專利名稱：用于制備果干的酶預(yù)處理的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備果干的工藝，包括在干燥步驟前將果實(shí)與多聚半乳糖醛酸酶接觸。
背景技術(shù)：
從葡萄轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸迅捎腥齻€主要操作預(yù)處理、干燥和干燥后操作(Food ReviewsInternational,23:257-280, 2007)。預(yù)處理的目的是提高葡萄皮對水分的滲透性。基于蠟質(zhì)層的疏水性質(zhì)，皮充當(dāng)了 保護(hù)屏障。由漿果皮角質(zhì)層的蠟質(zhì)中的這種疏水分子屏障導(dǎo)致的低水分?jǐn)U散性可能會導(dǎo)致費(fèi)時的干燥工藝。已有文獻(xiàn)提出過葡萄干燥工藝中的化學(xué)預(yù)處理。一種常見的實(shí)踐是在預(yù)處理中應(yīng)用油乳膠或稀釋的堿性溶液，其通過減少葡萄表皮的水分轉(zhuǎn)移的阻力和提高內(nèi)部水分的擴(kuò)散系數(shù)來加速干燥過程。常用的稀釋的堿性溶液包括碳酸鉀溶液和氫氧化鈉溶液等(Journal of Food Engineering 39(1999)211-216)。根據(jù)耕作條件，世界不同區(qū)域的葡萄干燥工藝不同。有3種主要方法用來干燥果實(shí)曬干、陰干和機(jī)械干燥。曬干法有幾個不利之處，包括由灰塵和昆蟲傳染導(dǎo)致的環(huán)境污染可能性、降雨引起的物理的微生物性變質(zhì)和由強(qiáng)烈日光照射導(dǎo)致的褪色。對于果干生產(chǎn)，特別是需要高通量時，安全、快速和可控的機(jī)械干燥是有吸引力的。通過曬干或其它干燥技術(shù)生產(chǎn)出干葡萄后，必需將它們輸送到合適的處理單元。根據(jù)干燥方法，干燥后操作可能不同。一般來說，在干燥后操作的過程中，洗滌葡萄干以除去果干表面和小梗上的灰塵；洗滌之后，旋轉(zhuǎn)干燥葡萄干以除去水；然后清潔葡萄干，這包括分開每個葡萄干，除去莖和外來物質(zhì)，和除去不合格的葡萄干；并且最后，使用食品級的油和化學(xué)物質(zhì)來使葡萄干更好看且避免微生物。在干燥后操作之后，葡萄干已準(zhǔn)備好進(jìn)行包裝。JP2004057157描述了干燥后操作之后，對果干進(jìn)行酶處理，所述酶處理造成對味道的修飾。到目前為止，大多數(shù)研究者專注于預(yù)處理和干燥，從而優(yōu)化果干生產(chǎn)工藝以使操作更節(jié)能和有利于環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于果干制備的酶工藝，所述工藝包括在預(yù)處理過程中用多聚半乳糖醛酸酶處理果實(shí)。在本發(fā)明的具體的實(shí)施方案中，所述工藝包括用多聚半乳糖醛酸酶和至少一種選自下組的酶的組合來處理果實(shí)果膠酯酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、￠-葡聚糖酶、淀粉酶和脂肪酶。在本發(fā)明的具體的實(shí)施方案中，所述工藝包括用多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶的組合來處理果實(shí)。在另一具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的酶處理之后是干燥步驟。特別地，本發(fā)明用于生產(chǎn)葡萄干。因?yàn)樯a(chǎn)果干的機(jī)理和工藝是相似的，本發(fā)明可以適用于果實(shí)如葡萄、樓桃番爺、李子/梅子(plum)、杏、酸果蔓(cranberry)、藍(lán)莓和樓桃等來生產(chǎn)它們的果干。本發(fā)明可以在接近中性pH下進(jìn)行，這意味著所述工藝通過減少流出液負(fù)載(effluent load)而對環(huán)境更有利。本發(fā)明處理過的果實(shí)甚至可以在后續(xù)干燥步驟中在相對短的時間內(nèi)達(dá)到最優(yōu)的脫水結(jié)果，這會節(jié)省能量。發(fā)明詳述 葡萄皮結(jié)構(gòu)葡萄的皮由表皮和6到10層小厚壁細(xì)胞組成，在控制干燥過程中起著關(guān)鍵作用。葡萄漿果的皮的層數(shù)、其大小和體積是品種特異的問題。不同來源的葡萄在皮中的層數(shù)上可能有很大不同。外表皮被無生命層覆蓋，所述無生命層即角質(zhì)層、皮孔、蠟質(zhì)和厚角組織下皮細(xì)胞(collenchymatous hypodermal cell)?；谂D質(zhì)層的疏水性質(zhì),皮充當(dāng)?shù)挚拐婢≡w的保護(hù)屏障。它進(jìn)一步減少蒸發(fā)導(dǎo)致的失水并保護(hù)葡萄免于紫外線和物理傷害。皮還控制漿果和周圍環(huán)境的氣體交換。蠟質(zhì)由無定形層和角質(zhì)層內(nèi)蠟質(zhì)二者構(gòu)成，所述無定形層由一系列重疊的疏水小板組成，所述角質(zhì)層內(nèi)蠟質(zhì)存在于外表皮結(jié)構(gòu)中。