優(yōu)選包含另外的促進(jìn)生物組織降解和/或細(xì)胞裂解的物質(zhì)，如離液序列高的試劑和/或，優(yōu)選表面活性劑。適合用于本發(fā)明方法的表面活性劑是所有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并適合用于裂解細(xì)胞的表面活性劑；這里優(yōu)選為陰離子或非離子的表面活性劑。優(yōu)選的表面活性劑是選自下組的化合物十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉、3-(3-膽酰胺丙基)-二甲氨基-I-丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、聚乙二醇苯醚，如商品名稱為Triton X-100、吐溫Tween或ΝΡ-40的可用的表面活性劑或它們的混合物，優(yōu)選的表面活性劑為SDS、ΝΡ-40和TritonX-100 (聚乙二醇(1，1，3，3-四甲基丁基)苯醚，具有9-10的乙氧基化程度)。用于支持存在于生物樣本中的細(xì)胞裂解所使用的表面活性劑的量依賴于生物樣本的性質(zhì)和量，本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用簡單的常規(guī)實(shí)驗(yàn)就可以確定。
進(jìn)一步地，水溶液優(yōu)選為緩沖溶液，用存在于溶液中的至少一種緩沖物質(zhì)穩(wěn)定pH的范圍在6-9，優(yōu)選6. 5-8. 5，特別優(yōu)選6. 8-7. 5。相應(yīng)地，水緩沖溶液優(yōu)選包含至少一種緩沖物質(zhì)，優(yōu)選選自下組Tris、Hepes、Pipes、Mops、堿金屬醋酸鹽/醋酸等,和/或優(yōu)選至少一種表面活性劑，優(yōu)選地，選自下組十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉、3-(3-膽酰胺丙基)_ 二甲氨基-I-丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、聚乙二醇苯醚，或它們的混合物，特別優(yōu)選十二烷基硫酸鈉、乙氧基化程度為40的聚乙二醇壬基苯醚(商品名為烷氧基聚乙烯氫氧基乙醇型(Tergitol type)NP-40)、和/或聚乙二醇(1，1，3，3-四甲基丁基)苯醚)，乙氧基化程度為9-10。此外水溶液可以包括支持裂解、保護(hù)核酸免受分解成分作用和/或穩(wěn)定水溶液的其他組分，如絡(luò)合劑(complexing agents)、還原劑、或其他緩沖物質(zhì),本領(lǐng)域的技術(shù)人員對用于裂解緩沖液的可能添加劑的性質(zhì)和的量是熟悉的，或能夠通過簡單的常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。在一優(yōu)選例中，水緩沖溶液進(jìn)一步包括至少一種選自下組的物質(zhì)-絡(luò)合劑，優(yōu)選乙二胺-N，N，N’，N’-四乙酸(EDTA)、乙二醇雙(2_氨乙基) -N, N，N’，N’ -四乙酸(EGTA)檸檬酸鈉或其混合物，-離液序列高的試劑，優(yōu)選地，選自下組鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、高氯酸鹽、NaI、KI和尿素，優(yōu)選濃度為O. I到10M，-還原劑，優(yōu)選地選自下組二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、硫代硫酸鈉、β -巰基乙醇或其混合物，以及-無機(jī)鹽,優(yōu)選齒代堿金屬，如NaCl、KC1或LiCl、齒代堿土金屬，如CaCl2或1%012、銨鹽，如氯化銨或硫酸銨、硫酸鋰或其混合物。根據(jù)一個實(shí)施方式，水緩沖溶液包括去污劑，優(yōu)選非離子去污劑如SDS，以及優(yōu)選緩沖試劑，優(yōu)選TRIS。水緩沖溶液還可以包括螯合劑，如EDTA。根據(jù)本發(fā)明方法，在步驟a)中，通過交聯(lián)被固定的生物樣本與含有至少一種蛋白水解活性化合物的水溶液接觸，在適當(dāng)?shù)臏囟认路跤?。在這里，所述溫度通常依賴于使用的蛋白水解活性化合物的性質(zhì)。在酶的例子中，所選擇的溫度必須允許酶發(fā)揮活性。一般而言，過低的溫度會降低酶的活性，以至于失活，而過高的溫度可能通過變性作用使酶失活。