無定形層只允許水以蒸汽的形式轉(zhuǎn)移。但是，皮的角質(zhì)層中蠟質(zhì)的存在是干燥的障礙，需重點(diǎn)提及的是通過化學(xué)處理來除去蠟質(zhì)以提高干燥速度時，需要特別注意，原因是其對干燥產(chǎn)品貯存期限和安全性的強(qiáng)烈影響。用于制備果干的預(yù)處理工藝文獻(xiàn)一定程度上已經(jīng)提出了葡萄干燥工藝中的化學(xué)預(yù)處理的效果。應(yīng)用油乳膠或堿性溶液的預(yù)處理是一種常見的實(shí)踐，通過減少葡萄表皮對水分轉(zhuǎn)移的阻力和提高內(nèi)部水分的擴(kuò)散系數(shù)來加速干燥過程。常用于預(yù)處理的堿性溶液包括碳酸鉀溶液和氫氧化鈉溶液等，一般pH值大于11。預(yù)處理會導(dǎo)致干燥速度加快，尤其在干燥過程的早期階段?；瘜W(xué)物質(zhì)的組成、濃度、PH和溫度及預(yù)處理時間是皮的各層微結(jié)構(gòu)變化的有效因素。預(yù)處理工藝有關(guān)的物理和化學(xué)現(xiàn)象能繼而影響葡萄干燥參數(shù)。因此，為了生產(chǎn)出在干燥操作后能夠簡單和安全地進(jìn)行加工的產(chǎn)品，控制預(yù)處理和干燥條件是必須的。本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)多聚半乳糖醛酸酶能夠在用于制備果干的預(yù)處理步驟中使用，若需要與至少一種酶組合使用，所述酶包括但不限于果膠酯酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、& -葡聚糖酶、淀粉酶和/或脂肪酶。在本發(fā)明的具體的實(shí)施方案中，所述工藝包含用多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶的組合來處理果實(shí)。本發(fā)明的酶預(yù)處理后可以是干燥步驟。根據(jù)工業(yè)需要，干燥步驟后的最終重量減輕達(dá)到大約70%或甚至更高。進(jìn)一步地，干燥步驟之后可以是干燥后操作，以清潔葡萄干和/或施用食品級的油和化學(xué)物質(zhì)。本發(fā)明的酶預(yù)處理工藝可以在10° 0、15° 5或20° 0以上的溫度進(jìn)行。典型的溫度在 10-80。O、10-70。O、10-60。O、15-50。0,30-50° O、15-40。0、20_40 度進(jìn)、15-30° 0或20-30° 0的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，其在室溫下進(jìn)行。本發(fā)明的酶預(yù)處理工藝可以優(yōu)選在pH 4-8、4-7或5-7的范圍內(nèi)進(jìn)行，更優(yōu)選地是在接近中性的pH，比如pH 5. 5-7,5. 5-6. 5或6_7進(jìn)行。在接近中性的pH下進(jìn)行的處理具有工業(yè)價值，其使預(yù)處理步驟之后處理廢水溶液的過程更簡單。本發(fā)明的反應(yīng)時間應(yīng)該不少于3分鐘，優(yōu)選地不少于5分鐘，更優(yōu)選地不少于10分鐘，并且甚至更優(yōu)選地不少于15分鐘。本發(fā)明的酶處理的合適持續(xù)時間可以從幾分鐘到幾小時，比如從約3分鐘到約48小時，或從約5分鐘到約24小時，或從約5分鐘到約12小時，或從約5分鐘到5小時，優(yōu)選地從約5分鐘到約I小時，更優(yōu)選地從約5分鐘到約30分鐘，更優(yōu)選地從約10分鐘到約30分鐘，甚至更優(yōu)選地約15分鐘到I小時，以及最優(yōu)選地約 20分鐘到約I小時。本發(fā)明的酶應(yīng)該以有效量添加。術(shù)語“有效量”的意思是指和堿性化學(xué)預(yù)處理相t匕，足以產(chǎn)生增強(qiáng)的干燥效果的量。應(yīng)該理解的是，“有效量”會依賴于各種參數(shù)，包括酶的水溶液的濃度，溶液的PH，應(yīng)用溶液的持續(xù)時間，溶液的溫度和葡萄的種類，例如皮的厚度、葡萄體積的大小和其它的果實(shí)特征。本發(fā)明中使用的劑量可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法來決定。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的酶的量不少于待處理果實(shí)的0.5%。(以酶蛋白對果實(shí)重量計(jì)算，即每千克果實(shí)0. 5克酶蛋白)，更優(yōu)選地，大于果實(shí)重量的1%?；?%0。在進(jìn)一步的具體的實(shí)施方案中，酶量在果實(shí)重量的0. 5% _5%、0. 2% _5%、0. 5% _1%、1%0 _1%、2%。-1%、4%。-2%或4%。-1%范圍內(nèi)。這些量指的是下面指示的各種酶的量。酶多聚半乳糖酵酸酶(PG)多聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2. I. 15)催化果膠酸鹽和其它聚半乳糖醛酸中的1，4-a-D-半乳糖艾杜糖醒鍵(1，4-a-D-galactosiduronic linkage)的隨機(jī)水解。其它名稱的實(shí)例為果膠解聚酶；果膠酶；多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶；內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶；和半乳糖醛酸內(nèi)切酶。系統(tǒng)名為多聚(1，4-a-D-半乳糖醛酸酐)聚糖水解酶。酶的來源對于在本發(fā)明方法中的使用并不關(guān)鍵。相應(yīng)地，酶可從任何來源如植物、微生物或動物中獲得。酶優(yōu)選從微生物來源如細(xì)菌或真菌中獲得，比如絲狀真菌或酵母，并且可以通過本領(lǐng)域中通常使用的技術(shù)獲得。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，酶從真菌來源獲得。例如，酶可以從酵母菌株如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓄霉屬(Yarrowia)獲得；或者從絲狀真菌菌株如枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、隱球菌屬(Cyptococcus)、Filibasidium、鐮孢屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、梨孢菌屬(Magnaporthe)、叢梗孢屬(Monilia)、毛霉菌屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、裂裙菌屬(Schizophyllum)、小核菌屬(Sclerotium)、側(cè)孢菌屬(Sporotrichum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭抱殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)或木霉屬(Trichoderma)菌株獲得。在具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的多聚半乳糖醛酶來源于曲霉，特別是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)。優(yōu)選地,根據(jù)US 6，159，718獲得的是多聚半乳糖醒酸酶I、II或III。更優(yōu)選地，所述多聚半乳糖醛酸酶具有與本發(fā)明中SEQ ID NO: I的成熟多肽至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少100%的同一性程度(下文中的“同源多肽”)。在一個優(yōu)選的方面，同源多肽具有取代、缺失和/或缺失一個或多個(或幾個)氨基酸的SEQ ID NO: I的成熟多肽。更優(yōu)選地，多聚半乳糖醛酸酶具有取代、缺失和/或插入至少10、9、8、7、6、5、4、3、2或I個氨基酸的SEQ ID NO: I的成熟多肽。
本發(fā)明中使用的“同一性”參數(shù)描述兩個氨基酸序列之間的相關(guān)性。就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000, Trends in Genetics16:276-277 ；http://emboss, org)(優(yōu)選版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453)來測定的。使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性并且是如下計(jì)算的(相同的殘基XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMB0SS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000,見上；http://emboss, org)(優(yōu)選版本3. 0. 0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970,見上)測定。使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分為10，缺口延伸罰分為0. 5，和EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性并且是如下計(jì)算的(相同的脫氧核糖核苷酸XlOO)/(比對的長度-比對中的缺口總數(shù))此處上下文中描述的序列中的基本同源的多肽的特征為在成熟多肽中具有一個或多個(或幾個)氨基酸取代、缺失和/或插入。