所考慮的酶的承受溫度范圍或適宜的反應(yīng)溫度根據(jù)酶的不同而發(fā)生變化，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的或通過簡單的常規(guī)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼_定的。例如，當(dāng)使用蛋白酶K時，可以在高達(dá)約95° C的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，優(yōu)選18° C到80° C，特別優(yōu)選50到65° C。正如已經(jīng)描述的那樣，驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過使用蛋白水解活性化合物，優(yōu)選蛋白酶，調(diào)節(jié)優(yōu)化在經(jīng)固定的樣本中的蛋白的蛋白質(zhì)水解“消化”條件，從而有可能從樣本中選擇性地僅去除RNA，而不是DNA。在樣本經(jīng)本發(fā)明的不完全(部分)消化之后，含有DNA的仍然不溶解組分可能與含有RNA的溶解的上清分離。對于一種給定的蛋白質(zhì)水解活性化合物，RNA與DNA分離的質(zhì)量依賴于它們的濃度和孵育溫度，并且特別依賴于孵育時間。如果允許蛋白質(zhì)水解活性化合物只作用很短的時間，不僅DNA而且RNA將從樣本中不充分地分離，因此在溶解組分中，總共只有低產(chǎn)量的核酸被獲得。與之相反，如果允許蛋白質(zhì)水解活性化合物作用很長的時間，結(jié)果將(幾乎)會是RNA的完整溶解，但是也有更多的DNA從沉淀物中分離。但是，通過適當(dāng)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水解活性化合物的反應(yīng)時間，有可能實(shí)現(xiàn)樣本的部分(不完全)裂解，伴隨溶解組分中的RNA與不溶解組分中的DNA的大量分離，這就是實(shí)際純化之前兩種類型核酸的“預(yù)分離”。在這里，理想的反應(yīng)時間首先依賴于蛋白質(zhì)水解活性化合物，它在水溶液中的濃度和孵育溫度。其次，生物樣本的量和厚度以及其他樣本特異性參數(shù)，例如固定的類型和持續(xù)時間，對蛋白質(zhì)水解活性化合物的理想的反應(yīng)時間有影響。優(yōu)選使用福爾馬林固定的樣本，特別是樣本被包埋入石蠟之后。對于相對大的組織塊，相對于使用的較小的樣本，由于樣本量大且厚，含有蛋白質(zhì)水解活性化合物的溶液體積較大，蛋白質(zhì)水解活性化合物的 濃度較高，并且反應(yīng)時間較長。使用合適的切割儀器，例如超薄切片機(jī)，從經(jīng)固定的樣本制備組織切片，使用光學(xué)顯微鏡檢測的厚度通常是5到20 μ mo此外，也可以使用其他方法將石蠟包埋的樣本分成較小的樣本片段，例如通過中空的針穿孔或通過激光捕獲方法。較小的組織片段需要較少量的蛋白質(zhì)水解活性化合物和較短的反應(yīng)時間。這里特別具有決定性的是切片的厚度，因?yàn)閷τ诮M織與蛋白質(zhì)水解活性化合物完整的接觸來講，這是限制性因素。因此優(yōu)選使用具有厚度為5 μ m到50 μ m的組織切片或更小的組織片段，任選地，通過對較大的樣本進(jìn)行分割或均質(zhì)化獲得這些組織片段。固定的時間，也就是固定試劑作用于生物樣本的時間，影響樣本中生物分子共價(jià)交聯(lián)的程度，較長的固定時間增加交聯(lián)的程度。在只經(jīng)過簡單固定的樣本中，只有低程度的生物分子交聯(lián)，這就允許各生物分子更簡單更快的分解。與之相反，經(jīng)長時間固定的樣本具有高的交聯(lián)程度，這尤其可能推遲較大的生物分子的溶解。相應(yīng)地，對于強(qiáng)固定(過度固定)的樣本，蛋白質(zhì)水解活性化合物作用較長的反應(yīng)時間是有利的。在這里，應(yīng)理解，術(shù)語“簡單固定”和“長時間固定”是相對的，因?yàn)槔硐氲墓潭〞r間依賴于組織片的大小。福爾馬林在組織中的擴(kuò)散速度最初為大約lmm/h，隨著組織深入，速度就降低下來。這樣，對于厚度大約5_的組織片，福爾馬林完全滲透樣本(固定時間)大約需要8h。在實(shí)踐中，固定時間通常約12-24h ;非常小的樣本需要短得多的固定時間，固定12h將會過度固定。