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；小缺失，典型的為I到大約9個氨基酸，優(yōu)選地從I到大約15個氨基酸，且最優(yōu)選地從I到大約30個氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至約5到10個殘基的小接頭肽，優(yōu)選地從10到15個殘基，且最優(yōu)選地從20到25個殘基，或通過改變凈電荷或另外的功能來幫助純化的小延伸，比如多聚組氨酸標(biāo)簽，抗原性表位，蛋白質(zhì)A，CBM或其它結(jié)合域。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H. Neuratt^PR. L. Hill, 1979,于TheProteins, Academic Press, New York 中描述。最常發(fā)生的交換是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸分區(qū)誘變(Cunningham和Wells，1989，Science 244:1081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的酶活性以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J. Biol.Chem. 271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物學(xué)相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接 觸位點(diǎn)氨基酸的突變來測定。參見，例如，de Vos等，1992，Science 255:306-312 ;Smith等，1992，J.Mol. Biol. 224:899-904 ；fflodaver 等，1992，F(xiàn)EBS Lett. 309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從分析與親本多肽相關(guān)的多肽的同一丨丨生來推斷。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由 Reidhaar-Olson 和 Sauer, 1988, Science 241:53-57 ；Bowie 和 Sauer,1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-2156 ；W0 95/17413;或 WO 95/22625 公開的那些方法來進(jìn)行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失、和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem. 30:10832-10837 ;美國專利5，223，409 號；W0 92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire 等，1986，Gene 46:145 ；Ner等，1988，DNA 7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999, Nature Biotechnology 17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的多聚半乳糖醛酸酶的量不少于待處理果實(shí)的0.5%。(以酶蛋白對果實(shí)的重量計(jì)算)，更優(yōu)選地，大于果實(shí)的1%?；虼笥?%。。在更進(jìn)一步的具體的實(shí)施方案中，酶量在果實(shí)重量的0. 5% _5%、0. 2% _5%、0. 5% _1%、1%。-1%、2%0 _1%、4%。-2%、或 4%。-1% 范圍內(nèi)。果膠酯酶(PE)果膠酯酶(EC 3. I. I. 11)催化的反應(yīng)為果膠+n水=n甲醇+果膠酸鹽。其它名稱的實(shí)例為果膠脫甲氧基化酶；果膠甲酯酶；和果膠甲基酯酶。系統(tǒng)名為果膠甲酯酶(pectin pectylhydrolase)。來源于棘孢曲霉和大型亞灰樹花菌(Meripilus giganteus)的果膠酯酶分別在W094/25575 和 W097/31102 中描述。在一個具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的果膠酯酶具有與本發(fā)明中的SEQ IDNO: 2的成熟多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、或至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或至少100%同一性程度的氨基酸序列(下文中的"同源多肽")。在一個優(yōu)選的方面，同源多肽具有取代、缺失和/或插入一個或多個(或幾個)氨基酸的SEQ ID NO:2的成熟多肽。更優(yōu)選地，果膠酯酶具有取代、缺失和/或插入10、9、8、