這樣，理想的固定時間依賴于樣本特異性的參數(shù)如固定和固定時間、生物樣本的性質(zhì)、量和厚度，對于每一個樣本個體可以進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。然而，令人驚異地是，有可能調(diào)整條件，如許多可能的樣本參數(shù)，也就是許多不同的個體樣本，允許DNA和RNA分離，進(jìn)入不溶和溶解組分中。在這里，反應(yīng)時間可能為30秒到若干天，優(yōu)選I分鐘到5小時，特別優(yōu)選5-90分鐘，更優(yōu)選10-30分鐘。對于厚度為10到20 μ m的FFPE組織切片，當(dāng)使用10到40 μ I活性為>600mAU/ml的蛋白酶K溶液，孵育溫度為56° C，反應(yīng)時間約15到90min時，對為本發(fā)明目的樣本部分溶解來說，可以獲得非常好的結(jié)果，也就是說，RNA已經(jīng)從不溶組分(幾乎)完全溶解，并且進(jìn)入溶解組分，而DNA仍然(幾乎)完全在不溶組分中(實(shí)施例2和實(shí)施例3)。根據(jù)一個實(shí)施方式，步驟a)包括樣本在含有去污劑(優(yōu)選非離子型去污劑)的水緩沖溶液中部分溶解，同時伴隨使用蛋白質(zhì)水解活性酶(優(yōu)選蛋白酶如蛋白酶K)對樣本含有蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行部分水解，反應(yīng)進(jìn)行溫度為18°C到80°C，優(yōu)選50到65°C，反應(yīng)時間為10分鐘到5小時，優(yōu)選10-90分鐘，更優(yōu)選10-30分鐘。該實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)是快速有效地將RNA釋放進(jìn)入溶解組分。在這里，生物樣本的固定可能受到本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何固定劑的影響，特別是酸類、醇類、酮類或其他有機(jī)物，如特別是戊二醛或甲醛，其中，特別優(yōu)選用甲醛固定生物樣本。根據(jù)本發(fā)明方法的一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式，使用甲醛固定，石蠟包埋的生物樣本(FFPE 樣本)。如果使用包埋于石蠟的生物樣本，優(yōu)選首先將石蠟從樣本中移除，至少部分(優(yōu)選完全)移除。脫蠟有助于選擇性地去除用于包埋生物樣本的石蠟，從而使得在水介質(zhì)中，樣本能有效裂解。一般來說，石蠟可能在核酸的溶解和分組中以及在進(jìn)一步核酸純化和分析中有干擾。優(yōu)選預(yù)先進(jìn)行的脫蠟，，可能對本發(fā)明方法(隨后進(jìn)行蛋白酶處理)獲得的沉淀的質(zhì)量特別是堅(jiān)硬度有顯著影響，因此對核酸的分離和獲得的產(chǎn)量有影響。原則上，將石蠟從生物樣本中移除可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的任何用于生物樣本脫蠟的方法。優(yōu)選地，脫蠟是這樣實(shí)現(xiàn)的首先將樣本與疏水性有機(jī)溶劑相接觸。在這里，為了保證石蠟從樣本中有效溶解，用攪拌的方法如通過在實(shí)驗(yàn)室混合器上進(jìn)行震動、使用電磁攪拌器等，對生物樣本和有機(jī)溶劑進(jìn)行混合，是有利的。有利地，隨后將樣本進(jìn)行離心，從而將溶解于有機(jī)溶劑中的石蠟與沉淀物(也就是生物樣本)分離。如果需要，溶解石蠟從生物樣本中分離的步驟可以重復(fù)一次、兩次、三次或以至十次。優(yōu)選地，通過在疏水性有機(jī)溶劑中(優(yōu)選在芳香烴中，特別是在二甲苯中)孵育，然后將樣本在乙醇中脫水(如WO 2007/068764申請中所描述的那樣)，實(shí)現(xiàn)脫蠟。其他的有機(jī)溶劑，例如烷烴，優(yōu)選在室 溫下是液態(tài)的烷烴，在其通式CnH2n+2中，6〈n〈17，或它們的混合物，特別優(yōu)選庚烷，任選地，加入C1-C5的醇，即甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、η- 丁醇、異丁醇、η-戊醇，優(yōu)選使用甲醇進(jìn)行脫蠟。如果使用直鏈的，即無支鏈的烷烴，η優(yōu)選為大于6并且小于17，這是由于一些鏈長為6或更少碳原子的烷烴，其中一些不得不歸類為有毒性的、在室溫下為氣態(tài)的和/或太容易揮發(fā)的，并且鏈長為17或更多碳原子的烷烴在室溫下是固態(tài)的。此外，有可能使用烷烴的混合物，任選地，和其他化合物如烯烴、芳香族化合物等，只要在室溫下是液態(tài)并溶解石蠟如礦物油。通過在鏈長為大于6并小于17個碳原子的烷烴(特別優(yōu)選庚烷)中孵育進(jìn)行脫蠟，發(fā)現(xiàn)特別有利于后續(xù)的本發(fā)明方法的溶解和不溶組分的分離。向疏水性有機(jī)溶劑中添加C1-C5-醇類，優(yōu)選甲醇，添加量為1-25體積％，優(yōu)選5-10體積％，可以促進(jìn)不溶殘留物的沉淀，從而使得溶解和不溶組分的分離更加容易和有效。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法包括在步驟a)的部分溶解之前，用于選擇性去除石蠟的步驟i)，優(yōu)選通過將樣本與疏水性有機(jī)溶劑接觸，特別優(yōu)選使用非極性的鏈長大于6并小于17個碳原子的脂肪烴或芳香烴；特別是選自下組的烴二甲苯、庚烷和礦物油，任選地，加入C1-C5-的醇類，優(yōu)選甲醇，量為1-25體積％，優(yōu)選5-10體積％。根據(jù)一實(shí)施方式，通過用烷烴(優(yōu)選庚烷)和醇(優(yōu)選甲醇)孵育完成脫蠟。除了使用合適的有機(jī)溶劑進(jìn)行石蠟溶解，其他用于脫蠟的方法(如Banerjee等人在生物技術(shù)“Bi0techniqueS”18(1995)第768-773頁中描述的融化石蠟)也是合適的。將石蠟移除之后，優(yōu)選對生物樣本進(jìn)行復(fù)水，優(yōu)選地，復(fù)水受到采用醇類濃度逐步降低的含水的醇類溶液(降低的醇系列)的梯度洗滌的影響，優(yōu)選采用C1-C5-的醇類，特別優(yōu)選甲醇、乙醇和異丙醇。如果使用的脫蠟試劑是二甲苯，樣本通常在進(jìn)行進(jìn)一步的處理之前以這樣的方式進(jìn)行復(fù)水，在相關(guān)文獻(xiàn)中一直都存在關(guān)于為后續(xù)核酸分離而復(fù)水的必要性的爭論。如果使用的脫蠟試劑是直鏈的脂肪烴，就不需要對樣本進(jìn)行復(fù)水。然而，也有可能使用單一的合適的試劑，如使用市場上可以購買的產(chǎn)品EZ- DEWAX (美國，加利福尼亞，BIoGEnex公司)完成脫蠟和復(fù)水。優(yōu)選地，樣本在脫蠟和復(fù)水之后，首先進(jìn)行干燥，例如在干燥箱中暴露于空氣中或在干燥箱中孵育。進(jìn)一步地，在部分溶解前，經(jīng)任選脫蠟和復(fù)水的生物樣本可以優(yōu)選地進(jìn)行均質(zhì)化，特別是在相對大的組織樣本的例子中，這是有利的。相反地，厚度達(dá)到20μπι的組織切片通常不需要樣本的均質(zhì)化。這種均質(zhì)化可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的任何用于粉碎生物樣本的設(shè)備來完成，特別是在機(jī)械粉碎設(shè)備(例如，研磨機(jī)、轉(zhuǎn)子-定子勻漿器、Ultra-TuiTax 勻漿器、或細(xì)導(dǎo)管)的幫助下或通過超聲勻漿器器進(jìn)行高壓細(xì)胞消化。因此，在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法在步驟(i)去除石蠟之后，并且在步驟Ca)樣本在水緩沖溶液中進(jìn)行部分溶解之前，優(yōu)選包括下述步驟中的至少一個(ii)樣本復(fù)水，優(yōu)選通過使用水含量依次上升的、含水的C1-C5-醇溶液對樣本進(jìn)行重復(fù)洗滌，(iii)樣本干燥和/或(iv)樣本均質(zhì)化。脫蠟和對脫蠟樣本處理的各個方法步驟也是在現(xiàn)有技術(shù)中已知的，不需要在這里·進(jìn)一步描述。根據(jù)一實(shí)施方式，在脫蠟之后以沉淀物的形式獲得通過交聯(lián)固定的樣本。優(yōu)選地，將水緩沖溶液加入所述沉淀物中，以完成步驟a)的部分溶解。根據(jù)另一實(shí)施方式，含有脫蠟化學(xué)物(分別為脫蠟溶液)的經(jīng)脫蠟的樣本，與用于步驟a)的水緩沖溶液混合，從而形成一種水相，在步驟a)中該水相經(jīng)受利用至少使用一種蛋白酶水解活性化合物對樣本的含有蛋白質(zhì)的組分進(jìn)行部分蛋白酶水解，從而選擇性地將含有的RNA釋放進(jìn)入溶解組分中，而含有的DNA主要存在于不溶組分中。在這里，蛋白酶水解活性化合物，優(yōu)選蛋白水解酶，可以被加入水相中，而脫蠟所使用的溶液仍然在由于加入水緩沖溶液而形成的水相上面。