7、6、5、4、3、2或I個氨基酸的SEQ ID NO:2的成熟多肽。在一個具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的果膠酯酶的量不少于待處理果實(shí)的0. 5%0 (以酶蛋白對果實(shí)重量計(jì)算)、更優(yōu)選地，相對于果實(shí)大于1%?；虼笥?%0。在進(jìn)一步的具體的實(shí)施方案中，酶量相對于果實(shí)重量在0. 5%0 _5%、0. 2%0 _5%、0. 5%0 _1%、1%。-1%、2%0 _1%、4%。-2%、或 4%。-1% 的范圍內(nèi)。果膠酸裂合酶
果膠酸裂合酶(EC 4.2.2.2)催化(1，4) - a-D-聚半乳糖醛酸的消除分解(eliminative cleavaeg)得到在其非還原端具有4_脫氧-a -D-半乳糖-4-enuronosyl基(4-deoxy-alpha-D-galact-4_enuronosyl group)的寡糖。其它名稱的實(shí)例為果膠酸反式消去酶(pectate transeliminase);多聚半乳糖醒酸反式消去酶(polygalacturonictranseliminase);和果膠內(nèi)甲基反式消去酶(endopectin methyltranseliminase)。系統(tǒng)名是(1，4)-a-D-聚半乳糖醛酸裂解酶。在一個具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的果膠酸裂合酶來源于芽孢桿菌屬。果膠裂合酶果膠裂合酶(EC 4. 2. 2. 10)催化(1，4) - a -D-聚半乳糖醛酸甲酯的消除裂解得到在其非還原端具有4-脫氧-6-氧-甲基-a -D-半乳糖-4-enuronosyl基的寡糖。果膠裂合酶可能以如下名字為人所知果膠反式消去酶(pectin transeliminase);果膠內(nèi)裂合酶(endo-pectin lyase);多聚甲基半乳糖醒酸反式消去酶(polymethylgalacturonictranseliminase);果膠甲基反式消去酶(pectin methyltranseliminase);果膠溶解酶(pectolyase)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選微生物的果膠裂合酶。微生物果膠裂合酶可以來源于細(xì)菌或真菌(包括絲狀真菌和酵母)。微生物果膠裂合酶優(yōu)選從真菌中獲得。真菌可以是屬于擔(dān)子菌亞門(subdivision Basidiomycotina)或子囊菌亞門(subdivision Ascomycotina)的菌株。合適的實(shí)例包括可來源于曲霉屬菌種菌株的果膠裂合酶。WO 94/21786中描述了一種來源于棘孢曲霉的果膠裂合酶。來源于黑曲霉和米曲霉的菌株的果膠裂合酶是優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的商業(yè)果膠裂合酶組合物是 CITR0ZYM PREMIUM、PECTINEX SMASH XXL、N0V0FERM P 和 N0V0FERM 可從Novozymes A/S 獲得。脂肪酶合適的脂肪酶包括細(xì)菌或真菌來源的。包括化學(xué)或遺傳上修飾的突變體。脂肪酶例如可以是三酰基甘油脂肪酶(EC3. I. I. 3)，磷脂酶A2 (EC 3. I. I. 4)，溶血磷脂酶(EC3. I. I. 5)，甘油一酯脂肪酶(EC 3. I. I. 23)，半乳糖脂肪酶(EC3. I. I. 26)，磷脂酶Al (EC
3.I. I. 32)，脂蛋白脂肪酶(EC 3. I. I. 34)。有用的脂肪酶的實(shí)例包括疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicola Ianuginose)脂肪酶,例如，如在EP 258068和EP 305216中描述的，曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶，例如，如在EP 238023中描述的。其它類型的脂肪分解酶如角質(zhì)酶可能也有用，例如，如在WO88/09367描述的來源于門多薩假單胞菌(Pseudomonas mendocina)的角質(zhì)酶,或來源于豌豆腐皮鐮孢(Fusarium solani pisi)的角質(zhì)酶(例如在WO 90/09446中描述)。特別適用的脂肪酶是如Ml Lipase 、Luma fast 和 Lipomax (Genencor)、Lipolase 和 Lipolase Ultra (可從 Novozymes A/S 獲得)，以及 Lipase P〃Amano〃(AmanoPharmaceutical Co. Ltd.)的脂肪酶。淀粉酶合適可 用的淀粉酶包括例如細(xì)菌或真菌來源的a-淀粉酶(EC 3. 2. I. I)、^ -淀粉酶(EC 3. 2. I. 2)和/或葡糖淀粉酶(EC 3. 2. I. 3)。包括化學(xué)或遺傳修飾的突變體。例如，淀粉酶包括獲得自地衣芽胞桿菌(B. Iicheniformis)的特殊菌株的a-淀粉酶，其在GBl，296，839中有更詳細(xì)的描述。