如果實(shí)施分離步驟b),在這個替代例中(in this alternative),例如通過對部分消化的交聯(lián)樣本進(jìn)行離心(參見如上文和下文)，主要含有DNA的不溶組分將在水相中形成沉淀物。為了從不溶組分中分離溶解組分，例如，通過使用移液管穿過脫蠟溶液收集水相，而將不溶的主要含有DNA的沉淀物留在后面?；蛘?，可以從水相中分離脫蠟溶液，該水相是在水緩沖溶液加入之后，蛋白水解活性化合物加入以及將不溶組分從溶解組分中分離之前獲得的。在本發(fā)明方法的步驟b)中，存在于原材料中的不同類型的核酸，即RNA和DNA，被分離,進(jìn)入主要包含RNA的溶解組分(A)和主要包含DNA的不溶組分(B)。也有可能將完整的包括溶解和不溶組分的樣本分為至少兩個組分，然后其中各種不同的生物分子被分離或被純化，或者然后其中各種不同的生物分子被檢測或被分析；然而，根據(jù)本發(fā)明方法，在步驟a)之后，樣本優(yōu)選被分離為至少一種溶解組分(A)以及至少一種不溶組分(B)。分離兩種組分的優(yōu)點(diǎn)在于在每一個情況下，基本上可以從這兩個組分中獨(dú)立地分離一種類型的核酸，不需要分離原始的生物樣本(將會降低各自的產(chǎn)量或?qū)е聵颖靖鞣N細(xì)胞類型不均一的分布)。用這種方法獲得的組分隨后可以分別被用于核酸的純化。只從一種組分中分離核酸，放棄其他核酸(參見如實(shí)施例6和7)也同樣在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在為分離核酸對樣本的進(jìn)一步處理中，優(yōu)選在蛋白酶活性化合物存在的條件下對樣本進(jìn)行加熱到50 - 100°C，優(yōu)選 55-95°C，特別優(yōu)選 60-90°C，特別 65-85°C。優(yōu)選地，通過在蛋白水解活性化合物反應(yīng)時間之后對混合物進(jìn)行冷卻(特別是蛋白水解活性化合物在高溫下(即高于室溫的溫度)有活性)，有助于將不溶組分從水溶液中分離。優(yōu)選地，通過將樣本在低于蛋白酶消化的溫度條件下(優(yōu)選在室溫，特別是在4° C或更低溫度如_20°C或_80°C，在這些溫度條件下迅速冷卻以避免全部水溶液的凍結(jié))進(jìn)行孵育，實(shí)現(xiàn)冷卻。因此，冷卻優(yōu)選在15°C或更低、10°C或更低、4°C或更低、或在更低的溫度如-20°C或-80°C的溫度下進(jìn)行?？梢栽诜蛛x的步驟之前和/或進(jìn)行中進(jìn)行冷卻。冷卻的優(yōu)點(diǎn)是不溶組分(特別是沉淀物)的分離是更有效的。這是特別有利的，因?yàn)镕FPE樣本通常包含不溶成分(特別是與蛋白質(zhì)交聯(lián)的DNA)，而不是大量的固體成分。所述的不溶組分通常難以沉淀。冷卻有助于不溶組分的沉淀，從而使得分離更有效。這樣，由于各個組分分離的改良，冷卻就造成主要含有DNA的不溶組分包含更多的DNA，以及相應(yīng)地，含有RNA的溶解組分包含了更少的DNA污染物。當(dāng)處理包含少量的細(xì)胞材料的交聯(lián)樣本時，這是特別有利的。根據(jù)一個實(shí)施方式，分離導(dǎo)致以緊湊的沉淀物形式獲得主要包含DNA的不溶組分。這就允許容易地將主要包含DNA的沉淀物從主要包含RNA的溶解組分中分離。在第三步驟中，用這種方法獲得的溶解組分(A)以及不溶組分(B)可以彼此分別使用，從而純化存在的生物分子，優(yōu)選核酸。在這里，溶解組分(A)優(yōu)選被用于分離RNA，不溶組分(B)優(yōu)選被用于分離DNA。僅從一種組分中分離核酸,放棄另一種組分(參見,如實(shí)施 例6和7)，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在這里，溶解組分(A)不用進(jìn)一步裂解，就可以直接用在用于核酸分離的方法中。但是，進(jìn)一步的裂解，例如使用蛋白水解活性化合物，優(yōu)選蛋白酶，可以任選地在水溶液中應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的所有用于分離核酸特別是RNA的工藝和方法都是合適的方法。用于從經(jīng)固定的樣本材料中分離核酸的方法(如專利申請WO 2007/068764、WO2008/021419、WO 2005/012523或WO 2005/054466中所描述的)或其他的借助于市售試劑盒RNeasy FFPE和miRNeasy FFPE (都來自凱杰有限公司)實(shí)施的方法是合適的。