相關(guān)的商業(yè)上可以獲得的淀粉酶包括Natalases\ Stainzyme 1、Duramyl Termamyl'8 ^ TermamyI uItra> Fungamyl* 和+BAN*:(都可從 Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark 獲得)以及Rapidase*和Maxamyf*P (可從 DSM, Holland 獲得)以及Purastar 、Purastar OxAm 和 Powerase (可從 DaniscoA/S獲得)。木葡聚糖酶根據(jù)本發(fā)明，木葡聚糖酶定義為任何對底物木葡聚糖有活性，能夠催化木葡聚糖溶解為木葡聚糖糖寡糖的酶。根據(jù)本發(fā)明木葡聚糖酶優(yōu)選由微生物如真菌或細(xì)菌產(chǎn)生。有用的木葡聚糖酶的實(shí)例是家族12木葡聚糖水解內(nèi)切葡聚糖酶。另一個有用的實(shí)例是由木霉屬(Trichoderma)產(chǎn)生的木葡聚糖酶，特別是EGIII。木葡聚糖酶也可以是具有木葡聚糖酶活性以及對不溶性纖維素的低活性和對可溶性纖維素的高活性的內(nèi)切葡聚糖酶，例如，家族7內(nèi)切葡聚糖酶，可獲得自例如特異腐質(zhì)霉。
實(shí)施例材料和試劑葡萄來源于中國的綠葡萄，來源于中國的紫葡萄(從中國北京的超市購買)化學(xué)物質(zhì)Na2HPO4 12H20、C6H8O7 H2O檸檬酸鹽緩沖液(pH4.0, 50mM) :9. 964g Na2HPO4 12H20 和 4. 656gC6H807 .H2O 溶解于IL去離子水。檸檬酸鹽緩沖液(pH5.5，50mM) :9. 964g Na2HPO4 12H20 和 4. 656gC6H807 .H2O 溶解于IL去離子水(pH值用0. lmol/L NaOH溶液調(diào)整為5. 5)。檸檬酸鹽緩沖液(pH6.5，50mM) :9. 964g Na2HPO4 12H20 和 4. 656gC6H807 .H2O 溶解于IL去離子水(pH值用0. lmol/L NaOH溶液調(diào)整為6. 5)。多聚半乳糖醛酸酶(PG):棘孢曲霉多聚半乳糖醛酸酶，如本發(fā)明中SEQID NO: I的氨基酸40-378的成熟肽所示(根據(jù)US 6，159，718獲得)果膠酯酶(PE):棘孢曲霉果膠酯酶，如本發(fā)明中SEQ ID NO:2的氨基酸18-331的成熟妝所不(UNIPR0T:Q12535,在“Pectin methyl esterase from Aspergillusaculeatus -expression cloning in yeast and characterization of the recombinantenzyme" ；Biochem. J. 319:705-712(1996)中描述)重暈損失測定葡萄通過分析天平稱重并記錄。在酶處理之后，將葡萄干燥并再次稱重。重量損失定義為(處理前重量-處理后重量)/處理前重量。
_0] 實(shí)施例I :用多聚半乳糖醛酸酶預(yù)處理葡萄在下列5個燒杯中加入IOOg葡萄(來源于中國的綠葡萄)。組I :向200ml NaOH濃度為15g/l、溶液pH值為13. 0的NaOH溶液中加入IOOg葡萄。組2 :向200ml檸檬酸鹽緩沖液(pH4. 0，50mM)中加入IOOg葡萄。
組3 :準(zhǔn)備200ml 0. 2% (w/w)的低PG濃度的檸檬酸鹽緩沖液的儲液(pH4. 0，5OmM)。向該溶液中加入IOOg葡萄。組4 :準(zhǔn)備200ml 0. 4% (w/w)的高PG濃度的檸檬酸鹽緩沖液的儲液(pH4. 0，5OmM)。向該溶液中加入IOOg葡萄。將2、3和4組中的葡萄在50° C下浸泡30分鐘。按照工業(yè)葡萄干生產(chǎn)工藝，將組I的葡萄在室溫下浸泡30秒。然后從燒杯中取出所有葡萄，在烘箱中以45° C干燥，并以幾個小時的間隔稱重來測定重量減輕。重量減輕結(jié)果在表I中給出。表I :干燥過程中的重量減輕
重量2小時 4小時 6*1、時 8小時 10小時22小時26小時
M#'- -
"T-3- mM 4w 4 -X-w 4 - . w 4 -￡~ -3E* w 4u 4 -X-
樣品處理物減輕減輕減輕減輕減輕減輕減輕組 I(NaOH) 2.0% 4.5% 6.9% 9.3% 11.1% 22.6% 27.8%#且29.4% 16.8% 22.3% 27.1% 31.5% 50.7% 55.6%
組 3(PG0.2%) 18.0% 27.4% 34.8% 40.8% 45.7% 65.6% 69.5%組 4(PG0.4%) 13.3% 23.8% 31.3% 38.4% 44.1% 65.2% 69.2%對于用多聚半乳糖醛酸酶處理的樣品，在干燥4小時后重量減輕達(dá)到27. 4%和23. 8%，而對于用NaOH處理的葡萄達(dá)到同樣水平的重量減輕花了至少22小時。在26小時的時候，用多聚半乳糖醛酸酶處理的樣品達(dá)到了接近70%的重量減輕，其符合葡萄干生產(chǎn)的重量減輕的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，而用NaOH處理的樣品的重量減輕只有27. 8%。這些結(jié)果表明添加多聚半乳糖醛酸酶可以作為一種取代傳統(tǒng)的用NaOH來預(yù)處理葡萄，同時加速干燥過程的方法。實(shí)施例2 :用多聚半乳糖酵酸酶在不同的DH和溫度預(yù)處理葡萄在下列四個燒杯中加入IOOg葡萄(來源于中國的紫葡萄)。組I :向200ml濃度為15g/l的NaOH溶液中加入IOOg葡萄。組2 :準(zhǔn)備200ml 0. 2%(w/w)的PG濃度的檸檬酸鹽緩沖液的儲液(pH4. 0，50mM)。向該溶液中加入IOOg葡萄。組3 :準(zhǔn)備200ml 0. 2%(w/w)的PG濃度的檸檬酸鹽緩沖液的儲液(pH5. 5，50mM)。向該溶液中加入IOOg葡萄。組4 :準(zhǔn)備200ml 0. 2%(w/w)的PG濃度的檸檬酸鹽緩沖液的儲液(pH6. 5，50mM)。向該溶液中加入IOOg葡萄。將組2中的葡萄在30° C下浸泡30分鐘，將組3和4中的葡萄在50° C下浸泡30分鐘。按照葡萄干生產(chǎn)的工業(yè)過程，將組I的葡萄在室溫下浸泡30秒。然后從燒杯中取出所有葡萄，在烘箱中以45° C干燥，并且以幾個小時的間隔稱重來測定重量減輕。重量減輕結(jié)果在表2中給出。表2 :干燥過程中的重量減輕
權(quán)利要求
1.一種用于果干制備的工藝，該工藝包括用多聚半乳糖醛酸酶處理果實(shí)。
2.權(quán)利要求I的工藝，其中所述工藝包括用多聚半乳糖醛酸酶和至少一種選自下組的酶處理果實(shí)果膠酯酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶和脂肪酶。
3.權(quán)利要求I或2的工藝，其中所述工藝包括用多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶處理果實(shí)。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的工藝，其中所述酶處理之后是干燥步驟。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的工藝，其中所述多聚半乳糖醛酸酶源自曲霉屬(Aspergillus)的菌株，優(yōu)選源自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的菌株。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的工藝，其中所述處理在高于10°C、或15° C或20° C的溫度進(jìn)行。
7.權(quán)利要求6的工藝，其中所述處理在10-80°C、10-70° C、10_60° C、15_50° C、15-40° C,20-40° C、15-30° C 或 20-30° C 范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的工藝，其中所述處理在4-8范圍內(nèi)的pH進(jìn)行。
9.權(quán)利要求8的工藝，其中所述處理在6-7范圍內(nèi)的pH進(jìn)行。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的工藝，其中所述處理以不少于3分鐘的反應(yīng)時間進(jìn)行。
11.權(quán)利要求10的工藝，其中所述處理以3分鐘至48小時、或5分鐘至24小時、或5分鐘至5小時、或5分鐘至I小時、或10至30分鐘范圍內(nèi)的反應(yīng)時間進(jìn)行。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的工藝，其中所述處理以按果實(shí)重量不少于0.5%。的酶劑量進(jìn)行。
13.權(quán)利要求12的工藝，其中所述處理以按果實(shí)重量O.5%。_5%、0. 5%。-1%、1%。_1%或2%o -1%范圍內(nèi)的酶劑量進(jìn)行。
14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的工藝，其中所述果實(shí)選自下組葡萄、櫻桃番茄、李子/梅子、杏、酸果蔓、藍(lán)莓和櫻桃。
15.權(quán)利要求14的工藝，其中所述果實(shí)為葡萄。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于果干制備的工藝，所述工藝包括在干燥步驟前將果實(shí)與多聚半乳糖醛酸酶接觸。多聚半乳糖醛酸酶能進(jìn)一步與果膠酯酶、果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、木葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、淀粉酶和脂肪酶組合使用。
文檔編號A23B7/02GK102762104SQ201180010309
公開日2012年10月31日 申請日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者吳桂芳, 趙娟, 閆愛華, 韓明光 申請人:諾維信公司