在后一個情形中，利用離液劑介導(dǎo)的與硅膜的結(jié)合對核酸進(jìn)行純化之前，對組分A進(jìn)行至少一次加熱的步驟。優(yōu)選地，借助于在專利申請WO 2007/068764中所描述的方法，可以實(shí)現(xiàn)對RNA的進(jìn)一步抽提和純化。如果使用在專利申請WO 2007/068764中所描述的方法來從溶解組分中分離核酸，則樣本在親核試劑存在的條件下進(jìn)行加熱。這可以在至少含有一種蛋白水解活性化合物以及目前所溶解的核酸的水溶液中實(shí)現(xiàn)，其中，專利申請W02007/068764的方法所需要的親核試劑可以在本發(fā)明方法的步驟a)(蛋白水解活性化合物的作用)之后加入到水溶液中，或者甚至在加入到步驟a)的樣本之前，就存在于水溶液中。組分的分離可以在專利申請WO 2007/068764中所描述的樣本加熱之后進(jìn)行，或者，優(yōu)選地，在進(jìn)一步加熱之前，直接在蛋白水解活性化合物的作用之后進(jìn)行。合適的親核試劑是能夠?qū)㈦娮愚D(zhuǎn)移到路易斯酸空軌道的所有路易斯堿。在這些路易斯堿中，特別優(yōu)選的試劑具有至少一個官能團(tuán)，該官能團(tuán)載有負(fù)電荷的，是負(fù)極性的、或至少具有一個自由電子對。包含具有負(fù)電荷的官能團(tuán)的化合物是，例如堿金屬或堿土金屬醇鹽，堿金屬或堿土金屬氫氧化物、堿金屬或堿土金屬鹵化物、堿金屬或堿土金屬氰化物等等，不限于此。特別地，具有至少一個負(fù)極性的官能團(tuán)的化合物是那些試劑該試劑至少具有一個官能團(tuán)，所述官能團(tuán)包括兩個彼此共價(jià)相連的原子，并且根據(jù)阿爾弗雷德和羅周(Alfred-Rochow)兩原子的電負(fù)性差至少為O. 25,優(yōu)選至少為O. 5,更優(yōu)選為至少為I. O。但是，根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選的親核試劑是具有至少一個官能團(tuán)的試劑，該官能團(tuán)有一個或兩個(特別優(yōu)選有一個)自由電子對，這些化合物中最優(yōu)選的是那些具有至少一個結(jié)構(gòu)式I所示的伯胺、仲胺、叔胺基團(tuán)的化合物。
權(quán)利要求
1.從通過交聯(lián)被固定的同一生物樣本中平行分離和/或純化核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)的方法，包括以下步驟 a)在水緩沖溶液中部分溶解所述樣本，并使用至少一種蛋白水解活性化合物,對樣本中含有蛋白質(zhì)的成分同時進(jìn)行部分蛋白質(zhì)水解，從而獲得溶解組分(組分A)和不溶解殘留物(沉淀物；組分B)， b)將所述溶解組分與所述不溶解殘留物分離， 其中，以所述溶解組分中核酸的總量為基準(zhǔn)，所述溶解組分主要包含RNA，而以所述不溶解殘留物中核酸的總量為基準(zhǔn)，所述不溶解殘留物主要包含DNA，并且主要包含RNA的組分與主要包含DNA組分的分離，既不需要使用有機(jī)溶劑提取或沉淀一種或兩種類型的核酸，也不需要將一種或兩種類型的核酸選擇性地結(jié)合于固體基質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述水緩沖溶液包括至少一種緩沖物質(zhì)，優(yōu)選地，選自下組Tris、Hepes、Pipes、Mops以及堿金屬醋酸鹽/醋酸和/或優(yōu)選地，至少一種表面活性劑，優(yōu)選地，選自下組十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉、3-(3-膽酰胺丙基)_ 二甲氨基-I-丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、聚乙二醇苯醚或其混合物，特別優(yōu)選十二烷基硫酸鈉、乙氧基化程度為40的聚乙二醇壬基苯醚和/或乙氧基化程度為9-10的聚乙二醇(I, 1,3, 3-四甲基丁基)苯醚。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的水緩沖溶液還包括至少一種選自下組的物質(zhì) -絡(luò)合物形成體，優(yōu)選乙二胺-N，N, N’，N’ -四乙酸(EDTA)、乙二醇雙(2-氨乙基)-N，N，N’ N’ -四乙酸(EGTA)檸檬酸鈉或其混合物； -離液序列高的試劑，優(yōu)選地，選自下組鹽酸胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、高氯酸鹽、NaI、KI和尿素，優(yōu)選濃度為O. I到IOM ； -還原劑，優(yōu)選地，選自下組二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、硫代硫酸鈉、β -巰基乙醇或其混合物；以及 -無機(jī)鹽，優(yōu)選堿金屬鹵化物，特別優(yōu)選NaCl、KCl或LiCl、堿土金屬鹵化物，特別優(yōu)選CaCl2或MgCl2、銨鹽，特別優(yōu)選氯化銨或硫酸銨、硫酸鋰或其組合，此外，優(yōu)選pH范圍為6-9，優(yōu)選6. 5-8. 5，特別優(yōu)選6. 8-7. 5。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的蛋白水解活性化合物選自下組蛋白酶或非酶的蛋白水解活性化合物，優(yōu)選蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶、蛋白內(nèi)切酶Lys-C和溴化氰，或其混合物，特別優(yōu)選蛋白酶K，并且所述蛋白水解活性化合物在水溶液中的總濃度優(yōu)選范圍為O. 001-5重量％，特別優(yōu)選O.01-2. 5重量％，特別地，為O. 05-0. 2重量％，以所述水溶液的總重量計(jì)。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，通過在所述水緩沖溶液中孵育所述樣本，所述樣本在所述水緩沖溶液中發(fā)生部分溶解，優(yōu)選溫度為18-80°C，特別為50-65°C，以及優(yōu)選時間為30秒-5天，特別優(yōu)選I分鐘-5小時，更優(yōu)選5-90分鐘，特別為10-30分鐘。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的通過交聯(lián)被固定的生物樣本是石蠟包埋的樣本，優(yōu)選經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的樣本(FFPE樣本)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括，在步驟(a)的部分溶解之前，用于選擇性去除石蠟的步驟(i )，優(yōu)選地，通過將樣本與疏水性有機(jī)溶劑接觸，特別優(yōu)選使用鏈長大于6并小于17個碳原子的非極性脂肪烴或芳香烴或其混合物；任選地添加C1-C5的醇類；特別是選自下組的烴或烴的混合物二甲苯、庚烷和礦物油，任選地添加1-25體積％的甲醇。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括根據(jù)步驟(i)去除石蠟之后，且在步驟(a)的在所述水緩沖溶液中樣本的部分溶解之前，至少以下一個步驟 ( )樣本復(fù)水，優(yōu)選使用水含量逐步上升的含水的C1-C5醇溶液重復(fù)洗滌樣本； (iii)樣本干燥；和/或 (iv)樣本均質(zhì)化。
9.如權(quán)利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，為了隨后從獲得的不溶解殘留物中釋放DNA，對所述不溶解殘留物進(jìn)行裂解，并同時進(jìn)行酶促蛋白酶消化。
10.如權(quán)利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，還包括步驟繼權(quán)利要求I的步驟(b)之后，分別從溶解組分A純化獲得RNA和/或從沉淀物B純化獲得DNA，優(yōu)選通過沉淀、與結(jié)合核酸的物質(zhì)結(jié)合、電泳和/或色譜法進(jìn)行。
11.如權(quán)利要求1-10任一所述的方法，其特征在于，分離之后，將所述的主要含DNA的不溶解組分丟棄。
12.如權(quán)利要求1-11中的一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在將RNA從所述組分中分離之前，對主要含RNA的溶解組分進(jìn)行DNA酶消化。
13.如權(quán)利要求1-12任一所述的方法，其特征在于，所述的方法還包括用于檢測所分離的和/或所純化的核酸的步驟，優(yōu)選地，選自下組擴(kuò)增技術(shù)，特別是PCR、qPCR、RT-PCR、qRT-PCR以及整個基因組DNA的擴(kuò)增(全基因組擴(kuò)增)、凝膠電泳、印跡技術(shù)，特別是Southern印跡和Northern印跡、微陣列分析、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP分析)、SAGE (基因表達(dá)系列分析)、測序，包括下一代測序以及RNA測序、單核苷酸多態(tài)性分析(SNP分析)、突變分析、表觀遺傳分析，特別是甲基化模式分析、或其組合。
14.用于實(shí)施權(quán)利要求1-13任一所述方法的試劑盒，其特征在于，至少包括(I)一種蛋白水解活性化合物，優(yōu)選如權(quán)利要求4中所述的蛋白水解活性化合物；(2)至少一種緩沖物質(zhì)，優(yōu)選如權(quán)利要求2中所述的緩沖物質(zhì)；以及(3)至少一種表面活性劑，優(yōu)選如權(quán)利要求2中所述的表面活性劑；和優(yōu)選地，(4)用于實(shí)施步驟(a)的不完全蛋白質(zhì)水解的說明書。
15.如權(quán)利要求14所述的試劑盒，其特征在于，還包括(5)至少一種結(jié)合核酸的物質(zhì)；和任選地(6)用于純化核酸的緩沖液，優(yōu)選結(jié)合和/或洗脫緩沖液。
16.權(quán)利要求14或15所述的試劑盒在分析和/或定量存在于生物樣本中的核酸中的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求14或15所述的試劑盒在使用人或動物體外樣本、與疾病治療的療法和/或監(jiān)視相關(guān)的診斷、預(yù)后、決策中的應(yīng)用。
18.一種從通過交聯(lián)固定的同一生物樣本的溶解組分中獲得的RNA，并從不溶組分中獲得DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟 a )在水緩沖溶液中,對樣本進(jìn)行部分溶解,并使用至少一種蛋白水解活性化合物對樣本中含有蛋白質(zhì)的組分同時進(jìn)行部分蛋白質(zhì)水解，從而獲得溶解組分(組分A)和不溶解殘留物(沉淀物；組分B)，b)將所述溶解組分與所述不溶解殘留物分離， 其中，以所述溶解組分中核酸的總量為基準(zhǔn)，所述溶解組分主要包括RNA，并且以不溶解殘留物中核酸的總量為基準(zhǔn)，所述不溶解殘留物主要包括DNA。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述的主要含有RNA的組分與所述主要含有DNA的組分的分離，既不需要使用有機(jī)溶劑沉淀或抽提一種或兩種類型的核酸，也不需要將一種或兩種類型的核酸與固體基質(zhì)選擇性地結(jié)合。
20.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其特征在于，在組分分離之后，從主要含有RNA的溶解組分中分離RNA，和/或從主要含有DNA的不溶組分中分離DNA。
21.如權(quán)利要求18-20中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，分離之后，丟棄主要含有DNA的不溶組分。
22.如權(quán)利要求18-21中一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括權(quán)利要求1-13 —項(xiàng)或多項(xiàng)中所限定的一個或多個步驟和/或特征。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于從經(jīng)固定的同一生物樣本中平行分離和/或純化RNA和DNA的方法，以及根據(jù)本發(fā)明方法分離的核酸進(jìn)行定量和分析，本發(fā)明還涉及一種用于從經(jīng)固定的樣本中平行分離和/或純化RNA和DNA的試劑盒以及該試劑盒在關(guān)于疾病治療的療法和/或監(jiān)視的診斷、預(yù)后、決策中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/10GK102884191SQ201180010813
公開日2013年1月16日 申請日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
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